Abstract
taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile gözlemler için biyolojik numunelerin işlem en sık karşılaşılan sorunlardır hücre çökme ıslak mikroçevrelerde ve hücre tahrip örnekler işlemden geçirilmesini içerir. SEM altında fotoğraf çekimi için örnek tedavisinde başlıca zorluklardan bazıları üstesinden burada açıklanmıştır narin örnekleri işlemek için, belirli protokoller genç çiçek dokuları, oomiset kistler ve örnek olarak mantar sporları (Agaricales) kullanma.
FAA ile tespit Çiçek meristemler (Formalin-Alkol-Asetik) ve Kritik Nokta Kurutma (CPD) ile işlenmiş hücresel duvarlar ya da bozuk organları çöktü göstermezse vermedi. Bu sonuçlar çiçek gelişiminin yeniden inşası için büyük önem taşımaktadır. Böyle glutaraldehit sabit oomiset kistleri gibi ıslak mikroçevrelerde, alınan örneklerin benzer bir CPD-temelli tedavi, su farklı türde tanısal özelliklerini diferansiyel büyümesini (örneğin, kist dikenleri) test etmek en uygunudurbstrates. mantar sporları bağlı hemşire hücrelerinin imha rehidrasyon, dehidratasyon ve CPD tedavisi, bu hücrelerin daha fonksiyonel çalışmalar için önemli bir adım sonra kaçınıldı.
Burada ayrıntılı protokoller düşük maliyetli ve büyüme süreçlerini yeniden ve tanı özelliklerini incelemek için iyi kalitede görüntüler elde edilmesi için hızlı alternatifleri temsil etmektedir.
Introduction
Biyolojide, taramalı elektron mikroskobu kullanımı (SEM) yapısal evrimi, karşılaştırmalı morfoloji, organ gelişimi ve nüfus veya türlerin 1 karakterizasyonu çalışmalarına uzatıldı. Mikroskobik yapılar olan iki boyutlu görüntüsü, böyle bir mikromorffolojisinin ve sistematiği olarak alanlar 20. yüzyılın ikinci yarısından itibaren SEM tekniği avans yararlandı. Örneğin, 1970'lerde püskürtmeli kaplama yönteminin tanıtımı olarak iletken olmayan dokularda 2, 3 görüntüleme yükseltmiş gibi sürgün uçları ve çiçekler gibi hassas malzemelerin olası gözlemler yapılmıştır. SEM yüksek vakumlu bir ortamda 4 topografya yeniden oluşturmak için numune yüzeyinden çıkarılır elektronları kullanır.
SEM ile ilgili çalışmalar yapısal karakterlerin çıkarım ve growt yeniden inşası, hem de odaklanmışh süreçleri. Yeni yapısal taksonomi ile ilgili karakterler ve organizmaların geniş bir sistematiği SEM gözlemlerden tespit edilmiştir. Örneğin, bitki özellikleri gibi 10, 11, düzgün olmadan görüntülendi olamaz ahşap 5, stigma çeşitliliği 6, nectary ve çiçek morfolojisi 7, 8, pul detayları 9 ve polen taneleri ve vestured çukurlar olarak, türlerin teşhis veya Türüstü sınıflandırmaları için kullanılan SEM. Geleneksel SEM ile Başarılı gözlemler de uzun süre formalin ile fikse organizmalar 12 için elde edilmiş ve bitki herbaryum 13 numune.
Öte yandan, SEM kullanılarak büyüme süreçlerinin yeniden yapılanma çalışmaları organ gelişimi 14, INFE gibi konularda, geniş bir yelpazede içerirBakterilerin 15, bitki kök fizyolojisi 16, parazit-konak bağlanma mekanizması 17, 18, parazitler 19, mycoparasitism ve antibiosis 20, 21, büyüme malformasyon 22 vahşi ve mutant bireylerin 23 karşılaştırmalı gelişme ve tüm yaşam döngülerini uyuşturucu etkileri tarafından uyarılan seksiyonlar 24. Çevre taramalı elektron mikroskopları (ESEM) 25 büyüme süreçlerinde ıslak biyolojik numunelerin gözlem için önemli avantajlara sahip olsa da, hassas malzeme dahi ESEM) düşük vakum koşullarında tehlikeye ve kaybını önlemek için yeterli işlenmesi gerekir olabilir değerli morfolojik gözlem.
