Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

inoculating Published: January 12, 2017 doi: 10.3791/55013
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2, 1
1Laboratoire d'écologie et d'épidémioloigie parasitaire, Institut de biologie, Université de Neuchâtel, 2Merkle Lab, Department of Entomology, Pennsylvania State University

Abstract

Stimulering av immunresponser er et vanlig verktøy i virvelløse studier for å undersøke effekt og mekanismer for immunitet. Denne stimuleringen er basert på injeksjon av ikke-patogene partikler i insekter, slik at partiklene vil bli detektert av immunsystemet og vil indusere produksjonen av immun effektorer. Vi fokuserer her på stimulering av melanization respons i myggen Anopheles gambiae. De melanization respons fører til innkapsling av fremmede partikler og parasitter med en mørk lag av melanin. For å stimulere til dette svaret, er mygg inokulert med perler i brysthulen ved hjelp microcapillary glassrør. Deretter, etter 24 timer, er myggen dissekert for å hente kulene. Graden av melanization av vulsten blir målt ved hjelp av bildeanalyse-programvare. Perler har ikke de patogene virkninger av parasitter, eller deres evne til å unngå eller undertrykke immunresponsen. Disse injeksjoner er en måte å målere immun effekt og virkningen av immunstimuleringer på andre livshistorietrekk, slik som fruktbarhet eller levetid. Det er ikke akkurat det samme som direkte studere vert-parasitt interaksjoner, men det er et interessant verktøy for å studere immunforsvar og dens evolusjonær økologi.

Introduction

Insekter er avhengige av immunresponser for å beskytte seg mot parasitter og patogener 1 - 3 som bryter gjennom sin skjellaget eller deres midgut epitel 4. I mygg, disse svarene er effektiv mot bakterier 5, virus 6, filarial nematoder 7, og malariaparasitter 1,8,9. I mygg, er en viktig immunrespons innkapsling av fremmede partikler med melanin 10-12. Denne innkapsling kan skje i midttarmen eller i den hemolymfe sirkulerende system 10 - 12. Dette melanization respons er et resultat av den pro-phenoloxidase cascade 10-12, og det kan føre til døden av parasitter eller til deres fagocytose. Hos voksne mygg, der antall hemocytes celler er begrenset, er melanization en humoral respons, som mot Plasmodium parasitter eller filarial nematoder 7.I enkelte andre insekter, er det direkte de hemocytes celler som samles rundt parasitten til melanize dem syv. Dessuten er melanin også viktig for flere andre fysiologisk prosess som eggproduksjon og skjel sår healing 7.

Stimulering av immunresponser blir brukt som et verktøy for å studere insekt immunitet i flere traktorer og offentlig helse modellsystemer for 13 - 18 år. Den brukes i Anopheles gambiae mygg, den viktigste vektoren av malaria i Afrika, for å studere verts parasitt interaksjoner 14 - 16,19. Disse teknikkene er basert på evnen av insekter for å detektere parasitter med sine mønstergjenkjennings reseptorer (PRR) 2. Mygg kan også oppdage andre molekyler som forstyrrer deres biologi som patogen-forbundet molekylære mønstre (PAMPs), eller oppdage sine egne skadede celler på grunn av utgivelsen av kollagen og nukleinsyrer. Myggen immuncellers slik som hemocytes blir brukt for deteksjon 20-23. De viktigste immunsignalveier er IMD, Toll, JAK / STAT 24, og ribonukleinsyre interferens (RNAi) 25,26. Både Toll og IMD trasé påvirke melanization respons og samhandle med pro-phenoloxidase cascade 10-12.

Standarden verktøy som brukes til å stimulere melanization responsen er inokulering av en mygg med en liten perle i hemolymph av brysthulen. Graden av melanin innkapsling kan deretter måles 19 etter henting vulsten ved disseksjon av mygg. I de fleste studiene ble bare en perle injisert per mygg 15,16,27, men injisere flere perler er mulig for å studere grensene for melanization respons 19. Disse perlene injiseres ved hjelp av en injeksjonsoppløsning (fysiologisk serum) for å begrense forstyrrelse av mygg og fysiologiuttørking av mygg 15,16,27. Et fargestoff ble tilsatt til denne løsningen for å lette perle valg. Det er det samme for disseksjon oppløsningen som benyttes til å hente vulsten 15,16,27.

