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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

inoculant Published: January 12, 2017 doi: 10.3791/55013
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2, 1
1Laboratoire d'écologie et d'épidémioloigie parasitaire, Institut de biologie, Université de Neuchâtel, 2Merkle Lab, Department of Entomology, Pennsylvania State University

Abstract

La stimulation de la réponse immunitaire est un outil commun dans les études d'invertébrés afin d'examiner l'efficacité et les mécanismes de l'immunité. Cette stimulation est basée sur l'injection de particules non pathogènes dans les insectes, les particules seront détectés par le système immunitaire et induisent la production d'effecteurs immunitaires. Nous nous concentrons ici sur la stimulation de la réponse de la mélanisation chez le moustique Anopheles gambiae. Les résultats de la réponse de la mélanisation dans l'encapsulation de particules étrangères et les parasites avec une couche sombre de la mélanine. Pour stimuler cette réponse, les moustiques sont inoculées avec des billes dans la cavité thoracique à l'aide de tubes en verre microcapillaire. Puis, après 24 h, les moustiques sont disséquées pour récupérer les perles. Le degré de la mélanisation de la bille est mesurée en utilisant un logiciel d'analyse d'image. Perles ne possèdent pas les effets pathogènes des parasites, ou leur capacité à se soustraire ou suppriment la réponse immunitaire. Ces injections sont un moyen de mesure efficacité immunitaire et l'impact des stimulations immunitaires sur d'autres traits d'histoire de vie, tels que la fécondité ou la longévité. Il est pas exactement le même que l'étude directe des interactions hôte-parasite, mais il est un outil intéressant pour étudier l'immunité et de son écologie évolutive.

Introduction

Les insectes se fondent sur les réponses immunitaires pour se protéger contre les parasites et les agents pathogènes 1 - 3 tout abus par leur cuticule ou leur intestin épithélium 4. Dans les moustiques, ces réponses sont efficaces contre les bactéries, les virus 5 6, les nématodes filariens 7, et les parasites du paludisme 1,8,9. Dans les moustiques, une réponse immunitaire clé est l'encapsulation des particules étrangères avec la mélanine 10-12. Cette encapsulation peut se produire dans l'intestin ou dans le système de circulation hémolymphe 10-12. Cette réponse de mélanisation est le résultat de la pro-phenoloxidase cascade 10-12, et elle peut conduire à la mort des parasites ou à leur phagocytose. Dans les moustiques adultes, où le nombre de cellules hémocytes est limitée, mélanisation est une réponse humorale, comme contre les parasites Plasmodium ou nématodes filariens 7.Dans d'autres insectes, il est directement les cellules hémocytes qui se rassemblent autour du parasite pour les 7 melanize. En outre, la mélanine est également essentielle pour plusieurs autres processus physiologiques comme la production d'œufs et les plaies de la cuticule guérison 7.

La stimulation de la réponse immunitaire est utilisé comme un outil pour étudier l' immunité des insectes dans plusieurs systèmes modèles de santé publique agricole et 13 - 18. Il est utilisé dans Anopheles gambiae moustiques, le principal vecteur du paludisme en Afrique, pour étudier les interactions hôte-parasite 14 - 16,19. Ces techniques sont basées sur la capacité des insectes pour détecter des parasites avec leurs récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) 2. Les moustiques peuvent également détecter d'autres molécules interférant avec leur biologie tels que les motifs moléculaires associés à des pathogènes (PAMP), ou de détecter leurs propres cellules endommagées en raison de la libération de collagène et d'acides nucléiques. La cellule immunitaire contre les moustiquess tels que les hémocytes sont utilisés pour la détection 20 - 23. Les principales voies de signalisation immunitaires sont Imd, Toll, JAK / STAT 24, et l' interférence de l' acide ribonucléique (ARNi) 25,26. Les deux voies Toll et Imd influencent la réponse de mélanisation et d' interagir avec le pro-phenoloxidase cascade 10-12.

