Introduction
Clostridium difficile er en av de viktigste årsakene til sykehus antibiotika-assosiert diaré infeksjoner 1. Dette Gram-positive anaerob bakterie er overført gjennom sin spore form via fekal-oral rute. I det siste tiåret, ny '' epidemi '' eller '' hypervirulent '' stammer (f.eks BI / NAP1 / 027) forårsaket en drastisk økning i nye infeksjoner og dødsfall priser i Nord-Amerika og Europa to. C. difficile -associated sykdom (CDAD) er en livstruende tykktarmsbetennelse med høye dødsfall priser 3. Symptomene varierer fra diaré 4 til pseudomembranøs kolitt 5 og ofte dødelig toksisk megakolon 6.
Behandling av CDAD er vanskelig som de virulente stammer er multiresistent og tilbakefall er høy 7. I øyeblikket terapi omfatter antibiotika metronidazol, fidaxomicin eller vancomycin, eller i repetitisvis tilbakevendende tilfeller fekal microbiota transplantasjon. Nye terapeutiske strategier er sterkt behov 8. Noen fremgang er registrert som terapeutisk monoklonalt antistoff Bezlotoxumab, rettet mot C. difficile toksin B 9, har nylig bestått fase III kliniske studier, og ble innlevert for godkjenning hos FDA og EMA. I tillegg er nye antibiotika blir testet i øyeblikket på ulike stadier av kliniske studier 10.
Å utvikle effektive behandlingen nye terapeutiske mål må identifiseres. Den nylig oppdaget C. difficile protease prolin-prolin endopeptidase-en (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) er en slik lovende mål, som mangel på PPEP-en i en knock-out belastningen avtar virulens av C . difficile in vivo 11. PPEP-en er et utskilt metalloprotease 12,13 spalte to C. difficile adhesinene på deres C-terminale 13 dermed frigjøre tilhenger bakterielleia fra den menneskelige tarmen epitel. Derfor er det involvert i å opprettholde balansen mellom de fastsittende og bevegelige fenotype av C. difficile. Å utvikle selektive hemmere mot PPEP-en og for å forstå hvordan den gjenkjenner sine underlag intim kjennskap til sin tredimensjonale struktur er uunnværlig. Vi har løst den første krystallstrukturen av PPEP-1 alene og i kompleks med et substratpeptid 14. PPEP-1 er det første kjente protease som selektivt spalter peptidbindinger mellom to prolinrester 15. Det binder substratet i en dobbel knekk måte og stabiliserer den til en utvidet alifatisk-aromatisk nettverk av rester som befinner seg i S-sløyfe som dekker protease aktivt sete 14. Dette substrat-bindende modus er unik for PPEP-en og som ikke finnes i humane proteaser til dags dato. Dette gjør det til en lovende medikament mål, og off-target effekter av hemmere svært usannsynlige.
Å utvikle og skjerm selektiv PPEP-en inhibitors i fremtiden en stor mengde ren og monodisperse PPEP-1-proteinet er nødvendig. Videre, for å bestemme hvilken modus av binding av første inhibitorer, co-krystallstrukturer med PPEP-en er nødt til å bli bestemt. I våre hender PPEP-en produserer stadig vokst krystaller. Dermed har vi utviklet en optimalisering prosedyre for å produsere enkle diffraksjon kvalitet krystaller av PPEP-en. I denne protokollen beskriver vi i detalj produksjon, rensing, krystallisering og struktur løsning av PPEP-1 14. Vi bruker intracellulær ekspresjon i Escherichia coli av et PPEP-en variant som mangler sekresjon-signalsekvensen, affinitetskromatografi og størrelse-eksklusjonskromatografi med fjernelse av rensingen tag, etterfulgt av microseeding 16 inn i en optimaliserings skjerm og strukturbestemmelse via sink enkelt-bølgelengde anomal dispersjonen (sink-SAD) 17. Denne protokollen kan tilpasses for produksjon og strukturbestemmelse av andre proteiner (for eksempel </ Em> metalloproteaser) og spesielt for proteiner som produserer vokst krystaller. På forespørsel plasmid DNA av konstruksjonen (pET28a-NHis-rPPEP-1) og diffraksjon data kan være tilgjengelig for pedagogiske formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning og Konstruer Design
- Klone kodonoptimalisert sekvens (for E. coli) av C. difficile PPEP-en uten signal peptid [aminosyrer 27-220, oppkalt heretter rekombinant PPEP-en (rPPEP-1) 11] inn i pET28a vektoren ved hjelp NdeI og Xhol-restriksjonsseter (figur 1) med et stopp-kodon ved 3'-enden (resulterende vektor pET28a-NHis-rPPEP-1). Dette gir et N-terminalt 6xHis-tagget protein (NHis-rPPEP-1) med en trombin kuttesete slik at du fjerner tag under rensingen (figur 1). Plasmidet inneholder et kanamycinresistens kassett for utvalget. Primere som brukes for kloning er beskrevet andre steder 14.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av konstruere pET28a-NHis-rPPEP-en og SDS-PAGE analyse av EXPREssion og alle rensetrinn. (A) Vector kartet NHis-rPPEP-en klonet inn pET28a vektor bruker NdeI / XhoI opprettet med PlasMapper. (B) Skjematisk fremstilling av NHis-rPPEP-en-konstruksjon (øvre panel) og den endelig konstruksjon etter trombin-spaltning av 6xHis-kode med den resulterende ytterligere GSHM-sekvens ved den N-terminale ende (nedre panel). SDS-PAGE-analyse (C) av uttrykket i BL21 (DE3) Stjerne ved 37 ° C i 4 timer og (D) av prøver fra alle rensetrinn (M: molekylvektsmarkør). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. Uttrykk og rensing av rPPEP-en
- Uttrykk for NHis-rPPEP-en
- Sminke og autoklav LB (lysogeni buljong) medium (10 g / l trypton, 5 g / l gjærekstrakt, 10 g / l NaCl, just til pH 7,5 med NaOH). Supplere med kanamycinsulfat (50 ug / ml) like før bruk (LB / Kan medium).
- Vaksinere en 200 ml natten kultur fra ferske transformert E. coli i LB / Kan medium. Dyrk over natt ved 37 ° C med risting ved 220 rpm.