Bu yazıda, üç fark SEM gözlem için özel protokoller bir yorumdaÖrneklerin Erent tip sunulmuştur: floral meristemleri, Oomycetes (Saprolegnia), ve fungal madde. Bu protokoller belirli zorluklar ve alternatif çözümler bulunmuştur önceki SEM temelli çalışmalar 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, deneyimi derlemek. Bitki karşılaştırmalı gelişimsel ve yapısal çalışmaların durumunda, SEM kullanımı 1970'li yıllarda 34, 35 yılında başlayan ve o zamandan beri, araştırmacılar belirli çiçek özellikleri, daha önce 36 düşünüldüğünden daha dayanıksız olduğunu keşfetti. çiçek gelişme İmar genç çiçek meristemler ve anthesis'e arasındaki tüm aşamaların yakalama içerir. Bu amaca ulaşmak için, esse olduğunuÖrnek topografya ve hücre duvarı bütünlüğü fiksasyonu ve sonraki dehidratasyon sonra tehlikeye olmadığını ntial. Genç çiçek meristemler hücre duvarı çöküşüne özellikle savunmasız (Şekil 1a, 1b). Benzer şekilde, nectaries, yaprakları, püskülü ve Sporangium gibi hassas yapıların etkin ve undamaging protokolleri gerektirir. Bu yorum SEM görüntüleme için sağlam genç ve narin dokuları tutmak için optimal bir protokol özetlemektedir.
Mikroplar ve bitkilerden omurgasızlar ve omurgalıların 37 arasında değişen ana Omycetes (Stramenopiles'e) parazitlerin en farklı ve yaygın grupların olduğunuz kişiye durumunda - büyümek ve ıslak ortamda gelişebilir sporlar vardır. sporlar, standart SEM protokoller için uygun değildir yeterli alt tabaka gerektiğinden bu durum SEM gözlem için bir sorun teşkil etmektedir. Omycetes arasında Saprolegnia türleri özel ilgi onlar ca, çünkün su kültürlerinde, balıkçılık ve amfibi nüfus 38 ciddi azalmalar neden olur. Bu tür kistler çengel dikenler olarak mikromorfolojik özellikleri, enfeksiyon kontrolleri ve potansiyel tedaviler 39 kurmak esastır Saprolegnia, türlerini belirlemek için yararlı olduğu tespit edilmiştir. Burada, farklı yüzeylerde kistlerin omurga büyümesinin kalıplarını karşılaştırmak ve kritik nokta kurutma (CPD) hazırlanması ve daha sonraki SEM gözlem için örnek işlemek için bir deneysel protokol var.
Üçüncü durumda, mantarlar Phellorinia Herculanea f sporların bir incelemeden sonra geldi ilginç bulgular vardır. stellata f. nova (Agaricales) 31. Birlikte sporlarla, beklenmedik kreş hücrelerinin bir grup SEM altında tespit edilmiştir. önceki geleneksel protokoller ve işlenmemiş malzeme ile, hemşire hücreleri ou geldit tamamen (Şekil 1c) çöktü. Sporların ilişkili belirli dokular hakkında ayrıntılı çıkarımlarda burada açıklanan (Şekil 1d) standart yaklaşımlara basit ama önemli değişiklikler yapılabilir.
Bu derlemede, SEM gözlem ile ilgili farklı sorunlarla başa çıkmak için kullanılabilecek ayrıntılı SEM protokolleri vardır angiospermleri, bu tür hücre çöküşü ve meristematik doku daralması, kist dikenler optimum olmayan büyüme ve imha olarak Oomycetes ve Agaricales, sırasıyla geçici dokular.
Şekil 1: (A, C) ve (B, D) protokolü FAA-etanol-CPD olmadan muamele edilmiş numunelerin karşılaştırılması. (A - b) anacyclus clavatus, orta gelişme Çiçek tomurcukları. Tomurcuk ozmiyum tetroksit 46 <ile işlemden geçirildi/ sup> (a) ve FAA-CPD protokolü (B) ile muamele evlat. (C - d) Phellorinia Herculanea f sporlarla Hemşire hücreleri. stellata. Herhangi bir işleme (C) 'olmayan burada Agaricales'e (d) için tarif edilen protokol ile örnekleri kurutulmuştur. turuncu sporlar. Ölçekler: (ab) 100 mikron (cd) 50 mikron. Resimler Y. Ruiz-León tarafından alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol, tüm (4-6) ortak prosedürler açıklayan belirli organizmaların (bölümler 1-3), ve üç üç adamış altı ana bölümden içerir. Yıldız (*) denemecileri modifiye adımları göstermektedir.