L'outil standard utilisé pour stimuler la réponse de la mélanisation est l'inoculation d'un moustique avec une petite perle dans l'hémolymphe de la cavité thoracique. Le degré de mélanine encapsulation peut ensuite être mesurée 19 après avoir récupéré la perle à travers la dissection du moustique. Dans la plupart des études, une seule perle a été injecté par les moustiques 15,16,27, mais injectant plus de perles est possible afin d'étudier les limites de la réponse de la mélanisation 19. Ces billes sont injectées à l'aide d'une solution d'injection (sérum physiologique) afin de limiter la perturbation de la physiologie du moustique etla dessiccation du moustique 15,16,27. Un colorant est ajouté à cette solution pour faciliter la sélection de perles. Il en est de même pour la solution de dissection utilisé pour récupérer la 15,16,27 de billes.

L'avantage de inoculant insectes avec des stimuli non-pathogène est la capacité de se concentrer sur l'effet direct sur la réponse immunitaire. Il n'y a pas d' effets de complication due à parasite pathogénicité 28, immunosuppression 29-31, ou l' évasion immunitaire 31-34. En outre, les conséquences des stimulations sur d'autres traits d'histoire de vie, tels que la longévité ou la fécondité, peuvent également être étudiés. Ainsi, les chercheurs qui étudient l' écologie évolutive peuvent exiger de tels outils 2,35,36. Par exemple, les bourdons immunodéprimés contesté ont une durée de vie raccourcie sous la famine. effets négatifs similaires de stimulations immunitaires et les déploiements ont été observés dans différents modèles d'invertébrés, ce qui entraîne souvent une courteer la durée de vie ou moins de succès en matière de reproduction 13,27,37. De telles études peuvent être menées dans des environnements différents 2,4,38. Stimuler l' immunité est également d'intérêt pour ceux qui se concentrent directement sur immunopathologie 39,40.

Ce protocole est basé sur l'inoculation de perles avec des moustiques pour stimuler la réponse de la mélanisation et de mesurer directement la quantité de mélanine. Cela permet à l'étude quantitative et qualitative de la réponse mélanisation dans différents contextes expérimentaux. Un tel outil peut être étendue à la stimulation d'autres réponses immunes, telles que la réponse anti - bactérienne à des bactéries 41 tuées par la chaleur. Elle peut également être réalisée dans de nombreux contextes écologiques.

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Protocol

1. Solution saline pour préparation injectable et Dissection

  1. Préparer la solution saline en y ajoutant du NaCl, KCl et CaCl 2 dans l'eau distillée pour obtenir 1,3 mM de NaCl, 0,5 mM de KCl et 0,2 mM de CaCl2 à pH = 6,8.
  2. Ajouter 1 ml de solution de vert de méthyle 0,1% à 99 millilitres de la solution saline pour colorer les perles transparentes. Ceci est le vert de méthyle "solution d'injection" de 0,001%.
  3. Ensuite, ajouter 5 ml de solution verte 0,1% de méthyle à 45 ml de la solution saline. Ce verte de méthyle «solution de dissection" 0,01% est 10 fois plus concentrée dans le vert de méthyle, pour faciliter la coloration des perles et leur observation au cours de la dissection.
    NOTE: Filtre stériliser le tampon si nécessaire.

2. Capillaire Préparation

  1. Tubes de verre microcapillaire Heat-pull pour obtenir une pointe très fine légèrement plus grand que les plus petites perles (φ = 40 pm) 42.
  2. Ouvrir etÉGLEZ chaque capillaire en brisant la pointe avec des pincettes ou par sciage la pointe off.

3. Mosquito cabrer

  1. A. gambiae arrière à 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% d' humidité relative, et une lumière 12:12 h: cycle d' obscurité. Gardez les femelles adultes et de leur donner accès à une solution de sucre de 10%.

4. Sélections perles avec le Capillaire

  1. Verser 0,009 g de billes chargées négativement (de 40 à 120 um de diamètre) dans une boîte de Petri de 5 cm et ajouter 5 ml de solution d'injection 30 min à l'avance.
    NOTE: Le but est de laisser le colorant colore les perles pour faire la sélection de perles pour une injection plus facile. Autoclave perles si elles ne viennent pas dans un bocal stérile.
  2. À l'aide d'un capillaire monté dans une ampoule capillaire de pipette, sélectionner visuellement la plus petite perle de 0,1 ul de la solution saline sous un microscope binoculaire.
    NOTE: Lorsque inoculer plusieurs billes simultanément, sélectionnez trois perles d'un volume total de 0,1 ul.

5. Mosquito Manipulation et Inoculation

  1. À l'aide d'un aspirateur d'insectes, placer chaque moustique dans un tube de 50 ml.
  2. Réfrigérer chaque moustique brièvement en plaçant le tube dans la glace pilée (2-5 min).
  3. Placez un moustique sur son côté droit sous le microscope binoculaire.
  4. Sous un stéréomicroscope, inoculer le moustique avec le capillaire en perçant fermement par le côté gauche de la cavité thoracique cuticule, puis à injecter le liquide et le bourrelet.
    REMARQUE: Prenez soin de ne pas endommager les muscles de vol en tenant le capillaire que perpendiculairement à la moustiques que possible.
  5. Retirez le capillaire.
  6. En utilisant des pinces d'entomologie poids plume, placez chaque femelle individuellement dans une tasse en plastique de 180 ml recouvert d'une moustiquaire; leur donner accès à une solution de sucre de 10%.
    NOTE: La prudence est nécessaire avec la solution de sucre, comme le moustique peut se coincer sur les gouttes de la solution de sucre.

6. MosquitoDissection et Perle Photographie

  1. Vérifiez si les moustiques sont vivants 24 heures après l'inoculation. Si oui, vérifier leur état et ne garder que les moustiques qui sont capables de voler.
  2. Congeler ces moustiques à -20 ° C.
    NOTE: Ils peuvent être conservés plusieurs jours à plusieurs mois avant la dissection, si nécessaire.
  3. Retirer les ailes des moustiques à l'aide de pinces sous un microscope binoculaire à 32X grossissement. Fixer les ailes sur des lames de verre avec du ruban adhésif transparent. Notez le code utilisé pour chaque moustique individuel.
  4. Mettez les lames de verre dans un scanner et les numériser à 1200 dpi.
    REMARQUE: Vérifiez que le code est lisible pour chaque moustique individuel.
  5. Sur une lame de microscope en verre et en solution de dissection, utiliser une pince pour séparer le thorax de la tête et l'abdomen.
  6. Ouvrez le thorax avec une pince pour récupérer les perles.
    REMARQUE: Les perles qui ne se déplace pas vers l'abdomen ne sont pas en contact les uns avec les autres et la plupart d'entre elles flottent librement en til hémolymphe. Veillez à ne pas rompre le cordon avec la pince, comme un bourrelet non-mélanisée peut être difficile à trouver. Attendez 1 à 5 min pour les billes pour obtenir la couleur.
  7. Transférer les perles dans une gouttelette de solution de dissection sur une lame de microscope en verre, avant de prendre la photo.
    NOTE: Pas besoin de laver les billes.
  8. En utilisant un microscope équipé d'une caméra, prendre une image numérique de chaque bourrelet à un réglage de l'éclairage standard et 400X.
    REMARQUE: Ne pas modifier l'éclairage entre les différentes images pour permettre leur comparaison.

7. Analyse Photo: Bead mélanisation

  1. Ouvrez le logiciel d'analyse d'image. Cliquez sur "Fichier" puis sur "ouvrir" pour trouver une image de perles.
  2. Cliquez sur "analyser". Cliquez sur "des mesures prévues." Cochez la case "valeur moyenne grise" dans la fenêtre "mesures fixes".
  3. Cliquez sur l'icône de l'outil de sélection de cercle. Sélectionnez le périmètre de perles; rester danscôté le bourrelet et éviter le halo lumineux autour de lui.
  4. Cliquez sur le menu "analyser". Cliquez sur "mesure". Obtenir la valeur de gris moyenne et la taille de la surface en coupe transversale du bourrelet.
    1. Pour obtenir la valeur de mélanisation de chaque perle, effectuer l'opération suivante à l'aide d'une calculatrice ou d'une calculatrice logiciel: "256 - valeur moyenne gris." La mesure de mélanisation est une valeur comprise entre 0 et 256, 0 représentant une image totalement blanche.

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Representative Results

Les moustiques ne melanize pas toutes les perles de la même façon, comme certaines perles ont été recouvertes de moins de mélanine que les autres (figure 1). En effet, quelques perles sont restées bleu à cause d'un manque de mélanisation, tandis que d' autres étaient complètement sombre (Figure 1). La valeur de la mélanisation a été normalisée par interpolation linéaire à une valeur comprise entre 0 ( ce qui correspond à un cordon bleu et unmelanized) et 100 (correspondant à un bourrelet très sombre et mélanisée) (figure 2a et 2b). Ces valeurs indiquent le degré de mélanisation des bourrelets et, par conséquent, la force de la réponse immunitaire.

Nous pouvons comparer perles les unes aux autres en comparant leurs valeurs de mélanisation. La réponse de la mélanisation suit généralement une distribution gaussienne, ce qui permet des analyses statistiques classiques comme ANOVA ou glm gaussien.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Nous avons étudié la variation de la réponse de la mélanisation par rapport au nombre de billes inoculés simultanément dans un moustique L'objectif était d'acquérir une meilleure compréhension de la variabilité et les limites de. la réponse de la mélanisation. la taille de la bille n'a pas eu d'effet.

La valeur moyenne perle de mélanisation a diminué de 71 à 50 lorsque le nombre de billes inoculées augmenté (F igure 2). Il y a quelques limites de la réponse de la mélanisation dans un moustique lorsque le défi immunitaire augmente. En outre, la réponse de la mélanisation a diminué pour le bourrelet moins mélanisée dans chaque moustique, 71-35 pour une à trois billes, respectivement. Cependant, la valeur de la mélanisation du bourrelet le plus fortement mélanisés est restée à peu près constante. La variabilité de la mélanisation augmente avec le nombre de billes. L'effort de mélanisation n'a pas été uniforme entre tous les perles dans un moustique donné,comme une perle a été la priorité sur les autres. Cette technique d'injection est utile pour étudier la variabilité des réponses immunitaires chez les moustiques.

Figure 1
Figure 1: Exemples d'image d'un non-mélanisée, une partie mélanisée, et un bourrelet très mélanisée après dissection. Sur la gauche, au milieu et à droite sont une perle non-mélanisée, un bourrelet partiellement mélanisée, et un bourrelet très mélanisée, respectivement.

Figure 2
Figure 2: perle mélanisation en fonction du nombre de billes inoculées. (A) Chaque point montre la mélanisation d'un seul bourrelet (avec des valeurs de mélanisation allant de 0 pour les billes non-mélanisées à 100 pour ceux fortement mélanisés) et chaque colonne de points représentent un moustique individuel. Chaque Mosquito a été inoculé avec un, deux ou trois billes. Les points solides représentent la valeur la plus élevée par mélanisation moustiques, les points croisés représentent la valeur de mélanisation intermédiaire, et les points vides représentent la valeur de mélanisation plus bas. Les lignes pleines représentent la moyenne mélanisation par traitement de talon, les lignes en pointillés représentent la moyenne la plus élevée mélanisation, et les lignes en pointillé indiquent la moyenne de la mélanisation le plus bas. (B) Moyenne et erreur standard de la mélanisation, la plus haute mélanisation et la mélanisation le plus bas par traitement d'inoculation de perles. Le noir représente la perle mélanisation moyenne en fonction du nombre de billes (avec des valeurs allant de 0 mélanisation à billes non mélanisées à 100 pour les très mélanisés). Le point rouge représente la moyenne de la plus haute mélanisation. Le triangle bleu représente la moyenne de la mélanisation plus bas. Les barres sont les erreurs standard. Modifié de référence 19. </ P>

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Discussion

Cette technique d'injection est utile pour stimuler et étudier la réponse de mélanisation chez les moustiques. Par exemple, ici, nous avons étudié l'effet de la charge stimuli immunitaire.