- På den neste morgen, kontroller OD 600 (optisk tetthet ved 600 nm bølgelengde) av over natten-kulturen. Inokulere to 2,8 l forvirret kolber inneholdende 1 liter LB / Kan medium hver med natten kultur til en OD 600 på 0,1. Supplere med tre dråper vann-silikon emulsjon for å hindre overdreven skumdannelse. Dyrke cellene ved 37 ° C risting ved 180 rpm inntil OD 600 har nådd 0,6.
- Ta en pre-induksjons prøve for SDS-PAGE-analyse (ekvivalent av 1 ml fra en kultur ved OD 600 = 1); legg IPTG til 0,5 mM sluttkonsentrasjon til å indusere ekspresjon av NHis-rPPEP-1. Fortsette å vokse ved 37 ° C / 180 rpm i 4 timer.
- Bestem OD 600 i en 10x dining og ta en prøve avling (ekvivalent med 1 ml av en kultur ved OD 600 = 1).
- Samle celler ved sentrifugering i 20 minutter ved 7000 xg og 4 ° C. For å fjerne resterende LB-medium resuspender cellepelletene fra 1 liter kultur i 40 ml TBS-buffer (Tris-bufret saltløsning: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl) og overfør til et 50 ml sentrifugerør. Samle celler ved sentrifugering i 10 minutter ved 10000 xg og 4 ° C og oppbevares ved -80 ° C inntil bruk. Analyser uttrykk (totalt lysatene og løselige fraksjoner) via SDS-PAGE 18.
- Rensing av ukodet rPPEP-en
- Ta 50 ul prøver fra hvert rensetrinn for SDS-PAGE-analyse. Resuspender cellepelleten fra 1 liter kultur i TBS-buffer supplert med 10 ug / ml DNaseI. Bruk 5 ml TBS / DNaseI per g av celler.
- Lyse cellene ved ultralydbehandling på is / vann ved hjelp av 30% amplitude i 15 min (2 sek pulser med 2 sek pause). Fjern rusk av centrifugation i 10 minutter ved 10000 xg og 4 ° C, og overføring av supernatanten til en ultrasentrifuge-rør. Klart lysat i en ultrasentrifuge i 30 minutter ved 165 000 xg og 4 ° C.
- Arbeid ved 4-6 ° C. Ved hjelp av en peristaltisk pumpe eller kromatografi system i likevekt 2 ml av nikkel-nitrilotrieddiksyre (NiNTA) harpiks i en glasskolonne med TBS-buffer supplert med 10 mM imidazol, pH 7,5. Alternativt kan du bruke tyngdekraften flyt.
- Juster den klarede lysat med en M imidazol, pH 7,5 til en endelig konsentrasjon på 10 mM. Påføre lysatet til kolonnen og vaskes trinnvis med TBS-buffer supplert med 10 mM og 30 mM imidazol, henholdsvis, inntil UV absorpsjonen ved 280 nm har nådd grunnlinjen.
- Elueres proteinet med TBS-buffer plus 250 mM imidazol. Re-ekvilibrere kolonnen for å TBS supplert med 10 mM imidazol, og lagre over natt.
- Bestem protein enten konsentrasjonen på 280 nm ved hjelp av utryddelse koeffistrekkelig av 25900 M -1 cm -1 eller på en annen måte (f.eks Bradford metode 19). Tilsett 2 enheter trombin pr mg protein og dialyser den proteinoppløsning over natten ved 4 ° C mot en 50x volum av TBS (50x av den NiNTA elueringsvolum).
MERK: Ta riktig tomt for bestemmelse av proteinkonsentrasjonen, som imidazol absorberer sterkt ved 280 nm. - Bestå proteinløsningen over ekvilibrert NiNTA harpiks for å fjerne uspaltede protein. Deretter gjelder det samme volum av TBS supplert med 10 mM imidazol til kolonnen for å gjenvinne alt spaltet protein. For å rengjøre kolonnen, elueres all gjenværende protein med 250 mM imidazol. Analysere prøver via SDS-PAGE (figur 1).
- Konsentrere proteinoppløsningen til 4 ml i 10 minutters intervaller ved 4000 xg og 4 ° C ved anvendelse av en sentrifugal-ultrafiltreringsenhet. Bland konsentrere protein etter hvert intervall for å hindre utfelling og aggregering. På dette trinnet sporadiskly noen utfelling observeres for rPPEP-en til tross for blandingsprosessen.
- Anvende konsentrerte protein til en pre-ekvilibrert størrelseseksklusjonskolonne-kromatografi (i TBS-buffer) ved 4-6 ° C. Eluer kolonnen med TBS-buffer, samle 1 ml fraksjoner og under 5 pl av hvert andre fraksjon til SDS-PAGE-analyse. rPPEP-1 eluerer i en enkelt topp som tilsvarer et monomer (figur 2). Av og til en mindre topp ved større molekylvekt observeres (frontopp), som svarer til en dimer av proteinet. Avkastningen bør være rundt 50 mg rent protein per liter kultur. Analysere alle prøvene via SDS-PAGE 18 (figur 2).
- Ta 50 ul prøver fra hvert rensetrinn for SDS-PAGE-analyse. Resuspender cellepelleten fra 1 liter kultur i TBS-buffer supplert med 10 ug / ml DNaseI. Bruk 5 ml TBS / DNaseI per g av celler.
Figur 2: Representative størrelse-utelukkelses-kromatografi og SDS-PAGE-analyse av rPPEP-1. utelukkelse størrelse kromatogram (A280; absorbans ved 280 nm) av renset ukodet rPPEP-en ved hjelp av en (16/600) kolonne i Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl ved 6 ° C. Basert på elueringsvolumet, som rPPEP-1 migrerer forventet for et 22 kDa-protein, noe som tyder på at det er overveiende monomere. Sjelden en mindre frontopp virker som svarer til en dimer. (Innfelt) SDS-PAGE-analyse av fraksjonene fra størrelseseksklusjonskromatografi (M; molekylvekt markør). Hver andre fraksjonen er brukt. De svake bånd under hoved rPPEP-en bandet tilsvarer tidvis oppstår små urenheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Krystallisering og Crystal Optimalisering Bruke Microseeding
MERK: rPPEP-en krystalliserer fra forhold som stadig produsere svært vokst krystaller som ikke passer for røntgendiffraksjon analyse (figur 3). Derfor ble en optimalisering strategi (figur 4) som er utviklet for å oppnå høy kvalitet krystaller (figur 5).