1. Gelişmekte Olan Araştırmalar ve Tam kurulan Bitki Yapıları
- Toplama ve sabitleme
- bitki materyali bir çeker ocak erişimi olmayan bir yerde toplanması halinde, tanıtmak ve santrifüj tüplerine% 70 etanol içinde malzemeyi batırmayın. İdeal olarak, etanol aşırı su kaybını önlemek için FAA 48 saat (1.1.1-1.1.3 adımlar) sonra malzemeyi daldırın. Bir duman dolap bitki materyali erişilebilir ise, bu adımı görmezden ve 1.1.1 ile devam edin.
- bir aldehid filtre takılmış bir çeker ocak formalin-asetik-alkol (FAA) fiksatif hazırlayın. % 70 denatüre etanol içinde 85 kısım,% 60 formaldehid çözeltisi, 10 parça ve buzlu asetik asit 5 ölçü. FAA hazırlayınSadece uzun vadeli depolama, malzeme sabitleme önce 40 tavsiye edilmez.
- çeker ocak altında, bireysel geniş ağız ve sızdırmaz plastik şişelere FAA stok dökün. Mevcut örnekler var gibi çok sayıda şişe kullanın ve örnek tanımlama etiketleri oluşturmak.
- böcekler, mantarlar, ya da aşırı hava koşullarından zarar görmezler sağlanması, düzeltmek için çiçek veya vejetatif meristem seçin. , Dalları kesmek istenmeyen malzeme kaldırma ve FAA çözeltide hemen numuneyi mevduat.
- 72-96 saat sonra, kimyasal bertaraf etmek için, plastik bir kap içine FAA dökün. Hemen sonra, herhangi bir kalıntı FAA çıkarmak için taze% 70 etanol ile numuneleri üç kez yıkayın. Sabit madde% 70 etanol içinde süresiz olarak saklanabilir.
- Diseksiyon ve dehidratasyon
- ne, ultra ince cımbız kullanarak stereomicroscope altında% 70 etanol sabit malzemeyi teşrihedles, forseps, fırçalar ve mikro-neşter (dokusunun maksimum boyutu yaklaşık 1 cm 3 veya düz malzeme için 2 cm olmalıdır). Kurutma dokuları önlemek için etanol ile kaplı bir Petri kabı içine örnekleri teşrih. Daha iyi kontrast beyaz dokuları görmek için kuru siyah silikon kaplı tabanı ile Petri kabı kullanın.
- Kritik nokta kurutucu (CPD, Şekil 2a) için numune kapları disseke malzemeyi koyun. Bu noktada,% 70 etanol ile Petri kabı içine kapları batırmayın ve (kağıt ve kalem ile yapılan) örnek tanımlama etiketleri bulunmaktadır. Daha fazla manipülasyon için daha etkili kurutma için, aynı kapta genç ve olgun örnekleri karıştırma kaçının. *
- kapların kapaklarını koyun ve% 70 etanol bol plastik santrifüj tüplerine bırakılması. Malzeme hemen işleme değilse bir gecede tüpleri saklayın.
- Aşağıdaki etanol serisi ile disseke malzemeyi aktarın% 70,% 90,% 100 ve% 100: Hermetik kavanoz veya santrifüj tüplerine s. en az 1 saat boyunca, her çözelti içinde numune bırakın. % 100 etanol çözeltisi içinde bir gecede örnekleri tutun.
- CPD (bölüm 4) malzeme ile kaplar aktarın.
- SEM gözlem için montaj ve hazırlanması bitki dokuları
- SEM numune tutucuları (yani, alüminyum koçanları) altında numune kimlik numarasını yazın. çift taraflı bant ile koçanları üst kapağı. Bir örnek tutucu (Şekil 2b) içine taslakları yerleştirin.
- Bir stereomikroskop altında, dikkatle zaten CPD kurutulmuş genç ve narin örnekleri taşıyan kapları açın. SMG tedavisinden sonra, numuneler elektrostatik daha hafif ve duyarlı hale gelmesi unutmayın. Numuneler toz veya kirleri önlemek için dışarı atılmıştır kez kapları kapatın.