L'étape critique dans cette procédure consiste à inoculer correctement le moustique. Tous les dommages excessifs aux muscles de vol ou le moustique lui-même peut empêcher le moustique de l'alimentation ou peut le tuer avant la dissection. Une deuxième étape clé est de garder les moustiques sur la glace assez longtemps pour les assommer sans les tuer. Un petit récipient sera facilité et accélérer le processus, car elle permet un contact plus étroit avec la glace. Enfin, une attention particulière est nécessaire lors de la dissection, comme des pinces peuvent autrement briser les perles. Perles intégrées dans le tissu moustique peut prendre plus de temps pour être colorés par la solution de dissection.

L'utilisation de plusieurs types de perles (comme neutre, positivement ou négativement chargé des perles ou des perles de verre) va conduire à des résultats différents, comme ils may pas tous être mélanisés au même degré 27,43. En effet, par rapport à des billes charge neutre, perles chargées négativement conduisent à une plus grande variabilité dans la réponse de la mélanisation entre les moustiques 27. Perles de verre, d'autre part, sont inertes dans les moustiques et ne déclenchent pas la réponse de mélanisation du tout 27. perles chargées négativement peuvent ainsi être préférés, mais les comparaisons entre les différentes perles peuvent aussi être pertinentes. Cependant, en fonction du type de bourrelet, un colorant différent peut être requis pour les solutions d'injection et de dissection; par exemple, le violet de crésyl colorant doit être utilisé au lieu de vert de méthyle lors de l' utilisation de billes de verre 27.

Cette technique d'injection est invasive pour le moustique. Même si les dommages et les blessures peuvent être minimisés et contrôlés, des outils de remplacement peuvent être une meilleure option, en fonction de la conception expérimentale. Il est difficile de stimuler et de mesurer simultanément plusieurs réponses immunitaires dans le même moustique. Travailtion sur les familles ou les groupes de moustiques est nécessaire lorsque l'on examine les corrélations entre les réponses immunitaires 28. En outre, les perles ne sont que partiellement similaire à la présence effective des parasites dans un insecte.

Tout d'abord, la réponse immunitaire est stimulée, et ensuite la réponse phénotypique résultante, l'encapsulation, on mesure, mais ce qui se passe entre les deux est inconnu. Couplage injections avec des outils physiologiques ou moléculaires 10 - 12 peut améliorer notre compréhension de cette réponse mélanisation. Pour étudier les mécanismes sous - jacents de la réponse de la mélanisation, l'expression des enzymes ou des molécules produites lors de la cascade pro-phenoloxidase clés peut être mesurée 10-12. Cependant, en se concentrant uniquement sur la hausse ou à la régulation de ces molécules, sans connaître les conséquences réelles de l'encapsulation finale, peut conduire à une évaluation inexacte du processus de mélanisation. Par conséquent, l'étude encapsulation et les mécanismes moléculaires ensemble seraient très informatifs, en dépit du fait qu'elles sont chacune une technique scientifique valide lorsqu'ils sont utilisés séparément.

Pour conclure, ceci est une technique pour étudier l'immunité et l'évolution de l'immunité. Il existe, par exemple, en augmentant la preuve d'un lien entre la résistance aux insecticides et les moustiques susceptibilité aux parasites du paludisme. Cette technique d'injection pourrait être utilisée dans un tel contexte, ainsi que dans les essais sur le terrain. Une seconde direction de travail serait de combiner la stimulation immunitaire avec passes rabattues de gènes pour étudier les voies immunitaires dans le détail.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microcapillary glass tubes GB120TF-10 science-products.com GB120TF-10 http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html
Microcaps Capillary pipette bulb Drumond 1-000-9000
negatively charged Sephadex CM C-25 beads Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany C25120 SIGMA need few to start
Methyl green Sigma-Aldrich 323829 ALDRICH need few to start
Software ImageJ opensource Version 1.47f7 or later

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Immunologie numéro 119 Immunity réponse mélanisation Mosquito, Ensemencement Perles induisant
inoculant<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Les moustiques avec perles à induire et mesurer la réponse immunitaire mélanisation
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Barreaux, A. M. G., Barreaux, P.,… More

Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Thomas, M. B., Koella, J. C. Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response. J. Vis. Exp. (119), e55013, doi:10.3791/55013 (2017).

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