- Innledende screening av rPPEP-en ved hjelp av kommersielle skjermer
MERK: Utfør krystallisering prøvelser i sittende dråpe format ved hjelp av standard kommersielt tilgjengelige skjermbilder og en krystallisering robot.- Konsentrer det rensede protein til 12 mg / ml ved anvendelse av en sentrifugal ultrafiltreringsanordning i 5 minutters intervaller ved 4000 xg og 4 ° C. Bland konsentrere protein etter hvert intervall for å hindre utfelling og aggregering. Bestem proteinkonsentrasjonen, enten ved 280 nm ved hjelp av ekstinksjonskoeffisient på 25 900 M -1 cm -1, eller ved enhver annen metode (f.eks Bradford-metoden). Likevekt proteinet til 20 ° C. Fjerne alle partikler og støv ved sentrifugering i 10 minutter ved 16000 xg og 20 ° C.
- Enten bruke allerede ferdigfylte krystallisering plater SEAled og lagret ved 4 ° C eller fylle reservoar brønnene i platene med 70 pl av hver krystallisering tilstand. Ekvilibrere alle krystallisering platene til 20 ° C. Arbeid raskt, som de små volumene raskt tørke ut. Bruk en fuktighets kammer rundt kaien av roboten, hvis mulig.
MERK: Bruk følgende skjermbildene som en standard prosedyre: SaltRx, Stikkord, PEG / Ion, Crystal, Wizard, PACT ++, JCSG ++. - Sett opp skjermen ved pipettering protein og reservoar inn subwells 2-4. Drop volum er 300 nl og forholdene (protein: reservoar) er 200: 100 (delav 2), 150: 150 (delav 3) og 100: 200 (delav 4) (i nl). Umiddelbart forsegle platen og plasser i et kammer ved 20 ° C.
- Inspiser skuffer umiddelbart etter oppsett, og deretter inspisere hver dag i løpet av den første uken etterfulgt av ukentlig inspeksjon.
- Co-krystallisering av rPPEP-en med ligander
- For co-krystallisering av substrat peptid-rPPEP-en komplekser blande rPPEP-enved 24 mg / ml i et 1: 1 forhold (v / v) med et 7-fold molart overskudd av peptid-løsning (Ac-EVNPPVPD-NH2) lyofilisert pulver oppløst i TBS-buffer), noe som vil gi en sluttkonsentrasjon på 12 mg / ml r-PPEP-1-protein og et 7-fold molart overskudd av peptidet i løpet av PPEP-1. Inkuber i 30 minutter ved 20 ° C og fjerne alle partikler og støv ved sentrifugering i 10 minutter ved 16000 xg og 20 ° C. Fortsett med krystallisering bruker microseeding prosedyre som beskrevet for ubundet r-PPEP-1 protein.
Figur 3: Representative krystaller fra innledende skjermer. Vokst krystaller fra rPPEP-1 ved 12 mg / ml, dyrket i stand. (A) Crystal skjerm I / 38 (1,4 M natriumsitrat tribasic tørke, 0,1 M HEPES sodium pH 7,5, 200 nl: 100 nl). (B) SaltRx skjerm / 52 (2,4 M ammonium fosfat DIBASIC, 0,1 M Tris pH 8,5; 100 nl: 200 nl) og (C) (200 nl: 100 nl). (D) SaltRx skjerm / 96 (60% volum / volum Tacsimate pH 7,0, 0,1 M BIS-TRIS propan pH 7,0; 200 nl: 100 nl). Den Scale bar = 0,2 mm. Volumforhold er alltid protein: reservoar. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Optimalisering prosedyre for rPPEP-en krystallisering. Initial krystaller fra rPPEP-1 ved 12 mg / ml av lav diffraksjon kvalitet og med flere innhegninger (vokst) ble reprodusert i en 24-tilstand optimalisering skjerm. Igjen ble bare vokst krystaller observert i forhold inneholder 2,55 M ammonium fosfat dibasisk. Et frø lager ble fremstilt fra en enkelt krystall vokst og fortynnet 1: 1000 i den samme condition (microseeding). Et volum på 0,5 ul av den fortynnede frø masse ble tilsatt til de gjenværende klare dråper og enkeltkrystaller vokste i nesten alle forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Crystal optimalisering hjelp microseeding
MERK: Meget vokst krystaller av rPPEP-en vises etter to dager i en tilstand som inneholder 2,4 M ammonium fosfat dibasisk, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 (SaltRx skjerm, tilstand E4, alle tre subwells) (figur 3). En optimalisering prosedyren med et rutenett skjermen rundt den opprinnelige tilstanden kombinert med microseeding ble brukt (figur 4).- Fremstille en gitterskjerm (figur 4) som omfatter 24 betingelser med 1,8 til 2,55 M ammoniumfosfat dibasisk (i trinn på 0,15 M) og 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 til 9,0 (i trinn på 0,5 pH-enheter) fra hensiktsmesspiste stamløsninger (4 M ammonium-fosfat og 1 M Tris-buffere).
MERK: Bruk Gjør skuff applet (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx) for å beregne volum og pipettering ordningen for å få 2 ml hver tilstand som gjør det mulig å utføre 10 optimalisering skjermer. Den 4 M ammonium-fosfat stamløsning er vanskelig å fremstille. Oppvarme oppløsningen under omrøring for å løse opp pulveret i vann. - Pipetter 200 ul av hver gitterskjermen oppløsning inn i brønnene til en 24-brønns plate og ekvilibrere ved 20 ° C.
- Manuelt sette opp krystallisering plate. Fallet volum er 3 pl og forholdene (protein: reservoar) er 2: 1, 1,5: 1,5 og 1: 2 (i ul). Her bruker en positiv forskyvning pipette for å unngå luftbobledannelse. Umiddelbart forsegle platen og plasser i et kammer ved 20 ° C. Unngå luftbobledannelse.