- , Taslakları yapışkan yüzeyinde örnekleri koymak öncesi planlama istenenpozisyon (örnekler yüzeyine dokunmayın kez bunları kaldırmak çok zordur). Bu noktada önemli bir diseksiyon taşımak kalkmayın; Sadece almak kolaydır istenmeyen doku kaldırmak. palinolojik çalışmalar için, anter incelemek ve koçanları üzerinde polen maruz açın.
- Böyle yatay pozisyonda inflorescences olarak koymak uzun numuneler (örneğin, 2 cm uzunluğunda). Mümkün olduğunda, kutup, tarafı için aynı yapı ve alt görüşlerin şark örnekleri. saplama üzerindeki numuneler arasında yeterince boşluk bırakın.
- Numuneler hemen işleme edilemiyorsa, * onları rehidrasyon (Şekil 2c) önlemek için silika jel ile hermetik kapta gecede korunmasını. Coat püskürtmeli kaplayıcı kullanılarak ve SEM aktarmak örnekleri (bölümler 5 ve 6).
Şekil 2: Örnek işlenmesini Araçlarıve işleme SEM gözlem önce. GBM odası içinde etanol / CO2 değişimi için delikli duvarlı, (a) çelik yapımı numune kabı. (B) plastik numune tutucu içinde Çelik taslakları. (C) Cam kap nem ve tozdan korunmuş örnekleri tutmak için kullandı. Tabanda, silika jel bir bölme vardır. (D) Kritik Nokta Kurutucu. Önünde, manometre, güç düğmesi, sıcaklık kontrol sistemi, ve sıcaklık göstergesi (soldan sağa) vardır. CO 2 -etanol değişimi için olağan çalışma basıncı 60 bar (800 psi). üst, merkezi numune odasına yan dört valf (giriş, drenaj, havalandırma ve egzoz kontrolleri) vardır. Resimler Y. Ruiz-León ve MA Bello tarafından alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Kistlere Büyüyen ve sabitleme
- (+) - - Glukoz (6 g) ve mikolojik pepton (3 g) * pepton ve glikoz (PG-l), D kullanılarak ortam 41 hazırlayın. Musluk suyu 900 mL toplayın ve 121 ° C'de 40 dakika otoklavda. Daha önce otoklava çözelti A 50 mL (NaH 2 PO 4, 0.13 M) ve çözelti B 50 mL (Na 2 HPO 4, 0.13 M) dökün.
- Pepton, glikoz, (PG-l olarak değil glikoz ve otoklav önce pepton Avrupa bakteriyolojik agar 10 g eklenerek hazırlanan PGA) ağar medyada tutulan Saprolegnia parasitica suşları stok kültürleri, 0.5 mL misel kolonileri büyümek Petri kutularında 20 ° C'de 24-48 saat için PG-l damlacıklarının. C otoklavlanmış musluk suyu ile üç kere miselleri yıkama ve 20 ° C'de 15 saat boyunca inkübe edilerek bunları sporlanmasını Uyarmaktadır= "xref"> 42, 43.
- yavaşça süspansiyon üst kısmını pipetleme tarafından yayımlanan ikincil zoosporlar toplayın ve 1 ml porsiyonlarda bunları havuz. İkincil kistlere 44 üretmek için vorteks kuvvetlice 30 saniye boyunca zoosporlar ajitasyon.
- Daha önce (somon ve hake balık pulları, ayrı Petri kapları (p60) üzerine kistlerin dikenler diferansiyel büyümesini test etmek için, farklı yüzeyler (yani, karbon, altın ve bakır TEM ızgaraları üzerine ikincil kist süspansiyonu 0.5 mL koymak ağartılmış) ve cam kapak fişleri) *. yüzeye kistlerin eki yana 70 dakika, 20 ° C 'de kist inkübe edin.
- sıvı çıkarın ve kistlerin tespiti için her bir yüzeye% 2 gluteraldehit 0.5 mL ekleyin. 1 saat boyunca bir çeker ocak altında oda sıcaklığında örnekleri tutun.
- Glutaraldehit çıkarın ve bir etanol serisi (% 30,% 40,% 50,% 60,% 70,% 80 ile örnek dihidrat15 dakika boyunca, her etanol çözeltisi 5 ml ilave% 90,% 100 ve% 100). Son% 100 etanol çözeltisi içinde bir kez, numune bir sızdırmaz Petri kabındaki bir aya kadar saklanabilir. Bu aşamada, numuneler CPD kurutulabilir hazırdır.