Fordelen med å inokulere insekter med ikke-patogene stimuli er evnen til å fokusere på den direkte effekt på immunresponsen. Det er ingen kompliserende effekter som skyldes parasitten patogenitet 28, immunsuppresjon 29-31, eller immununndragelser 31-34. Dessuten konsekvensene av stimuleringer på andre livshistorietrekk, for eksempel lang levetid eller fruktbarhet, kan også bli studert. Dermed kan forskerne studere evolusjonær økologi krever slike verktøy 2,35,36. For eksempel, immuno-utfordret humler har en kortere levetid i henhold til sult. Lignende negative effekter av immunstimulering og distribusjoner har blitt observert i forskjellige virvelløse modeller, som ofte resulterer i en korter levetiden eller mindre reproduktiv suksess 13,27,37. Slike undersøkelser kan utføres i forskjellige miljøer 2,4,38. Stimulere immunitet er også av interesse for de som fokuserer direkte på immunpatologi 39,40.

Denne protokollen er basert på inokulering av perler med mygg å stimulere melanization respons og direkte måler mengden av melanin. Dette gjør det mulig kvantitativ og kvalitativ undersøkelse av melanization responsen i forskjellige eksperimentelle innstillinger. Et slikt verktøy kan utvides til stimulering av andre immunresponser, slik som antibakteriell respons på varme-drepte bakterier 41. Det kan også bli gjennomført i flere økologiske innstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Saline injeksjonsvæske, oppløsning og Dissection

  1. Fremstille saltløsning ved tilsetning av NaCl, KCl, og CaCl2 til destillert vann for å oppnå 1,3 mM NaCl, 0,5 mM KCl og 0,2 mM CaCl2 ved pH = 6,8.
  2. Tilsett 1 ml 0,1% metyl-grønn oppløsning til 99 ml av saltoppløsning for å farge de transparente kuler. Dette er 0,001% metyl-grønn "injeksjonsoppløsning".
  3. Deretter tilsett 5 ml 0,1% metyl-grønn løsning til 45 ml saltoppløsning. Dette 0,01% metyl grønn "disseksjon løsning" er 10 ganger mer konsentrert i methyl grønt for å lette fargen på perlene og deres observasjon under disseksjon.
    MERK: Filter sterilisere buffer hvis nødvendig.

2. Capillary Forberedelse

  1. Varme pull mikrokapillarrør glassrørene for å oppnå en meget fin spiss litt større enn de minste kulene (φ = 40 um) 42.
  2. Åpne og enJ USTER hver kapillær ved å bryte spissen med pinsett eller ved saging tuppen av.

3. Mosquito stell

  1. Bakre A. gambiae ved 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% relativ fuktighet, og en 12:12 timers lys: mørke syklus. Hold voksne kvinner og gi dem tilgang til en 10% sukkerløsning.

4. Perler Selections med Capillary

  1. Hell 0,009 g av negativt ladede perler (40-120 mikrometer i diameter) i en 5 cm petriskål og tilsett 5 ml injeksjonsløsning 30 min på forhånd.
    MERK: Målet er å la fargestoff farge perler å gjøre perle utvalg for injeksjon enklere. Autoklav perlene hvis de ikke kommer i et sterilt glass.
  2. Ved hjelp av et kapillar montert i en kapillær pipette pære, visuelt kan velge den minste perle i 0,1 mL av saltløsning under et binokulært mikroskop.
    MERK: Når inoculating flere perler samtidig, velger tre perler fra et totalvolum på 0,1 mL.

5. Mosquito Håndtering og Inoculation

  1. Ved hjelp av et insekt vifte, plasser hver mygg i en 50 ml tube.
  2. Chill hver mygg kort ved å plassere røret i knust is (2-5 min).
  3. Plasser en mygg på høyre side under kikkerten mikroskop.
  4. Under et stereomikroskop, inokulere mygg med kapillæret ved fast piercing gjennom venstre side av brysthulen skjellaget og deretter injisering av væsken og vulsten.
    MERK: Pass på å ikke skade fly muskler ved å holde kapillær som vinkelrett på mygg som mulig.
  5. Fjern kapillæret.
  6. Ved hjelp av fjærlette entomologi pinsett, plassere hver kvinne individuelt i en 180 ml plastkopp dekket med myggnetting; gi dem tilgang til en 10% sukkerløsning.
    MERK: Forsiktighet er nødvendig med sukkerløsning, som mygg kan sette seg fast på sukker løsning dråper.