MERK: Etter en til fire dager svært vokst krystaller vises i de fire forholdene som inneholder 2,55 M ammonium phosphate dibasisk og 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 til 9,0 (figur 4). Det er ingen krystaller dannes i de resterende 20 forhold med ammonium- fosfatkonsentrasjoner under 2,55 M. microseeding fremgangsmåte brukes for å oppnå enkrystaller av rPPEP-1 i disse tilstandene. - Fremstille en microseed lager ved å høste en enkelt vokst krystall fra en av de to betingelsene med 2,55 M ammonium dinatriumhydrogenfosfat og 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 eller 8,5. Krystallene kan være festet til plastoverflaten. Nøye deformasjon av den omkringliggende plast med en akupunkturnål bidrar til å løsne krystaller.
- Overføre 50 ul av de respektive modervæsken inn i et 1,5 ml rør inneholdende en liten blankpolert glassperlen (perler-for-frø). Ved hjelp av en montert nylon sløyfe overføre krystall i 1 mL av moderluten som er lagt inn på et glassdeksel lysbilde.
- Overfør den væske inneholdende krystallen inn i røret og vortex ved høy hastighet i 30 sek. Lag en 1:1000 fortynning av frø lager inn i et nytt 1,5 ml rør inneholdende den samme nyfremstilt tilstand og virvle grundig i 5 sekunder.
MERK: Frø aksjer kan oppbevares ved -80 ° C for senere bruk.
- Fjern forseglingen av platen som dekker de 20 forholdene med klare dråper og pipette 0,5 mL av frøet lager (1: 1000 fortynning) i brønnene. Tett plate og sted i et kammer ved 20 ° C. Enkle krystaller av høy diffraksjon kvalitet vises i 2-7 dager (figur 5).
- Fremstille en gitterskjerm (figur 4) som omfatter 24 betingelser med 1,8 til 2,55 M ammoniumfosfat dibasisk (i trinn på 0,15 M) og 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 til 9,0 (i trinn på 0,5 pH-enheter) fra hensiktsmesspiste stamløsninger (4 M ammonium-fosfat og 1 M Tris-buffere).
Figur 5: Representative krystaller fra optimalisering skjermen. Enkrystaller fra rPPEP-en på 12 mg / ml seeded med 1: 1000 fortynning frø lager vokst i følgende forhold: (A) 2,1 M ammonium fosfat dibasisk, 0,1 M Tris pH 7,5; 1,5 mL: 1,5 mL; (B) 2,1 M ammonium fosfat dibasisk, 0,1 M Tris pH 7,5; 2 pl: 1 mL; (C) 2,25 M ammonium dinatriumhydrogenfosfat, 0,1 M Tris pH 8; 2 pl: 1 mL; (D) 2,1 M ammonium dinatriumhydrogenfosfat, 0,1 M Tris pH 8; 1 mL: 2 pl. (E) montert krystall på 0,1-0,2 um nylon løkke, dyrket i 2,1 M ammonium dinatriumhydrogenfosfat, 0,1 M Tris pH 8 (2 ul: 1 ul) og kryo-beskyttet i 2,1 M ammonium dinatriumhydrogenfosfat, 0,1 M Tris pH 8, 20% glyserol. Den Scale bar = 0,2 mm i (AD). Volume rasjon er alltid protein: reservoar. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Crystal Montering og datainnsamling
MERK: For å få den beste kvaliteten på diffraksjon data krystaller skal monteres på toppen av deres kvalitet og størrelse. Krystaller kan lagres i flytende nitrogen inntil de are underkastet røntgen-diffraksjonsanalyse ved 100 K. Derfor må den tilstand som de kommer justeres for å kryo-forhold. rPPEP-1-krystallene kan være cryo-beskyttet ved tilsetning av enten 20% glycerol eller 30% sukrose (utskifting av vann i tilstanden av cryo-beskyttelsesmiddel).
- montering Crystal
MERK: Alle krystall manipulasjon trinn skal utføres under stereomikroskop.- Velge den optimale størrelse av nylon løkke for den maksimale lengden av de valgte krystaller. Den typiske lengste akse rPPEP-1-krystaller er omtrent 100-200 pm (figur 5). Forbered en cover lysbilde og riktig cryo-tilstand (f.eks 2,1 M ammonium fosfat dibasisk, 0,1 M Tris, pH 8,0, 20% glyserol).
- Fyll skum dewars med flytende nitrogen, legger hetteglasset klemme med en ampulle og pre-kjøle den i flytende nitrogen-fylt 800 ml skummet Dewar. Plasser en cryo ermet og en cryo stokkholder merket med en passende identifikatori flytende nitrogen fylt 2 liter skum Dewar. Last den magnetiske stav med en montert nylon sløyfe.
MERK: Bruk verneutstyr (eyeshield / briller, hansker) når du arbeider med flytende nitrogen. Varme gjenstander kastet ut i flytende nitrogen kan gi utslipp.
- Fyll skum dewars med flytende nitrogen, legger hetteglasset klemme med en ampulle og pre-kjøle den i flytende nitrogen-fylt 800 ml skummet Dewar. Plasser en cryo ermet og en cryo stokkholder merket med en passende identifikatori flytende nitrogen fylt 2 liter skum Dewar. Last den magnetiske stav med en montert nylon sløyfe.
- Skjær åpne tette bånd med en skarp skalpell og fjerne den med pinsett. Pipetter 1 mL av cryo-tilstanden på omslaget lysbildet (eller alternativt i en tom brønn på samme plate) og fjern krystall fra rulle ved å fiske det med montert nylon sløyfe (figur 5). Vedlagte krystaller kan enkelt løsnes fra bakken ved å deformere den omkringliggende plast med en akupunkturnål.
- Raskt overføre krystallen til slipp av cryo-tilstand og la det stabilisere seg i 1 sekund. Fisk krystall ut så raskt som mulig og stupe-fryse i flytende nitrogen.
- Når flytende nitrogen rundt montert løkke slutter å koke, legg løkken i hetteglasset.Plasser hetteglasset på cryo stokkholder og når lastet med 6 hetteglass plassere en cryo ermet rundt holderen. Oppbevar krystallene i en tank fylt med flytende nitrogen inntil bruk.
- Velge den optimale størrelse av nylon løkke for den maksimale lengden av de valgte krystaller. Den typiske lengste akse rPPEP-1-krystaller er omtrent 100-200 pm (figur 5). Forbered en cover lysbilde og riktig cryo-tilstand (f.eks 2,1 M ammonium fosfat dibasisk, 0,1 M Tris, pH 8,0, 20% glyserol).