- Dikkatle CPD (Bölüm 4) için uygun bir tutucuya Petri kabı ızgaraları ve ölçekler aktarın. Bu adım için, birbirinden ayrılmış örnekleri tutmak GBM ızgara tutucu veya bir istifleme numune tutucu kullanın. kistler her zaman ızgaraları yukarı bakacak gerektiğini göz önünde tutarak, cımbız ile ızgaraları ve ölçekler atın. *
- SEM gözlem için montaj ve hazırlanması kist örnekleri
- Daha önce çift taraflı karbon bant ile kaplanmış ve altına etiketli alüminyum taslakları üzerinde ızgaraları ve ölçekler monte edin.
- püskürtmeli kaplayıcı (bölüm 5) örnekleri aktarın.
- SEM (bölüm 6) altında örnekleri dikkate alınız.
Phellorinia Herculanea Herbaryumun Mantar Sporlarının Çalışması
- Rehidrasyon ve sporların dehidratasyon
- Onları ezmek için özen ~ 0.5-1 cm 2 kalem-etiketli zarf oluşturan, filtre kağıdı ile dikkatlice her bir örnek sarın. ataç ile filtre kağıdı mühür. Bir Petri kabı dolu örnekleri aktarın ve sporlar etrafında dokuları rehydrate 10 mL su onları bırakın.
- Hemen bir mikrodalga (yaklaşık 20 sn için 600 W) örnekleri koydu. su buharlaşmaya başlar kez malzemeyi çıkarın ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
- Aşağıdaki etanol dizi örnekleri geçirin:% 30,% 50,% 70,% 80,% 90,% 95,% 100 ve% 100. Numunelerin miktarına bağlı olarak, bu aşama için, bir bardak ya da santrifüj tüplerini kullanın. Her bir çözelti içinde 15 dakika boyunca numune bırakın.
- CPD (bölüm 4) örnekleri yerleştirin.
- Montaj ve pSEM gözlem sporlar onarılması
- Zarfları açın. çift taraflı bant ile önceden hazırlanmış saplama üzerinde sporları dökün. Alternatif olarak, * onları ezmek için özen koçanları yapışkan yüzeyi ile sporlar toplamak.
- Örnekler birkaç sporlar içeren, önceki aşamasına ilave olarak, zarf (~ 1 ila 2 mm) ve küçük bir parça kesilmiş ve yeni bir saplama * üzerine yerleştirin.
- püskürtmeli kaplayıcı (bölüm 5) içine dokuları yerleştirin.
- SEM (bölüm 6) altında gözlemleyin.
Bir Kritik Nokta Kurutma Kullanılması Malzeme 4. Kurutma (CPD, Şekil 2d)
- havalandırılan bir alanda CPD kullanın ve makinenin tüm vanalar kapalı olduğunu doğrulayın. örnek odası boş ve temiz olup olmadığını kontrol edin.
- Makinenin açın ve sıcaklık kontrol sistemi testi otomatik olarak gerçekleşir emin olun. SMG harici soğutma banyosu sistemi varsa, i açmadan önce su seviyelerini kontrolüzerinde t.
- Etanol ve CO2 değişimi için kullanılan özel CPD üreticinin talimatlarına uyun. Güvenliğiniz için, makinenin kullanımı için eğitilmiş birinin gözetimi altında bu adımı devam. o hızlı basınç değişikliklerine maruz kaldığı, şiddetle dışarı darbe olabilir unutmayın.
- örnekleri alınız ve bitki dokularında ile çalışan eğer adım 1.3 ile devam Oomycetes kistleri ile çalışan eğer 2.2 adım ve mantar sporları ile çalışan eğer 3.2 adımları.
5. Sputter Coater (Şekil 3a) kullanarak Altın Örnekleri Kaplama
- püskürtmeli kaplayıcı kontrol edin. altın katot hedefi iyi durumda olduğundan emin olun. Gerekirse vakum odasının duvarlarını ve oda kapağını temizlemek için% 90 etanol ile sırılsıklam bir tüy bırakmayan bir bez kullanın.
- mikroskop altında örneklerin ileri tanımlama için her saplama deliği yanında sayılarla püskürtme tutucu işaretleyin. Dikkatle, sampl yüklü taslakları yerve es sabitleyin. düzensiz yüzeyleri olan numuneler üzerinde üniform bir kaplama sağlamak için, döner bir planeter örnek sahne kullanın.