6. MosquitoDissection og Bead Photography

  1. Sjekk om myggen er i live 24 timer etter vaksinasjonen. Hvis ja, sjekk deres tilstand og beholder bare myggen som er i stand til å fly.
  2. Fryse disse mygg ved -20 ° C.
    MERK: De kan holdes flere dager til måneder før disseksjon, om nødvendig.
  3. Fjern mygg vingene ved hjelp av pinsett under et binokulært mikroskop på 32X forstørrelse. Fest vingene på glassplater med gjennomsiktig tape. Skriv ned koden som brukes for hver enkelt mygg.
  4. Sett glassplater i en skanner og skanne dem på 1200 dpi.
    MERK: Kontroller at koden er lesbar for den enkelte mygg.
  5. På et glass objektglass og i disseksjon løsning Bruk pinsett til å skille thorax fra hodet og magen.
  6. Åpne thorax med pinsett for å hente perlene.
    MERK: Perler som ikke beveger seg til magen, ikke er i kontakt med hverandre, og de fleste av dem flyte fritt i than hemolymph. Vær forsiktig med å bryte perle med tang, som en ikke-melanized perle kan være vanskelig å finne. Vent i 1 til 5 min for perler for å oppnå farge.
  7. Overfør perlene i en dråpe med disseksjon løsning på et glass objektglass, før du tar bildet.
    MERK: Du trenger ikke å vaske perlene.
  8. Ved hjelp av et mikroskop utstyrt med et kamera, ta et digitalt bilde av hver perle ved en standard belysningsinnstilling og 400X forstørrelse.
    MERK: Ikke endre belysning mellom de ulike bildene for å muliggjøre sin sammenligning.

7. Bilde Analyse: Perle Melanization

  1. Åpne bildeanalyse programvare. Klikk på "File" og deretter på "Åpne" for å finne en perle bilde.
  2. Klikk på "analysere". Klikk på "satt målinger." Kryss av "betyr grå verdi" boksen i "faste målinger" -vinduet.
  3. Klikk på sirkelen utvalg verktøyikonet. Velg perle omkretsen; forblir iside perle og unngå lysende glorie rundt det.
  4. Klikk på "analysere" -menyen. Klikk på "tiltak". Oppnå den midlere grå verdi og størrelsen av tverrsnittsarealet av vulsten.
    1. For å oppnå melanization verdien av hver perle, utføre følgende operasjon ved hjelp av en kalkulator eller kalkulator programvare: "256 - betyr grå verdi." Den melanization tiltaket er en verdi mellom 0 og 256, der 0 representerer et helt hvitt bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mygg ikke alle melanize perlene på samme måte, som enkelte perler ble mindre dekket med melanin enn andre (figur 1). Faktisk noen perler forble blå på grunn av en mangel på melanization, mens andre var helt mørkt (figur 1). Den melanization verdien ble standardisert ved lineær interpolering til en verdi mellom 0 (som tilsvarte en blå og unmelanized vulst) og 100 (svarende til en mørk og tungt melanized vulst) (figur 2a og 2b). Disse verdier indikerer graden av melanization av kulene og dermed styrken av immunresponsen.

Vi kan sammenligne perler til hverandre ved å sammenligne deres melanization verdier. Den melanization respons vanligvis følger en gaussisk fordeling, noe som gjør at klassiske statistiske analyser som ANOVA eller Gaussian GLM.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Vi studerte variant av melanization respons med hensyn til antall perler samtidig inokulert i en mygg Målet var å få en bedre forståelse av variasjon og grenser. den melanization responsen. størrelsen av vulsten ikke har noen virkning.

Den gjennomsnittlige perle melanization verdi ble redusert 71-50 når antallet kuler inokulert økes (F igur 2). Det er noen grenser for melanization respons i en mygg når immun utfordring øker. Videre reduserte den melanization responsen for den minst melanized vulst i hver mygg, 71-35 for en til tre kuler, henholdsvis. Men melanization verdien av de sterkeste melanized perle bodde omtrent konstant. Variabiliteten av melanization øket med det antall perler. Den melanization innsatsen var ikke ensartet blant alle perler i en gitt mygg,som en perle ble prioritert fremfor andre. Dette injeksjonsteknikk er nyttig å studere variasjonen av immunresponser i mygg.