- Datainnsamling
MERK: Datainnsamlingen kan utføres hjemme diffractometer, hvis tilgjengelig, eller i en synkrotron beamline. For rPPEP-1 data var samlet på beamline X06DA av den sveitsiske Light Source, Paul-Scherrer-instituttet, Villigen, Sveits bruker en hybrid foton telling detektor. De opprinnelige data og alle filer som brukes i strukturbestemmelse kan gis på forespørsel.- Sett opp bølgelengde av bjelken til 1,282 Å (9667 keV), som er det karakteristiske røntgen-absorpsjon kanten energi (topp) av elementet sink. rPPEP-1 er en metalloprotease som inneholder en enkelt sink per molekyl i det aktive sete.
- Samle inn data på 100 K i den inverse modus-bjelke i 10 ° kiler for en total på 270 ° i hver direction. Eksponeringstiden er 0,1 sek med 0,1 ° rotasjon per bilde. Angi at transmisjonen til 14% (0,14).
- Å samle inn en opprinnelig høy oppløsning datasett fra en andre krystall som stammer fra det samme krystalliser tilstand sette opp bølgelengden for strålen til 1,00 Å (12 398 keV). Samle inn data på 100 K. Eksponeringstiden er 0,1 sek med 0,1 ° rotasjon per bilde. Sett overføring til 70% (0,7).
5. Struktur Fastsettelse via Sink-SAD
MERK: For å bestemme strukturen av rPPEP-en via sink-SAD noen grunnleggende krystallografiske kunnskap er nødvendig samt programvarepakker XDS 20, Phenix 21 og program Kvakk 22. For visualisering av strukturer programmet PyMOL 23 eller Chimera 24 er nødvendig. Data som samles inn ved den bølgelengde som svarer til toppen ved absorpsjon kanten av elementet sink kan benyttes for enkelt-bølgelengde anomale dispersion (SAD) 25 for å få fase informasjon som kan utvides for alle protein atomer.
- Databehandling
- Behandle de to topp datasett (normale og inverse) ved hjelp av programvaren XDS (alternativt iMosflm eller HKL3000) i rommet gruppe P2 1 2 1 2 1 (space gruppe 19) skiller Friedel sin mates (avvikende data). Enhetscellen parametere bør være rundt a, b, c (A) = 43,17, 71,68, 117,70 og α = β = γ (°) = 90. Dette gir to HKL-filer (refleksjon filer).
- Inspiser filen CORRECT.LP. Bruk data opp til oppløsningen hvori CC 1/2 er minst 50%. Skalere sammen begge datasett / refleksjons filer (HKL-filer) ved hjelp av XScale. Inspiser filen XSCALE.LP. Sjekk hvor langt anomale signal strekker (SigAno) og merk oppløsning med en isolert korrelasjon (Anomal Corr) på ca 30%, noe som er 2 Å i tilfelle av data som brukes her er samlet inn til 1,67 Å. Dette eroppløsning cut-off for den avvikende signal som brukes i Phenix Autosol.
- Konverter (skalert) HKL-fil til en CCP4-format refleksjon fil (navngitt, for eksempel peak_anom.mtz) ved hjelp XDSCONV skape en R fri undergruppe av 5% og holde avvikende data (FRIEDEL'S_LAW = USANN). Sjekk MTZ-fil for konsistens med programmet mtzdmp inspisere enheten celleparametere, romgruppen og eksistensen av R Gratis undergruppe (etikett FreeRflag) og avvikende data (etiketter DANO / SIGDANO). Forbered også en ekstra MTZ-fil med XDSCONV uten å trekke ut de avvikende data (FRIEDEL'S_LAW = true; oppkalt, for eksempel peak_native.mtz) for avgrensning på et senere tidspunkt.
- Understell løsning (fase bestemmelse)
- Kjør Phenix Autosol hjelp av refleksjon filen peak_anom.mtz. Velg SAD / MAD topp som datatype og velger 2 sink nettsider (som det er to molekyler per asymmetrisk enhet). Velg enten mer nøyaktige opplementale verdier for f '/ f' 'parametere (bestemmes i en fluorescens skanning ved beamline) eller theotetical verdiene f' = -8,245 og f '' = 3,887. legger også den FASTA filen som inneholder aminosyre-sekvensen av det krystalliserte proteinet.
- Sett oppløsningen grense for oppløsning med en isolert korrelasjon (Anomal Corr) på ca 30% (bestemt i 5.1.2), i dette tilfellet 2 Å og velg "autobuild modellen" alternativet. Ved hjelp av fasene til de to områdene sink funnet av Phenix HySS (en del av Phenix Autosol rørledningen) fasene for hele proteinet kan bli avledet og modellen inne (ved Phenix RESOLVE) inn i elektrontettheten. Den beste modellen er kalt "overall_best.pdb".
- Modellbygging, raffinering og validering
- Velg alternativet "autobuild modell" for å bygge det meste av rPPEP-1 modellen automatisk. Inspiser elektrontetthet på 1,0 σ kontur nivå ved hjelp av progrm Kvakk (figur 6). Det bør være bindevev og omkringliggende atomene i modellen. Ideelt også noen vannmolekyler bør bygges inn i modellen (med en oppløsning bedre enn 2,5 Å). Masse vann (mellomrom mellom molekylene) må ikke inneholde tetthet.
- Sjekk om hele modellen er fullført (alle aminosyrer som er bygget inn i elektrontetthet). Hvis ikke, bygge dem manuelt ved hjelp av verktøyene som tilbys av Kvakk. Spesifiser strukturen ved å kjøre iterative runder med Phenix Begrens med 5 raffinement runder hver bruker overall_best.pdb modellen fil, peak_native.mtz refleksjon filen og FASTA sekvens fil; og manuell modellbygging i Kvakk.
- Validere kvaliteten av den strukturelle modellen med de respektive verktøy i Coot.
Figur 6: Experimental elektrontettheten kart og modell av rPPEP-1 etterPhenix Autosol kjøre. Elektrontetthet i blått på en kontur nivå på 1,0 σ vist i programmet Coot. I denne innledende kart elektrontettheten er pent løst og modellen bygge inn i elektrontettheten. Zoom inn viser rester His142 og Glu189, samt et vannmolekyl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. Struktur Fastsettelse til High Resolution via Molecular Replacement
MERK: For å oppnå høy oppløsning strukturell informasjon om rPPEP-en opprinnelig datasett samles. Deretter en molekylær utskiftingen bruke programvaren Phaser 26,27 (innenfor Phenix programvarepakken) er ansatt ved hjelp av struktur bestemmes via sink-SAD som modell. Denne prosedyren kan også brukes senere når løse strukturer av rPPEP-en kompleksert med små molekyler.