- Böyle bir çalışma mesafesi olarak ayarlarını yapmak için üreticinin talimatlarına uyun, operasyon gaz basıncı (örneğin, x 10 -1 5-7 x 10 -1 mbar) (örneğin, 30 mm.), Püskürtme süresi (örneğin, 50 s), altın tabakası (örneğin, 12 nm) güncel (örneğin, 15 mA) ve gerilim beslemesi (örneğin, 600 V) 45 kalınlığı.
- taslakları çıkarın ve SEM (bölüm 6) götürün. Seçenek olarak ise, silika jel üzerinde (Şekil 2c) ile kapalı bir kap içine taslakları yerleştirin.
Şekil 3: püskürtme kaplayıcıda (a) ve tarama elektron mikroskobu (B). (A) vakum odası (solda) önden görünümü, gaz valvE, zamanlayıcı, vakum ve mevcut kontroller. (Soldan sağa) SEM ana bileşenden (b) Yandan görünüm: numune odasına, kontrol grubu ile bilgisayar ekranı ve bölmenin monitör ile vakum sütun. Resimler Y. Ruiz-León tarafından alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tarama altında 6. Gözlem Elektron Mikroskobu (SEM, Şekil 3b)
- SEM başlatmak
- Başlangıç ve (bitkiler 2 mikron ve mantarlar ve Omycetes 4 mikron için, örneğin), çalışma gerilimine (örneğin, 15 kV) numune yüksekliği objektif diyafram çapı ayarlayarak, SEM ayarlamak için üreticinin talimatlarına uyun.
- elektron ışını sisteminin doğru hizalanmasını kontrol edin ve eksenel hizalama ve üreticilerin endikasyona göre stigmators ayarlayın. t ayarlayıno alanın yeterli bir derinlik elde etmek için çalışma mesafesi.
- görüntü yakalama
- numunenin odaklanmış bir görüntü almak ve bir başlangıç noktası olarak kullanabilirsiniz. maksimum seviyeye büyütme yakın arttırmak ve görüntüyü yeniden odaklanır. Bu tür delikler gibi yüzey düzensizlikler olan alanları seçin. Doğru astigmatizma ve optimum kontrast ve parlaklık ayarı.
- yüksek çözünürlüklü SEM Resmi yakalayın. görüntü örnekleri ücret olduğunu gösterir eğer BSE dedektörü kullanın. Aksi takdirde, SE dedektörü ayarlayın. Üreticinin talimatlarını takip dedektörleri değiştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çiçek Gelişim ve Geliştirme Fiksasyon ve Tam kurulan Bitki Yapıları
Burada anlatılan FAA-CPD protokolü kullanarak, genç ve olgun bitki dokuları optimal sabit ve SEM görüntüleme için susuz vardır. Tomurcuklarının topografya ve şekli küçülen hücre (Şekil 1b, 1d, 4a-f) tarafından deforme olmaz çünkü bu tür çiçek gelişme olarak Süreçler yeniden inşa edilebilir. Karmaşık şekilli yapılar başarılı başka bir ulaşılamaz detayları (Şekiller 4 g-I, 5 £) toplanmasına imkan vererek, iletken malzemeden (püskürtme kaplayıcıda metal) üniform bir tabaka ile kaplanabilir. Kötü susuz ve kaplamalı, (Şekil 4f, 5a, 5b) elde edilebilir eğer kullanılan ıslak mikroçevrelerde, gelen numunelerin kaliteli görüntüler elektron akımı ile fazla ücret için. polen duvar yüzeyi gibi önemli detayları (Şekil 5b, 5c) ve indumenta (Şekiller 5D-g çeşit), yapay veya istenmeyen parçacıkların ya da bozuk şekil vermeden derin incelenebilir.