Figur 1
Figur 1: Bilde eksempler på en ikke-melanized, en delvis melanized, og en meget melanized vulst etter disseksjon. På venstre, midtre og høyre er en ikke-melanized perle, en delvis melanized perle, og en svært melanized perle, henholdsvis.

Figur 2
Figur 2: Perle melanization som en funksjon av antallet inokulerte perler. (A) Hvert punkt viser melanization av en enkelt perle (med melanization verdier mellom 0 for ikke-melanized perler til 100 for tungt melanized seg), og hver kolonne av punkter representerer et individ mygg. hver mosq RTUiTø ble inokulert med en, to eller tre perler. De faste punkter representerer den høyeste melanization verdi per mygg, de kryssede punktene representerer mellom melanization verdi, og de tomme punktene representerer laveste melanization verdi. De heltrukne linjene representerer gjennomsnittet melanization per perle behandling, de stiplede linjer viser gjennomsnittet av det høyeste melanization, og de stiplede linjer indikerer middelverdien av de laveste melanization. (B) Mean og standardfeil for melanization, den høyeste melanization og laveste melanization per perle vaksinasjon behandling. Den svarte representerer gjennomsnittet vulsten melanization som en funksjon av antall kuler (med melanization verdier som varierer fra 0 for ikke-melanized perler til 100 for tungt melanized seg). Den røde punkt representerer gjennomsnittet av den høyeste melanization. Den blå trekanten representerer gjennomsnittet av de laveste melanization. Stolpene er standardfeil. Modifisert fra referanse 19. </ P>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette injeksjonsteknikk er nyttig for å stimulere og studere melanization respons hos myggen. For eksempel, her studerte vi effekten av immun stimuli belastning.

Den kritiske trinn i denne prosedyren er å riktig vaksinere mygg. Noen overdreven skade på fly muskler eller til mygg i seg selv kan hindre myggen fra fôring eller kanskje drepe den før disseksjon. Et annet viktig skritt er å holde myggen på is lenge nok til å slå dem ut uten å drepe dem. En liten beholder vil lette og fremskynde prosessen, som gjør det mulig tettere kontakt med isen. Endelig er spesiell omsorg nødvendig under disseksjon, som pinsett ellers kan ødelegge perlene. Perler er innebygd i mygg vev kan ta lengre tid å bli farget av disseksjon løsning.

Bruke flere typer perler (som nøytralt, positivt eller negativt ladet perler eller glassperler) vil føre til ulike resultater, som de may ikke alle være melanized i samme grad 27,43. Faktisk, sammenlignet med nøytralt ladete perler, negativt ladede perler føre til mer variasjon i melanization respons mellom mygg 27. Glassperler, på den annen side, er inerte i mygg og ikke utløser den melanization respons i det hele tatt 27. Negativt ladede partikler kan således være å foretrekke, men sammenligninger mellom forskjellige perlene kan også være aktuelt. Imidlertid, avhengig av typen av vulsten, et forskjellig fargestoff kan være nødvendig for injeksjons og disseksjon løsninger; for eksempel, bør kresyl-fiolett fargestoff brukes i stedet for metyl-grønt ved bruk av glasskuler 27.

Dette injeksjonsteknikk er invasiv for myggen. Selv om skader og skader kan minimeres og kontrolleres, kan alternative verktøy være et bedre valg, avhengig av forsøksopplegg. Det er vanskelig å stimulere og samtidig måle flere immunresponser i det samme mygg. Arbeiding på familier eller grupper av mygg er nødvendig når man ser på sammenhengen mellom immunresponser 28. Dessuten, perler er bare delvis lik den faktiske tilstedeværelse av parasitter i et insekt.

Først blir immunrespons stimulert, og deretter den resulterende fenotypiske respons, innkapsling, er målt, men det som skjer i mellom er ukjent. Kobling injeksjoner med fysiologiske eller molekylære verktøy 10 - 12 kan forbedre vår forståelse av denne melanization respons. For å studere de underliggende mekanismene i melanization svar, kan uttrykket av viktige enzymer eller molekyler som produseres i løpet av pro-phenoloxidase cascade måles 10-12. Imidlertid fokusere utelukkende på opp- eller nedregulering av slike molekyler, uten å kjenne den faktiske konsekvenser av den endelige innkapsling, kan føre til en unøyaktig evaluering av melanization prosessen. Derfor studerer encapsulation og de molekylære mekanismer sammen ville være meget informative, til tross for det faktum at de er hver et gyldig vitenskapelig teknikk når de brukes hver for seg.