- For å få en krystallstruktur med høyere oppløsning (i dette tilfellet opp til 1,4 Å) behandle den opprinnelige datasettet ved hjelp av programvaren XDS (alternativt iMosflm eller HKL3000) i rommet gruppe P2 1 2 1 2 1 (space gruppe 19). Enhetscellen parametere bør være rundt a, b, c (A) = 43,17, 71,77, 117,80 og α = β = γ (°) = 90. Dette gir en HKL-filer (refleksjon fil).
- Inspiser filen CORRECT.LP. Bruk data opp til oppløsningen hvori CC 1/2 er minst 50%. Konverter HKL-filen til en CCP4-format refleksjon fil (navngitt, for eksempel native.mtz) ved hjelp XDSCONV skape en R fri undergruppe av 5%. Kontroller MTZ-fil for konsistens med programmet mtzdmp inspisere enhetscelleparametere, romgruppen og eksistensen av den frie delmengde R (label FreeRflag).
- Forbered PDB-fil som inneholder modellen fra overall_best.pdb bestemt tidligere, og fjerne alle vannmolekyler og alle ligander (dvs.. sink atom). legger også den FASTA filen som inneholder aminosyre-sekvensen av det krystalliserte proteinet. Kjør Phaser i Phenix hjelp av refleksjon filen native.mtz. Søk etter to molekyler per asymmetrisk enhet.
- Etter vellykket struktur løsning (TFZ-poengsum større enn 8, her 10.2) inspisere modellen (kalt native_phaser.1.pdb) og kart elektrontettheten i Kvakk. Bygg og avgrense struktur ved å kjøre iterative runder med Phenix Begrens med 5 raffinement runder hver bruker native_phaser.1.pdb modellen fil, native.mtz refleksjon filen og FASTA sekvens fil; og manuell modellbygging i Kvakk.
- Validere kvaliteten av den strukturelle modellen med de respektive verktøy i Coot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
rPPEP-1 er overuttrykt i flere E. coli-stammer, med det høyeste utbytte i E. coli BL21 (DE3) Star (figur 1C). Etter den første NiNTA affinitetskromatografitrinn den 6xHis-koden med hell kan avspaltes fra det meste av proteinet og i det andre trinnet NiNTA ufordøyd protein kan være helt atskilt fra trombin-spaltet protein (figur 1D). På en S200 16/600 kolonne ukodet rPPEP-1 vandrer som monomer med sporadiske fron sannsynligvis tilsvarer de dimere arter (Figur 2A). Proteinet er ren (figur 2B), og utbyttet er ca. 50 mg protein fra en liter E. coli kultur. rPPEP-1 krystalliserer under forskjellige forhold (figur 3), ofte inneholdende fosfat. Krystallene er sterkt vokst i alle forhold, så krystall optimalisering måtte utføres. Figur 4 viser scheme av optimaliseringsprosedyre utført for krystaller som stammer fra tilstand kommersielt skjerm SaltRx E4 (52) (figur 3B-C). Igjen vokst krystaller dukket opp i brønner A6-D6 (figur 4). En microseed lager ble fremstilt fra krystaller som dyrkes i stand C6 (2,55 M ammonium dinatriumhydrogenfosfat, 0,1 M Tris pH 8,5) av optimaliseringen skjermen og fortynnet 1: 1000 i moderluten. To til sju dager etter såing med fortynnet frø aksjen inn i de andre gjenværende 20 forhold med klare dråper store enkelt gitter krystaller av høy diffraksjon kvalitet ble observert (figur 5) i de fleste dråper. Etter montering av krystallene til nylon sløyfer (figur 5E) diffraksjonsdata til 1,67 Å oppløsning ble oppsamlet for strukturbestemmelse via sink-SAD (tabell 1), med et anomalt signal som strekker seg til to Å. I tillegg ble innfødte diffraksjon data til 1,4 Å oppløsning samlet for bestemmelse av en high-oppløsning struktur (tabell 1). Krystallstrukturen av rPPEP-en kunne løses (figur 6) og modellen av de innfødte struktur raffinert til R / R Gratis faktorer av 0,156 / 0,182 til 1,4 Å oppløsning (PDB ID: 5A0P) 14 (for videreutvikling statistikk se tabell 1).
| Struktur / datasett | peak Zn-SAD | innfødt |
| Datainnsamling | ||
| Space Group | P2 1 2 1 2 1 | P2 1 2 1 2 1 |
| a, b, c (A) | 43.17, 71.68, 117,70 | 43.17, 71,77, 117,80 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 90, 90, 90 | |
| Bølgelengde (Å) | 1,28254 | 1 |
| Oppløsning (Å) | 45.5-1.67 (1.72-1.67) | 45.5-1.40 (1.49-1.40) |
| Antall observasjoner | 779 717 (34 025) | 310 074 (45 851) |
| Antall unike refleksjoner | 80960 (5597) | 71874 (11172) |
| mangfold | 9.6 (6.1) | 4,3 (4,1) |
| Fullstendighet (%) | 99,2 (93,0) | 98,2 (95,6) |
| Rmerge (%) | 6,8 (56,5) | 5.2 (52.6) |
| <I / σ (I)> | 21.86 (2.81) | 15.66 (2.48) |
| CC (1/2) (%) | 100 (85,1) | 99,9 (85,5) |
| avgrensning statistikk | ||
| R work / R Gratis d (%) | 15.60 / 18.17 | |
| Antall ikke-H-atomer protein | 3109 | |
| Antall vannmolekyler | 532 | |
| Antall ioner / tunge atomer | 2 Zn | |
| Antall andre molekyler | - | |
| Antall TLS grupper / kjetting | 9 | |
| Root-middelkvadratavvik | ||
| Bond lengder (A) | 0,006 | |
| Bond vinkler (°) | 1.022 | |
| Gjennomsnittlig B faktor (A 2) | ||
| Alle protein atomene | 16.12 | |
| Vann | 29.74 | |
| andre atomer | 10.12 | |
| Ramachandran plott e (%) | ||
| mest favoriserte | 98,72 | |
| I tillegg tillates | 1,28 | |
| forbudt | 0 | |
| PDB oppføring | 5a0p |
Tabell 1: Datainnsamling og raffinement statistikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Røntgenkrystallografi er fortsatt den raskeste og mest nøyaktige metode for å bestemme tredimensjonale nær-atom oppløsning strukturer av proteiner 28. Det krever imidlertid veksten av velordnet enkle krystaller. Disse er ofte vanskelige å få, og den krystallinske tilstand er kunstig. Imidlertid er en sammenligning av proteinstrukturer bestemt ved røntgen-krystallografi med de som er bestemt av andre fremgangsmåter, spesielt NMR, viser generelt en meget god overensstemmelse. I tilfelle av PPEP-1, en NMR-struktur som nylig ble publisert 29 viser utmerket overensstemmelse med vår krystallstruktur 14, som blant annet mobiliteten av S-sløyfe.
Denne protokollen beskriver fremstillingen og rensingen av N-terminalt His-tagget rPPEP-1-proteinet for strukturelle studier og krystalliseringen og strukturbestemmelse av umerket rPPEP-1. Enkeltkrystaller var vanskelig å vokse i dette tilfellet, og krevde en spesiell microseeding prosedyre. i than følgende delen vil vi diskutere resultatene for PPEP-en og viser hvordan protokollen kan tilpasses for produksjon og krystallisering av noen annen protein.
Variasjoner over konstruere design og uttrykk
rPPEP-1 blir uttrykt som et N-terminalt His-tagget variant (figur 1A), som for krystallisering er det foretrukket å fjerne His-tag ved hjelp av trombin fordøye på grunn av dens mulige innvirkning på krystalliseringen suksess og proteinstruktur 30. For andre proteiner kan det være fordelaktig i tillegg å teste et C-terminalt His-merket versjon (f.eks klonet ved anvendelse av de samme restriksjonssetene, vektoren pET22b og en revers primer uten stopp-kodon ved 3'-enden), eller å la den N-terminale His-tag uspaltede, som i noen tilfeller en kode kan hjelpe i løpet av krystalliseringen. For rPPEP-en utbyttet og stabilitet av et C-terminalt His-merket konstruere var dårligere. I tillegg kan en innledende testing for beste soluble protein uttrykk bør inkluderes i følgende E. coli-stammer: BL21 (DE3) BL21 (DE3) pLysS eller Lemo21 (DE3) BL21 (DE3) kodon pluss Ripl eller Rosetta 2 (DE3) BL21 (DE3) Star og C41 (DE3) ved tre forskjellige temperaturer / inkubasjonstider (3-4 timer ved 37 ° C, 5 timer ved 30 ° C og over natten ved 20 ° C). Før kloning, sjekk om det finnes et internt trombinspaltning område ved hjelp av ExPASy PeptideCutter verktøy 31 for å hindre spalting av protein av interesse. Alternativt finnes det vektorer ledige som gir en kuttesete for HRV3C (dvs. EMBL er PETM-14 32) eller TEV protease (dvs. EMBL er PETM-11).
protein rensing
For rPPEP-1-konstruksjoner cellelysering blir utført via ultralydbehandling på is / vann. For mer følsomme proteiner som har en tendens til å samle eller fremskynde en mer "skånsom" cellelyse metoden involverer en celle disruptor kan være brukd. Sjekk for store mengder uoppløselig protein etter den første sentrifugeringstrinn, som ikke er detektert ved bruk av lysis-fremgangsmåten, slik som kjemisk cellelyse. For rensing av rPPEP-en vanligvis 2 ml av den NiNTA harpiks ble anvendt. Les produsentens instruksjoner om hvor stort proteinbinding kapasitet av den valgte harpiks er og justere deretter. I de første rensinger av rPPEP-1, hvor bare 1 ml av harpiksen ble anvendt, en masse av protein ble ikke bundet til kolonnen og ble funnet i gjennomstrømnings (figur 1D). På den annen side ved hjelp av for mye harpiks kan redusere renheten av det rensede protein. Juster konsentrasjon for å imidazol bindingsaffiniteten av den brukte His-tagget konstruksjon til den NiNTA matrisen. En trinnvis vaskeprosedyre er å foretrekke her (dvs. 10 mM, 30 mM, 50 mM, 70 mM imidazol), hvori A280 overvåkes og tillates å komme til grunnlinjen i løpet av hvert trinn. På den måten ingen protein går tapt, selv om det vil eluere i løpet av ethøy imidazol vasketrinn (for eksempel ved 50 eller 70 mM). I tilfelle av NHis-rPPEP-1 noen protein eluerer allerede ved 30 mM imidazol, men det er uklart hva slags proteinarter den representerer. Noen proteiner utfelles / aggregat når imidazol dialyseres eller fortynnet ut av proteinløsningen. I slike tilfeller redusere konsentrasjonen av imidazol i elueringsbufferen til 150 mM og tiden for eksponering for høy imidazol-konsentrasjoner, f.eks redusere konsentrasjonen av imidazol ved eluering inn i et beger inneholdende en 5-10-gangers volum av buffer uten imidazol sammenlignet den planlagte elueringsvolumet. For NHis-rPPEP-en inkubasjon med to enheter trombin per mg protein natten ved 4 ° C er tilstrekkelig for å spalte His-tag til nesten 100%. Justere mengden av trombin for proteinet av interesse ved å bruke 1-10 enheter pr mg protein ved 4 ° C til 20 ° C. Ved konsentrering av protein ved hjelp av en sentrifugal pause ultrafiltreringsenhet i intervaller på 5-10 minutter og bland protein å homogenisere konsentrasjonsgradient bygge opp i konsentratoren. Ellers svært konsentrert protein kan aggregere / bunnfall.
krystallisering
rPPEP-en produserer stadig høyt vokst krystaller (enkrystaller vokser oppå hverandre, og dermed har flere krystall innhegninger) som ikke er egnet for røntgendiffraksjon analyse. Forklaringen kan være at for mange kjerne hendelser skjer i kjernesonen av fasediagrammet (figur 7).
Figur 7: Fasediagram av et protein krystallisering eksperiment. Krystaller kan bare danne, når proteinet blir overmettet. Kjernedannelse finner sted i kjernedannelsessonen og krystallvekst i den metastabile sone. Når et protein er undermettet, vil rulle forblir klare.
Fremgangsmåten kan brukes til å ko-krystallisere produkt-peptider og substrat-peptider av rPPEP-1. Krystaller i verdensrommet gruppe P2 en diffraksjon opp til 1,25 Å ble innhentet fra frø aksjer fortynnet 1: 250 i optimalisering prosedyren. Krystaller vokse i de to space grupper P2 1 2 1 2 1 (ubundet protein) og P2 1 (komplekse strukturer), mens stammer fra svært like forhold i ammonium fosfat skjermen på optimalisering prosedyren. På grunn av den krystallpakk finnes i begge r-PPEP-1 krystallformer, hovedsakelig alle små molekyler og peptider adressering unprimed side av det aktive setet alene kan være soaked inn i krystallene. Denne side av molekylet er tilgjengelig fra oppløsningsmidlet til stede i krystallen. Men molekyler adressering både sub-områder eller grunnede siden trenger bare å være co-krystallisert med rPPEP-en, som S-sløyfe åpning ville være nødvendig for å få plass til dem i det aktive området. I tillegg er rPPEP-en er i kontakt med nabomolekylene ved utgangen fra underlaget-bindingssetet i nærheten av S3'site (fremme krystallkontakter i dette området) - noe som også begrenser lengden av substrat-peptider til 3 rester på primet side i disse to krystallformer.
Montering Crystal og cryo-beskyttelse
Montering av protein krystaller er en metode som krever litt dyktighet i manipulasjon under stereomikroskop og dermed trenger litt praksis. Velge den optimale lengden av nylon sløyfe (eller annen sløyfe av valget, f.eks litholoop) for å forhindre at overskudd av løsningsmiddel rundt krystallen som bidrar til BAKGRUNNd spredning og således et lavere signal-til-støy-forholdet av de diffraksjonsdata. Den optimale sløyfe størrelse / lengde gjør også fiske av krystallene enklere som krystallen ikke sklir gjennom løkken. For rPPEP-1 krystaller, som er ca 100-200 mikrometer i den lengste dimensjon, ble nylon sløyfer av 0,1-0,2 mm størrelse valgt. Den cryo-beskyttelsesmiddel kan også bidra til forverring av datakvalitet, som krystallen kan oppstå en osmotisk sjokk når overført til den kryo-tilstand. Dette kan hemme eller ødelegge den indre rekkefølgen av krystallen. velge type og konsentrasjon av cryo-protectant nøye. rPPEP-1 krystaller ble cryo-beskyttet med enten 20% glycerol eller 30% sukrose. Ved krystallisering av et substrat-peptid-komplekset eller et kompleks av rPPEP-1 med en annen ligand, bør sukrose velges som cryo-beskyttelsesmiddel som glycerol binder til det grunnede område av substratet-bindingssetet av rPPEP-1 14.
strukturbestemmelse
Den Autosol oppløsning oppnådd en Bayes-CC på 49,2 ± 18,4, en FOM (figur av fortjeneste) på 0,41, en skew på 0,17 og en korrelasjon RMS på 0,85. Modellen kartet korrelasjonen er 0,86 og R / R gratis faktorene er 0,21 / 0,24. Alle disse parametrene indikerer en vellykket struktur løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker de ansatte på beamline X06DA på Swiss Light Source, Paul-Scherrer-instituttet, Villigen, Sveits for støtte under synkrotron datainnsamling. Vi er takknemlige for Monika Gompert for utmerket teknisk støtte. Prosjektet ble støttet av Universitetet i Köln og gi INST 216 / 682-1 FUGG fra den tyske Forskningsrådet. En doktorgrad fellesskap fra International Graduate School i utvikling helse og sykdom til CP angivelse. Den forskning som fører til disse resultatene har mottatt støtte fra Det europeiske fellesskap syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under tilskuddsavtalen No. 283570 (BioStruct-X).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genes / Vectors / cell strains | |||
| pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
| E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
| Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Yeast extract | any | ||
| Tryptone | any | ||
| Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
| Agar | any | ||
| Kanamycin | any | ||
| IPTG | AppliChem | A1008 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
| NaCl | any | Buffer grade | |
| DNaseI | AppliChem | A3778 | |
| Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
| Glycerol 100% | any | purest grade | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (general) | |||
| Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C - 37 °C | |
| Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8 L) | |
| Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
| Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
| Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150,000 x g | |
| NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
| Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
| Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
| Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
| Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
| Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
| Ultrafiltration units (concentrators) 10,000 NWCO | any | ||
| UV-Vis spectrophotometer | any | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (crystallography) | |||
| Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
| Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
| Crystallization robot | any | ||
| 96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
| 24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
| Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
| Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
| Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
| Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
| JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
| CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm - 0.5 mm |
| CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
| Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
| Cryogenic Foam Dewar 2 L | Hampton Research | HR4-675 | |
| Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
| CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
| CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
| CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
| CryoCane Color Coder - White | Hampton Research | HR4-713 | |
| Scalpel | any | ||
| Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
| Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
| Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |
References
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
- O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).
- Mitchell, B. G., Gardner, A. Mortality and Clostridium difficile infection: a review. Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).
- George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease. J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).
- George, R. H., et al. Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis. Br Med J. 1 (6114), 695 (1978).
- Bartlett, J. G. Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease. Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).
- Kelly, C. P., LaMont, J. T.
- Ünal, C. M., Steinert, M. Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections. Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).
- Kelly, C. P., et al. The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes. Gastroenterology. 150 (4), S122 (2016).
- Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review. Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).
- Hensbergen, P. J., et al. Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831. FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).
- Cafardi, V., et al. Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins. PLoS One. 8 (11), e81306 (2013).
- Hensbergen, P. J., et al. A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins. Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).
- Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile. Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).
- Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).
- Bergfors, T.
- Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Kabsch, W.
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- The PyMOL Molecular Graphics System. , Schrödinger, LLC. (2002).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J.
- Zwart, P. H., et al. Automated structure solution with the PHENIX suite. Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).
- Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).
- Rubino, J. T., et al. Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile. J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).
- Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J.
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors. Microb Cell Fact. 4, 34 (2005).
- Stura, E. A., Wilson, I. A. Applications of the streak seeding technique in protein crystallization. J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).