SEM altında yakalanan Erken (a, b), orta (c, e), ve geç (fi) çiçek gelişimi: Şekil 4. (A) birçok çiçek meristemlerde ile Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze ait salkım. (B) genç salkım Polygala violacea Aubl üstten görünümü. (C) Krameria ve Çiçek tomurcuk Loefl ixine. dişi organ farklılaşması sırasında. (D - e) Erythrina ait Tomurcuklar sp. (F) Krameria ixine bir çiçek yandan görünümü. anterler ve stil çıkıntı. (G - i) Hoya carnosa (L.) R. Brown. (
Şekil 5: Sporangium polen SEM mikrograflan (a, b), ayrıntılı yüzeyler (c, e) ve indumenta (f - g) verdi. (A) Dryopteris sp sporangia. Prunus dulcis DA Web (b) Polenb stigma iniş. (C) Nepenthes alata Blanco Polen. Erigeron bir çiçeklenme (d) Yandan görünüm DC karvinskianus. Görüntü BSE dedektörü seçeneği ile çekilmiş. Biryofit Peristoma sp (e) Yandan görünüm. (F) Salgı ve Rosmarinus officinalis L yaprağın alt yüzeyi hiç glandüler tüyler. (G) Olea europaea L yaprak düz ölçekler üstten görünümü. Terazi: (a) 400 um, (B), 60 um; (c) 5 um, (d) 4 mm, (E) 600 um, (f), 200 um, (g), 600 um. Resimler Y. Ruiz-León tarafından alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
İkincil Kistler Saprolegnia parasitica Omurga Büyüme Farklı Yüzeyler Etkisi
(Tablo 1, Şekil 6a) halkalar göstermiştir. Karbon üzerinde ve altın dikenler kısa, kıvrık ve döngüler (Şekil 6b, 6d) oluşturmadan kistler etrafında daha yaygın olarak yetişmektedir vardır ızgaraları. Bakır ızgaraları rağmen, dikenler, olmadan döngü bazıları uzun (Şekil 6c) kıvrılıp eğiliminde. Balık pulları üzerinde dikenler, kıvırcık yüzeyi etrafında bol ve bazen (Şekil 6e-f) halka uçlara kurdu.
Şekil 6: sıvı ortamda dalmış kistler Saprolegnia parasitica dikenler Diferansiyel büyüme modelleri. (A) Glass. (B) Karbon. (C) Bakır. (D) Altın. (E) Barlam ölçek. (F) Somon ölçek. kıvrılmış dikenleri karbon, altın ve balık pulları üzerinde oluşmuş ise düz dikenleri, cam ve bakır geliştirildi. dikenler çengel uçları (beyaz oklar) cam üzerinde büyüyen tüm dikenler ve balık pulları üzerinde birkaç dikenler içinde gözlemlenebilir. Kist duvarları sarı bulunmaktadır. Ölçek: 20 um. Resimler Y. Ruiz-León ve S. Rezinciuc tarafından alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Yüzey | omurga morfolojisi | |
| Uzama | ucunda döngü | |
| cam kapak | İyi uzama, kolay dikenleri saymak Mevcut | |
| balık ölçekler | kıvırcık şekil kolay değil ile dikenleri saymak | Mevcut |
| TEM ızgaraları | saymak, kısa ve kıvırcık dikenleri kolay değil | Yok |
Substratın farklı türleri kullanarak Omurga morfolojisi: Tablo 1.
Phellorinia Herculanea f beklenmedik gözlemler. stellata
Apart P. Herculanea, Calonge ark exoperidium üzerinde laticiferous hiflerin beklenmedik tespitten. 31 küreyle ve mikrodalga yapılan rehidrasyon adıma CPD sayesinde susuz malzeme sporların ile karışık pürüzsüz hemşire hücreleri (8-13 mikron) bulundu. (Şekil 1d). yapı ve t duvarları bilgilerinihemşire hücreleri ve sporlar o iyi ayırıcı kompozisyonu (Şekil 1c-d) rağmen korunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standart SEM protokollere göre, burada sunulan prosedürler nispeten hızlı takip edilmesi kolay ve düşük maliyetli metodolojileri içerir. Numunelerin miktarı ve işleme kolaylığı bağlı olarak, kaliteli görüntüler elde etmek için dört-beş gün sürer. CPD ve SEM çalışması için yeterli güvenlik önlemleri de dahil olmak üzere, prosedürler ele kolaydır. Özellikle dikkat (1.1.3 ve protokolün 2.1.5 adımları 1.1.1 bakınız) formalin ve glutaraldehid ile alınmalıdır. Örnekleri zarar veya önceki adımları bozmadan gerekirse, süreç uzun bir süre durdurulabilir, bazı adımlar (örneğin, 1.1.5, 1.2.3 ve 1.3.5 adımları) vardır. Maliyet açısından, ekipman çok çeşitli hazırlıklar (örn CPD alüminyum kapların ve saplama sahipleri) için yeniden kullanılabilir ve reaktifler pahalı olmayan kimyasallar tüm ticari satıcılardan temin edilebilir.