For å konkludere, er dette en metode for å studere immunitet og utviklingen av immunitet. Det er, for eksempel, økende bevis for en kobling mellom insektmiddel motstand og mygg mottakelighet for malariaparasitter. Dette injeksjonsteknikk kan benyttes i en slik sammenheng, så vel som i feltforsøk. Et andre arbeidsretningen ville være å kombinere immunstimulering med gene knock-out for å studere immun baner i detalj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microcapillary glass tubes GB120TF-10 science-products.com GB120TF-10 http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html
Microcaps Capillary pipette bulb Drumond 1-000-9000
negatively charged Sephadex CM C-25 beads Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany C25120 SIGMA need few to start
Methyl green Sigma-Aldrich 323829 ALDRICH need few to start
Software ImageJ opensource Version 1.47f7 or later

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species. PLoS pathog. 2 (6), e52 (2006).
  2. Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P. PERSPECTIVE: Principles of ecological immunology. Evolutionary Appl. 2 (1), 113-121 (2008).
  3. Crompton, P. D., Moebius, J., et al. Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*. Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).
  4. Schmid-Hempel, P. EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES. Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).
  5. Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti. J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).
  6. Carissimo, G., Pondeville, E., et al. Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota. PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).
  7. Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -C., Nappi, A. J. Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).
  8. Collins, F., Sakai, R., et al. Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae. Science. 234 (4776), 607-610 (1986).
  9. Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization. Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).
  10. Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito. PloS one. 9 (1), e84865 (2014).
  11. Cerenius, L., Söderhäll, K. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immuno Rev. 198, 116-126 (2004).
  12. Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).
  13. Moret, Y., Schmid-Hempel, P. Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers. , Science. New York, N.Y. 1166-1168 (2000).
  14. Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads. J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).
  15. Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae. J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).
  16. Schwartz, A., Koella, J. C. Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania. J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).
  17. Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads. J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).
  18. Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).
  19. Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges. Parasite Vector. 9 (1), 210 (2016).
  20. Lazzaro, B. P., Rolff, J. Danger, Microbes, and Homeostasis. Science. 332 (6025), 43-44 (2011).
  21. Arrighi, R. B. G., Faye, I. Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito. Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).
  22. Michel, K., Kafatos, F. C. Mosquito immunity against Plasmodium. Insect Biochem Molec. 35 (7), 677-689 (2005).
  23. Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics. J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).
  24. Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae. Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).
  25. Blair, C. D. Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission. Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).
  26. Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection. J Gen Virol. , (2009).
  27. Schwartz, A., Koella, J. C. The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation. J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).
  28. Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae. Evolution. 58 (10), 2377 (2004).
  29. Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).
  30. Sacks, D., Sher, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).
  31. Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. How protozoan parasites evade the immune response. Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).
  32. Damian, R. T. Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections. Parasitology. 115, S169-S175 (1997).
  33. Schmid-Hempel, P. Parasite immune evasion: a momentous molecular war. Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).
  34. Schmid-Hempel, P. Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for "macroscopic phenomena" such as virulence. P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).
  35. Stearns, S. C., Koella, J. C. The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity. Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).
  36. Stearns, S. C. Life-history tactics: a review of the ideas. Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).
  37. Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity. Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).
  38. Sheldon, B. C., Verhulst, S. Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology. Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).
  39. Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. Evolutionary causes and consequences of immunopathology. Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).
  40. Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. The implications of immunopathology for parasite evolution. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).
  41. Cator, L. J., George, J., et al. 34;Manipulation" without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites. P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711 (2013).
  42. Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).
  43. Paskewitz, S., Riehle, M. A. Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads. Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).

Tags

Immunologi Immunity Melanization respons Mosquito, inokulering Perler indusere
inoculating<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Mygg med perler for å indusere og måle Melanization immunrespons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barreaux, A. M. G., Barreaux, P.,… More

Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Thomas, M. B., Koella, J. C. Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response. J. Vis. Exp. (119), e55013, doi:10.3791/55013 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter