Introduction
Siden den første systematiske beskrivelse af biskjoldbruskkirtlerne i mennesker og i flere andre arter af Sandström i 1880 en, forstå betydningen af denne lille endokrine organ for human fysiologi og sygdom har løbende forbedret. Biskjoldbruskkirtlerne udskille parathyroidhormon (PTH), den primære regulator af calciummetabolisme. PTH er også et vigtigt hormon for phosphat homeostase og knogleomsætning 1, 2. Utilsigtet fjernelse eller beskadigelse af parathyroids under hals kirurgi er den mest almindelige årsag til hypoparathyroidisme, en sygdom karakteriseret ved lav blod calcium, lav PTH, og forhøjede fosfor 1.
For bedre undersøgelse erhvervet hypoparathyroidisme og test nye behandlingsformer, pålidelige og let kræves tilgængelige musemodeller. Mus er meget udbredt i forskning, fordi en lang række genetiske værktøjer er envailable i denne art tillader avancerede mekanistiske undersøgelser in vivo. Selv kan anvendes kirurgisk parathyroidektomi (PTX) i rotter 2, 3, 4, 5 og større pattedyr 6, 7, 8, er det teknisk meget udfordrende i mus på grund af den lille størrelse af kirtlerne og deres variable anatomisk fordeling 9. Derfor er thyro-parathyroidektomi (TPTX) udføres typisk i mus, hvor skjoldbruskkirtlen og biskjoldbruskkirtlerne fjernes sammen 10. Men lav skjoldbruskkirtel hormon niveauer er en potentiel confounder i forsøg, komplicerer denne model. Desuden er C-celler i skjoldbruskkirtlen, der producerer calcitonin, et hormon vigtig i calciumhomøostase hos gnavere, også tabt efter fjernelse af thyroids 11.
Adskillige genetiske musemodeller for hypoparathyroidisme findes, som omfatter PTH-null mus 12, GCM2-null mus 13, og Nuf mus med en aktiverende mutation i calcium-sensing receptor (CASR) 14, 15. Men disse genetiske defekter allerede er til stede under fosterudviklingen, og funktionen af parathyroids derfor allerede svækket under embryogenese. Dette kan påvirke udviklingen af organer såsom skelettet. Dette står i kontrast med patienter med postsurgical hypoparathyroidisme der erhverver sygdommen senere i livet. Endvidere er nogle af disse musemodeller udviser tidlig letalitet og reduceret fertilitet, hvilket yderligere komplicerer deres anvendelse 12, 13, 14.
Vi udviklede to nye mus models for erhvervet hypoparathyroidisme. Brug af genetisk modificerede mus som udtrykker GFP specifikt i parathyroids tillader biskjoldbruskkirtlerne let at identificere for kirurgisk fjernelse uden at fjerne skjoldbruskkirtlen. Denne mus blev dannet ved at krydse PTH-Cre mus, som udtrykker Cre-rekombinase under kontrol af den 5,5 kb PTH promotor 16 med ROSA mTmG musen. De resulterende PTHcre; mTmG mus udtrykker grønt fluorescerende protein specifikt i parathyroidea-celler. Den anden musemodel bruger samme PTH-Cre, denne gang for at fjerne en STOP-kassette fra den inducerbare DTR mus, hvilket resulterer i ekspression af difteritoxin receptoren specifikt i parathyroids. Systemisk administration af DT ødelægger parathyroidea celler, hvilket gør dyrene hypoparathyroid uden kirurgi.
De to musemodeller præsenteres i dette studie viser en stabil hypocalcemiske fænotype over tre måneders observation period. Procedurerne er let at udføre, fænotypen er reproducerbar, og de hypoparathyroid mus udviser en høj overlevelsesprocent 17.
Protocol
Denne undersøgelse er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i Massachusetts General Hospital. Opnå passende institutionel godkendelse til dette dyr undersøgelse, før du begynder. Nogle teknikker måske nødt til at blive justeret i henhold til lokale IACUC krav.
1. GFP-PTX mus
- Opnå PTHcre + mus og Rosa-mTmG mus ved 8 - 10 uger til videre parring.
- Tilbagekrydsning de PTHcre + mus (blandede 129; FVB baggrund) med C57BL / 6-mus til 6 generationer for at opnå mus med C57BL / 6 baggrund.
- Indavl PTHcre + mus til opnåelse PTHcre + / + mus 17.
BEMÆRK: For at udføre genotypebestemmelse, udtrække DNA fra spidsen af halen og bruge det til PCR. PCR-primerne for at kontrollere for heterozygositet og homozygoti af PTHcre transgenet er som følger: forward primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, revers primer A ', TCAGATCACACCACACAGCA, forward primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, revers primer B ', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. - Cross PTHcre + / + mus 16 med Rosa-mTmG mus 18. Vænne PTHcre; mTmG hvalpe når 4 uger gammel.
- Bedøver 8 - 10 uger PTHcre; mTmG mus ved ip injektion af tribromethanol (Avertin) ved 0,6 mg / g legemsvægt, eller andre midler, såsom ketamin / xylazin. Brug buprenorphin 0,1 mg / kg sc hver 12 timer som et analgetikum i 48 timer efter kirurgi ifølge en godkendt protokol. Sikre passende dybde af anæstesi ved tåen knivspids tilbagetrækning refleks eller andre midler. Sende dyret i liggende stilling.
- Udvid og forberede den ventrale hals regionen ved barbering huden ved hjælp af en enkelt kant klinger. Desinficer den barberede hud med en povidon jod antiseptisk pad.
- Dæk dyret med sterile kirurgiske afdækningsstykker til at reducere kontaminering af det kirurgiske sted og bruge autoklaveret microsurgical instrumenter til den kirurgiske procedure.
- Skær en 2 cm langsgående snit i huden med en kirurgisk skalpel. Dissekere fascia og skub spytkirtlerne til siden ved stump dissektion med buede savtakkede pincet.
- Under dissektion mikroskop hjælp halogen lys og en 4 - 5X forstørrelse, klippe og adskille paratracheal muskler ved hjælp af skarpe pincet tips og eksponere luftrøret.
- Identificer skjoldbruskkirtlen med højre og venstre lap placeret ved siden af luftrøret.
- Skift lyskilden til fluorescerende lys og visualisere de to grønne-fluorescerende biskjoldbruskkirtlerne.
BEMÆRK: Typisk er de to biskjoldbruskkirtlerne placeret ved eller nær overfladen af skjoldbruskkirtel, men lejlighedsvis, er de placeret længere væk. - Fjern forsigtigt de grønne biskjoldbruskkirtlerne bruger kirurgiske pincet og saks. Brug steril gaze for hæmostase og nøje kontrollere langs luftrøret for at sikre, at alle grønne væv er blevet fjernet. Luk paratracheal muskler ved afbrudt sutur hjælp 6-0 polyglactin 910 suturer. Luk huden indsnit ved Halsted sutur hjælp 6-0 polyglactin 910 suturer.
- Valgfrit: Injicer 10 uL / g legemsvægt sterilt normalt 0,9% natriumchloridopløsning til musene for fluid udskiftning.
- Placer postkirurgiske dyr til en separat bur på en varm inkubator (37 ° C) i kropstemperatur genopretning. Når musene er vågen og i den liggende stilling, løber pellet chow og vand med lidt gelatine fødevarer på burets gulv.
- Efter en postoperativ observation periode på 2 timer, returnere musen til dyret facilitet og følg lokale krav til postoperativ pleje.
- 3 dage efter parathyroidektomi, opnå 10 pi hale blod og måle blod ioniseret Ca ++ ved anvendelse af en analysator, såsom blod gassystemet Ca ++ / pH analysator. Succesfulde parathyroidektomi resulterer i blod ioniseret Ca ++ lig med eller lavere end -2SD af sham-opererede conkontrolsystemer mus (1,20 mmol / L i vores eksperimenter af n = 30).
2. PTH-Cre-iDTR mus
- Anskaf PTHcre + og DTR fl / fl mus ved 8 - 10 uger til parring.
- Tilbagekrydsning de PTHcre mus (blandede 129; FVB baggrund) med C57BL / 6-mus til 6 generationer for at opnå mus med C57BL / 6 baggrund.
- Indavl den PTHcre + (C57BL / 6 baggrund) mus til opnåelse PTHcre + / + mus 17.
BEMÆRK: For at udføre genotypning, DNA fra mus hale tip blev ekstraheret og anvendt til PCR. Genotypebestemmelsesprimere: forward primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, reverse primer A ', TCAGATCACACCACACAGCA, frem primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, revers primer B', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. - Mate PTHcre + / + mus 16 med DTR fl / fl mus 19 for at få PTHcre-iDTR mus.
- Forbered DT ved at fortynde diphtheriet toksin pulver med sterilt saltvand til en koncentration på 0,5 ug / mL. Sterile filter, og gemme portioner ved -80 ° C.
- Vælg 8 - 10 uger gamle PTHcre-iDTR mus til injektion eksperiment. Thaw DT alikvot til stuetemperatur, administrere DT intraperitonealt ved 5 ug / kg (10 uL / g) legemsvægt af dyret. For maksimal effektivitet og mindst toksicitet, er DT administration gentages i alt 2 injektioner i en 3-dages interval 17.
- 3 dage efter den anden injektion, tage 10 uL hale blod fra hver PTHcre-iDTR / PTHcre-iDTR-mTmG mus og måle blodets Ca ++ ved hjælp af en Blood Gas System Ca ++ / pH analysator.
BEMÆRK: Vi definerer mus med blod ioniseret Ca ++ lavere end 1,18 mmol / l som hypoparathyroid mus, hvilket svarer 2SD under middelværdien af køretøjers-injicerede kontrolmus (n = 22).
Representative Results
Placering af biskjoldbruskkirtlerne
Først indspillede vi fordelingen af biskjoldbruskkirtlerne af 54 PTHcre-mTmG mus som observeret under fluorescerende dissektion mikroskop. 74% (40/54) mus havde to grønne biskjoldbruskkirtlerne (figur 1A, C, E), 26% (14/54) mus havde en yderligere tredje parathyroidkirtlen (figur 1B, D, F). Ingen mus med en enkelt kirtel eller mere end tre kirtler blev observeret. Sædvanligvis blev biskjoldbruskkirtlerne placeret nær den øvre grænse af skjoldbruskkirtlen (58%, 71/122, figur 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) kirtler var placeret nær den nedre grænse af skjoldbruskkirtlen (figur 1C (1), D (3), F (1)), og 13% (16/122) blev placeret væk fra thyroid kirtel (figur 1B (3), E (1), F (2)). Vores resultater er i overensstemmelse med og udvide tidligere resultater af varierende placeringer af biskjoldbruskkirtlerne 20.
GFP-PTX mus
Hele operationen fra anæstesi til at lukke huden snit tog ca 20 min per mus. Overlevelsesraten for postkirurgiske mus over en 3-måneders observationsperiode var 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) GFP-PTX mus udstillet ioniseret calcium niveauer, der var 2 SD under middelværdien af skinopererede kontrol mus eller lavere. Den hypoparathyroid fænotype i GFP-PTX-mus (hypokalcæmi, lav PTH og forhøjet serum fosfat) var stabil i hele observationstid på 3 måneder. Vigtigere, skjoldbruskkirtel funktion var ikke forskellig fra sham-opererede dyr 3 måneder efter operationen (TSH = 42 ± 24 vs. 30 ± 15 mU / L, p = 0,171; T4 = 3.0 ± 0,6 vs. 3,1 ± 0,9 ug / dl, p = 0,707 (figur 2).
PTH-cre-iDTR Mus
DT injicerede PTH-Cre-iDTR mus udviklede hypoparathyroidisme (lav blod ioniseret calcium, forhøjet blod fosfor, og uhensigtsmæssigt lavt normale PTH-niveauet). Vi har tidligere rapporteret, at nogle få PTH positive celler undslippe ablation af difteritoxin, der forklarer den målbare cirkulerende PTH og derfor noget mildere fænotype af disse mus 17.
Hypoparathyreoidisme i GFP-PTX Mus og PTH-cre-iDTR mus
Betydelige reduktioner af blod Ca ++ og serum PTH niveauer blev observeret i GFP-PTX-mus 3 dage efter operationen, i forhold til niveauer, der findes i skinopererede mus (Ca ++ = 1,05 ± 0,40 vs. (figur 3A, genoptrykt med tilladelse fra (henvisning # 17)). Efter 2 injektioner af 5 ug / kg DT ved 3 dages mellemrum, en dosis og regimen optimeret til at anvende den mindste mængde af DT for at give den maksimale hypoparathyroid fænotype, DT injicerede PTH-Cre-iDTR mus udviste signifikant hypocalcæmi og reduceret PTH sammenlignet med køretøj kontrolmus, som fortsatte over 90 dage observationsperioden (Ca ++ = 1,10 ± 0,07 mmol / l vs. 1,26 ± 0,05 mmol / l, p <0,05; PTH = 218 ± 156 pg / ml vs. 572 ± 164 pg / ml, p <0,05) (figur 3B, genoptrykt med tilladelse fra (anmodning # 17)).
Figur 1:
Figur 2: TSH og T4 niveau af GFP-PTX mus. 3 måneder efter GFP-PTX blev serum opnået for TSH og T4 measurem enser. GFP-PTX mus viste TSH koncentrationer (42 ± 24 mU / L) (A) og T4 koncentrationer (3,0 ± 0,6 ug / dl) (B), der ikke var forskellige fra kontrolmus (TSH = 30 ± 15 mU / L, P = 0,171, n = 11, T4 = 3,1 ± 0,9, p = 0,707, n = 11). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Blood Ca ++ og PTH-niveauet i GFP-PTX Mus og DT injicerede PTH-Cre-iDTR mus. Begge GFP-PTX mus (A) og DT injicerede PTH-Cre-iDTR mus (B) udviste stabil hypocalcæmi og reducerede PTH-niveauet i løbet af tre måneder observationsperiode (N = 6 - 8, *** p <0,001) (re-trykt med tilladelse fra henvisning # 17).es / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi demonstrerer teknikken med GFP-styrede parathyroidektomi hjælp transgene mus med GFP udtryk selektivt i biskjoldbruskkirtlerne. I PTHcre, mTmG mus, dobbelt fluorescens (den grønne GFP i Cre-udtrykte celler og rød tomat i ikke-Cre udtrykte celler) gjort os i stand til klart at identificere og præcist fjerne alle biskjoldbruskkirtlerne uden at fjerne skjoldbruskkirtel. Mens vi foretrækker brugen af dobbelt-fluorescens mTmG mus for evnen til at identificere fluorescerende rød ikke-parathyroidea væv, bør vores fremgangsmåde også arbejde godt bruge en enkelt fluorescerende dyr som tomat rød (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) mus. Proceduren er forholdsvis let at udføre, kræver omkring 20 min per mus, og resulterer i en alvorlig og vedvarende hypoparathyroid fænotype.
Desuden er en anden fordel af GFP-positive biskjoldbruskkirtlerne er den lethed for påvisning af afvigende biskjoldbruskkirtlerne. Vores undersøgelser viser,mislocalization af parathyroids i ca. en fjerdedel af B6 mus (figur 1), som let detekteret i vores musemodel af grøn fluorescens. I modsætning til thyro-parathyroidektomi, vores teknik undgår fjernelse af skjoldbruskkirtlen med efterfølgende behov for skjoldbruskkirtelhormon og det ukendte virkning af fjernelse af calcitonin-producerende skjoldbruskkirtel C-celler. Fluorescensmærkede biskjoldbruskkirtlerne kunne også anvendes til andre undersøgelser, der kræver isolering af biskjoldbruskkirtlerne. Begrænsningen af denne model omfatter kravet til operation. Grundlæggende mikrokirurgi færdigheder og en dissektion mikroskop med en fluorescerende lyskilde er påkrævet.
En anden teknik til generering hypoparathyroid mus, der eliminerer behovet for kirurgi er dokumenteret. Difteritoksinproducerende behandlet PTHcre-iDTR mus udviser en mildere hypoparathyroidisme fænotype, men blot kræver indsprøjtning DT intraperitonealt i musen. Den kritiske del for generere denne model blev optimering af dosis og dosering. Høje doser af DT medførte toksicitet, men lave doser faldt effektiviteten af fremgangsmåden. Vi bestemt, at dosis regiment af 2 injektioner med 5 ug / kg, administreret 3 dage fra hinanden, resulterede i pålidelig og stabil hypocalcæmi uden / minimal dødelighed.
I sidste ende håber vi, at disse to tilgange giver nyttige musemodeller for erhvervet hypoparathyreoidisme. Ved hjælp af en hidtil ukendt langtidsvirkende PTH, rapporterede vi den første anvendelse af begge disse modeller til bestemmelse af effektiviteten af nye lægemidler til hypoparathyroidisme 17.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R01-DK100584 og Kina State Key Laboratory af orale sygdomme Open Funding SKLOD2015OF01 (RB). Vi takker Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, og Kelly Lauter om hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
| PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
| iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
| 6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
| Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
| Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
| Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
| 0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
| 1 mL 29 G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
| Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
| Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
| Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
| 2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
| Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1 mg/mL as the stock solution in -80 °C |
| Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
| RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |
References
- Brandi, M. L., Brown, E. M. Hypoparathyroidism. , Springer. (2015).
- van Abel, M. Coordinated control of renal Ca(2+) transport proteins by parathyroid hormone. Kidney Int. 68, 1708-1721 (2005).
- Sebastian, E. M., Suva, L. J., Friedman, P. A. Differential effects of intermittent PTH(1-34) and PTH(7-34) on bone microarchitecture and aortic calcification in experimental renal failure. Bone. 43, 1022-1030 (2008).
- Rodriguez-Ortiz, M. E. Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23. J Am Soc Nephrol. 23, 1190-1197 (2012).
- Liao, H. W. Relationship between Fibroblast Growth Factor 23 and Biochemical and Bone Histomorphometric Alterations in a Chronic Kidney Disease Rat Model Undergoing Parathyroidectomy. PloS one. 10, e0133278 (2015).
- Fox, J., Care, A. D. Effect of low calcium and low phosphorus diets on the intestinal absorption of water in intact and parathyroidectomized pigs. Calcif Tissue Int. 31, 253-255 (1980).
- Finco, D. R., Brown, S. A., Ferguson, D. C., Crowell, W. A. Selective parathyroidectomy of the dog. Can J Vet Res. 57, 288-292 (1993).
- Can, I. Parathyroid allotransplantation in rabbits without cultivation. Int J Clin Exp Med. 7, 280-284 (2014).
- Dunn, T. B. Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice. j Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).
- CRIVER. , Available from: http://www.criver.com/products-services/basic-research/rodent-surgery/soft-tissue-procedures (2010).
- Sakai, A. Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice. J Bone Miner Metab. 23, 8-14 (2005).
- Miao, D. Skeletal abnormalities in Pth-null mice are influenced by dietary calcium. Endocrinology. 145, 2046-2053 (2004).
- Gunther, T. Genetic ablation of parathyroid glands reveals another source of parathyroid hormone. Nature. 406, 199-203 (2000).
- Hough, T. A. Activating calcium-sensing receptor mutation in the mouse is associated with cataracts and ectopic calcification. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13566-13571 (2004).
- Hannan, F. M. The Calcilytic Agent NPS 2143 Rectifies Hypocalcemia in a Mouse Model With an Activating Calcium-Sensing Receptor (CaSR) Mutation: Relevance to Autosomal Dominant Hypocalcemia Type 1 (ADH1). Endocrinology. 156, 3114-3121 (2015).
- Libutti, S. K. Parathyroid gland-specific deletion of the mouse Men1 gene results in parathyroid neoplasia and hypercalcemic hyperparathyroidism. Cancer Res. 63, 8022-8028 (2003).
- Bi, R. Diphtheria Toxin- and GFP-Based Mouse Models of Acquired Hypoparathyroidism and Treatment with a Long-Acting Parathyroid Hormone Analog. J Bone Miner Res. , (2015).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Buch, T. A Cre-inducible diphtheria toxin receptor mediates cell lineage ablation after toxin administration. Nat Methods. 2, 419-426 (2005).
- Dunn, T. B. Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice. J Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).