Bu prosedürlerin dezavantajlarıaldehitler ve etanol ve kilit malzeme eksikliği ve teknik sınırlamalar için uygun kimyasal atık bertarafı için ihtiyaç. Böyle püskürtmeli kaplayıcı ve SMG için CO 2 silindir altın disk olarak Malzemeler önceden kontrol edilmelidir. Onlar sürekli kullanımda ise, laboratuar sonunda maliyetleri yükseltir bunların birden stokları, gerektirecektir. Bireysel araştırmacılar genellikle malzeme bu tür bakım türetilen masrafları haklı olamaz çünkü, ya da sadece sürekli SEM kullanmak gerekmez, bu işlemler günümüzde dış elektron mikroskobu hizmetleri ile laboratuvarlarda yapılmalıdır eğilimindedir.
SEM gözlem tekniği yüzeyleri yüksek bir büyütme çalışma ile sınırlıdır. İç dokular dikkat edilmesi gerekiyorsa, numuneler iç dokuların dış görünümünü keşfetmek için uygun şekilde kesilmelidir. yüksek ma hücrelerin iç yönlerini keşfetmek içingnification, bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) gereklidir. protokolü içinde kritik adımlar şok değişiklikler ve hava ile doğrudan temas güvenli dokuları korumak için çok önemlidir CPD tedavisi öncesi örneklerin doğru tespit ve dehidratasyon vardır. Ayrıca, GBM numune odasına basınç değişimi ve numunelerin farklı biriken kaplama miktarı dikkatle ele alınması önemlidir.
Bu sınırlamalar ve özel manipülasyonlar rağmen, SEM Burada anlatılan protokoller aşağıdaki biyolojik numunelerin çalışma gibi hücre duvarına ve organ bozulma (Şekil 1, 4, 5), gözlem üzerindeki kısıtlamalar gibi sık karşılaşılan bazı sorunların, çözümü için izin verir ve yapıların büyümesi (Şekil 5, 6), ıslak ve sıvı ortamlarda gelen ve duyarlı hücreleri (Şekil 1 c, 1d) imha.
Burada yer alan protokol allowe adresBöyle Saprolegnia 47 kistlerde omurga yapısı gibi geleneksel taksonomik özellikleri, yeniden yorumlanmasını ve sorgulama d. Farklı yüzeylerde Saprolegnia dikenler diferansiyel büyüme paterni bu özelliğin kararsızlık ve türlerin teşhisi için kendi sınırlamaları gösterir. taksonomik çalışmalar, organ gelişim aşamaları ve bulaşıcı hastalıklar, bu tekniklerin sayesinde keşfedilmiş önce gözlenen asla dokuların fonksiyonları için ilgili özelliklerin yakalama ek olarak. Şimdi, bu protokol bekleyen vaka çalışmaları binlerce 33 incelenecek uzatılabilir. hakemli literatür veritabanı Scopus göre, son beş yılda son bitkilerin SEM görüntüleme (4,914) ile ilgili bildiri 7425 yayınlar, Oomycetes (21) ve mantarlar (2490) olmuştur. Bu durum SEM görüntüleme kullanarak Omycetes araştırma ile karşılaştırıldığında hala çok kıt olduğunu göstermektedirbitkiler ve mantarlar. Esem'ler ile, rakamlar daha da düşüktür. Mantarların bitkilerin 337, 1 Omycetes ve 250: Aynı zaman diliminde 588 el yazması vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu proje hibe sözleşmesi No. Bu yayın sadece yazarın görüşlerini yansıtmaktadır 634429. kapsamında Avrupa Birliği Ufku 2020 araştırma ve yenilik programı fon aldı ve Avrupa Komisyonu bilgilerin herhangi bir şekilde kullanımından sorumlu tutulamaz burada yer alan. Biz de gerçek Jardín Botánico, CSIC tarafından yapılan mali katkı kabul. SR Saprolegnia onun araştırma desteği için Avrupa Birliği [ITN-SAPRO-238550] minnettardır. Biz de nazik için Francisco Calonge teşekkür numuneleri (Şekil 5) işlemek için Phellorinia Herculanea görüntüleri ve B. Pueyo sağlamak istiyoruz. Tüm görüntüler Madrid Real Jardín Botánico-CSIC SEM hizmeti tarafından alınmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGrow-Hill. New York. (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , Springer Science + Business Media, LLC. NY. (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , Universidad Internacional Menéndez Pelayo. Doctoral Thesis (2013).
