Abstract
Het vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT) mucosale afweersysteem dient als eerste verdedigingslinie. Betere kennis van de genitale slijmvliezen is daarom van essentieel belang voor het begrijpen van pathogeniciteit van verschillende ziekteverwekkers, waaronder HIV. Gamma'sdelta (GD) T-cellen zijn het prototype van onconventionele T cellen en vormen een relatief kleine subgroep van T-cellen gedefinieerd door hun expressie van heterodimere T-celreceptoren (TCR's) uit gamma- en delta ketens. Dit onderscheidt hen van de klassieke en nog beter bekend CD4 + helper T-cellen en CD8 + cytotoxische T-cellen die worden gedefinieerd door alfa-beta TCRs. GD T-cellen hebben vaak weefselspecifieke lokalisatie en verrijkt in epitheel. GD T-cellen orkestreren immuunresponsen bij ontsteking, tumor surveillance, infectieziekten en auto-immuniteit.
Hier presenteren we een methode reproduceerbaar isoleren en analyseren menselijke endocervicale intraepitheliale GD T-lymfocyten. we have gebruikt endocervicaal Cytobrush monsters van vrouwen die deelnemen aan de Women's Interagency HIV-infectie Study (WIHS). Kennis over GD T cellen interacties tijdens omstandigheden waarin er een belediging voor de vaginale mucosale kan worden toegepast op elk klinisch onderzoek waarbij mucosale kwetsbaarheid is gericht, inclusief de ontwikkeling van vaginale microbicides.In Bovendien kennis mucosale GD T celresponsen heeft toepassingspotentieel GD T-cellen gebaseerde immuuntherapie bij de behandeling van infectieziekten.
Introduction
We ontwikkelden methode waarbij endocervicale borstel monsters intraepithelial GD T-cellen te evalueren. De endocervicaal kanaal is bekleed met een enkele laag van cilinderepitheel. Intra-epitheliale lymfocyten vertegenwoordigen frontlinie lymfocyten die woonachtig zijn binnen de epitheellaag die snel immuunreacties kunnen initiëren op het ontmoeten van pathogene micro-organismen 7, 8. Inzicht in de immunologische gebeurtenissen van endocervicale intra-epitheliale compartiment is belangrijk voor de ontwikkeling van effectieve strategieën voor infecties, waaronder HIV.
De methode kan worden toegepast vers verzameld menselijk endocervicale monsters en ingevroren endocervicale cellen de rol van intra-epitheliale GD T-cellen bij vrouwen met HIV-infectie of het risico loopt HIV-infectie verder te onderzoeken. Het belangrijkste doel van dit protocol is om nieuwe immunologische gebeurtenissen ontdekken in endocervicaal intraepithelial compartiment en evaluate GD T-cel responsen als een marker van mucosale kwetsbaarheid bij vrouwen met HIV-infectie.
De aanzienlijke lacunes in de kennis rond FGT immuniteit zijn deels te wijten aan de moeilijkheid in het succesvol verzamelen en verwerken van mucosale monsters. Bovendien is de complexe heterogeniteit van mucosale immune cellen en hun onderlinge verbondenheid met elkaar, zijn belangrijke uitdagingen voor klinisch relevante identificeren die de toestand en het vermogen van het immuunsysteem weerspiegelen. We ontwikkelden een methode om zeer gezuiverd intraepithelial GD T-cellen die verder kunnen worden geanalyseerd met behulp sterk gemultiplexeerde, eencellig technologieën die kritiek zijn voor het identificeren van de onderliggende mechanismen van FRT immuniteit kan verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studieactiviteiten vond plaats aan de Universiteit van Miami HIV Research Unit, in samenwerking met de Miami Women's HIV Interagency Study (WIHS) en de Miami Center for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (Universiteit van Miami Miller School of Medicine) goedkeuring werd voorafgaand verkregen de aanwerving en de beoordeling of studie gerelateerde procedures.
1. Endocervicale Brush Monsternemingsprocedure
LET OP: De deelnemers onderging een vaginaal onderzoek uitgevoerd door getrainde MD of gynaecoloog en het verzamelen van intra-epitheliale lymfocyten werden onder speculum onderzoek uitgevoerd door het invoegen van Cytobrush.
- deelnemer kenmerken
- Recruit vrouwen deelnemers die de leeftijd 18-45 jaar, seksueel actief, niet zwanger en niet op contraceptieve medicatie of met een spiraaltje.
- Voordat vaginaal onderzoek, hebben de deelnemers onderworpen aan een 10 ml bloed trekken in het groentop heparine vacutainers voor perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) isolement. om te dienen als controle voor endocervicale intraepithelial analyse 9.
- Collectie van de endocervical monsters
- Plaats een steriele speculum van de juiste maat in de vagina zonder smering. Gebruik een warm water om het inbrengen van het speculum en steriel gaasje om het slijm schoon te vergemakkelijken. De positie van het speculum maakt het zichtbaar maken van de os en ectocervix.
- Steek endocervicale kwast in het endocervicale kanaal totdat alleen de haren die het dichtst bij de kant zichtbaar zijn. Draai de borstel met de klok mee voor de 360 °. Breng de borstel in een 15 ml buis met 5 ml IMDM medium.
- Onmiddellijk na collectie, plaatst u de buis met Cytobrush op ijs. Om een hoge levensvatbaarheid van verzamelde intra-epitheliale cellen te verkrijgen, leveren de Cytobrush naar het lab en proces binnen 1 uur.
- Vortex buis met endocervical Cytobrush toepassing van 4 korte (10 sec) slagen.
- Centrifugeer de buis gemaakt met cytobrush, gedurende 10 min bij 250 x g.
- Verwijder voorzichtig de cytobrush van de buis (niet de pellet op de bodem van de buis te verstoren) en voeg 1 ml IMDM medium en plaats de buis op ijs.
- Plaats de cytobrush op 100 mm cel zeef bovenop de 50 ml buis.
- Was de cytobrush met 20 ml IMDM.
- Centrifugebuis gedurende 10 min bij 250 x g.
- Decanteer het supernatant en gepelleteerde cellen opnieuw te suspenderen in 1 ml IMDM en combineren met de reeds geresuspendeerd pellet in 2,3 beschreven.
- Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celtelinrichting 10 of de telling van de cellen met behulp van hemocytometer door het combineren van 10 pi van de celsuspensie met 10 pi van trypan blauw kleurstof. Voorzichtig pipet op en neer tien keer om de cellen te mengen en kleurstof. Load 10 pivan het mengsel in de opening van een van de twee kamers hemocytometer. Tel alle cellen in het raster vijf gebieden. Houd een afzonderlijke telling van levensvatbare en niet-levensvatbare cellen. Bepaal de cellevensvatbaarheid met de volgende formule:% Levensvatbare cellen = Niet-levensvatbare cellen x 100 / totaal aantal cellen cellen.
Bepaal de daaropvolgende celconcentratie per ml (en het totale aantal cellen) met de volgende berekeningen. Totale cellen per ml = totale cellen geteld x (verdunningsfactor / aantal getelde vierkant) x 10.000 cellen / ml. - Freeze geïsoleerde endocervicale cellen via freezing medium dat 10% DMSO en 90% FBS.
3. Flowcytometrie
- Resuspendeer 1-3 x 10 5 endocervicale cellen in 100 pi FACS-buffer (PBS dat 1% runderserumalbumine
- Voeg 1 ul / 10 6 LEVENDE / DEAD opgelapt Yellow Dead Cell Stain kit en antilichamen voor oppervlakte markers op de in tabel 1 beschreven concentraties.
- Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
- Voeg 1 ml FACS buffer en de cellen en centrifugebuizen gedurende 5 min bij 350 xg
- Re-schorten cel pellet in 300 ui 1% paraformaldehyde.
- Bereid compensatie controles gebruikt kralen en antilichamen voor kleuring door toevoeging van 100 pi FACS-buffer en één druppel van de kralen en dezelfde concentratie van de antilichamen die voor monster kleuring.
- Verwerven in lood kralen en monsters op een flowcytometer, uitgerust met een 405 nm, 488 nm en 635 nm lasers.
4. Endocervicale Gamma delta T Cell Isolation
- Magnetische kraal isolatie
- Resuspendeer endocervicale celpellet (≤10 7 totaal cellen), beschreven in 2,6, in 40 pl buffer in de TCR gamma'sdelta microbead kit waarnaar in de tabel van Materialen en Reagentia.
- Volg de kit instructies voor de twee-staps kleuring protocol: eerst, with anti-TCR gamma delta hapteen-antilichaam en ten tweede, met anti-hapten microbolletjes-FITC
- Na incubatie van 15 min bij 4-8 ° C, was de cellen door toevoeging van 1 ml buffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min. Schenk de bovenstaande vloeistof door het omkeren van de buis, en tik droog met behulp van een stuk papier.
- Resuspendeer de celpellet in 500 ul buffer ontvangen en bereidt de magnetische kolom door deze in geschikte magnetische scheider volgens het protocol van de leverancier.
- Toepassen celsuspensie op de kolom en laat ongelabelde cellen die passeren en waskolom 3x met geschikte hoeveelheid buffer (500 ui). Voer wasstappen door toevoeging van buffer driemaal, telkens wanneer de kolom reservoir leeg. Verzamel totale uitstroom. Dit is de niet-gemerkte, negatieve celfractie
- Verwijder de kolom vormen de magnetische separator en pipet 1 ml buffer op de kolom en onmiddellijk spoelen fractie met magnetisch labeled cellen door stevig aanbrengen van de met de kolom geleverde plunjer.
LET OP: Geïsoleerde gamma delta T-cel zijn al fluorescent gekleurd voor flow-cytometrische analyse sinds magnetisch gemerkte anti-hapteen microbolletjes geconjugeerd met fluorescerende kleurstof FITC.
- celsortering
- Voor celsortering, label endocervicale cellen met levensvatbaarheid matrijs en antilichaam paneel zoals beschreven in paragraaf 3.
- Opgericht elektronische poorten op de live, CD45 + CD3 + en gamma-delta-positieve cellen en het uitvoeren van celsortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onlangs hebben we geanalyseerd endocervicaal intraepithelial GD T-cellen en we waren de eerste om te rapporteren over het verlies van endocervicale gamma-delta T-cellen in HIV-geïnfecteerde vrouwen 9, 11. We beschrijven het protocol te isoleren en analyseren van de subset van endocervicale gamma delta T cellen. Zoals getoond in figuur 1, kan GD T cellen gemakkelijk worden gedetecteerd in het humane endocervicale celmonsters.
Een unieke populatie van endocervicale gamma'sdelta V1 (GD 1) T-cellen beschreven met behulp multiparametar flowcytometrie-gebaseerde immunofenotypering (figuur 1). Een representatieve gating strategie voor HIV geïnfecteerde endocervicale monster wordt weergegeven in figuur 1. Analyse werd uitgevoerd op het totale endocervicale cellen door de elektronische poort op Forward / zijwaartse verstrooiing (Figuur 1A), gevolgd door tHij uitsluiting van doubletten cellen (Figuur 1B). Levensvatbare cellen werden gedefinieerd door uitsluiting van dode cellen met Live / DEAD opgelapt Geel Amine Dead Cell Stain (figuur 1C). Analyse van CD45-expressie werd uitgevoerd op levende gated cellen (figuur 1D), gevolgd door de analyse van CD3-expressie (figuur 1E). Gamma delta 1 (GD1) of gamma delta 2 (GD2) positieve cellen werden gedefinieerd als een subpopulatie van CD3 + cellen die GD TCR (TCR gamma'sdelta V1 of TCR gamma'sdelta V2) uit te drukken. Bovendien werd bevestigd dat slechts CD3 + T-cellen tot expressie TCR gamma'sdelta sinds gated CD3 - T-cellen niet tot expressie TCR gamma'sdelta V1 of V2 delta. Fenotypische analyse van gated CD3 + GD1 + cellen geopenbaard (figuur 1G), dat de meerderheid van GD1 cellen (~ 74%) zijn CD4 - CD8 -.
In de huidige studie, de haalbaarheid van het gebruik van endocervical borstel monsters gezuiverd intraepithelial GD T-cellen door positieve selectie magnetische aangetoond (figuur 2).
Figuur 1: Gamma delta (GD) T-cel subpopulatie in endocervicale mucosa door flowcytometrie geanalyseerd. Na gating strategie werd gebruikt om geïdentificeerd endocervical T-cel populaties: (A) endocervicale Cytobrush cellen werden gated op basis van de grootte en de granulariteit (FSC, forward zijwaartse verstrooiing vs SSC, zijwaartse verstrooiing). (B) Cell doubletten werden uitgesloten door de elektronische poorten in de FSC-A (gebied) vs SSC-W (breedte). (C) Levende cellen zijn gated op de levensvatbaarheid dye-negatieve populatie. (D) Elektronische poort werd ingesteld op levende, CD45 positieve cellen. (E) elektronische poort voor CD45 positieve cellen werd ingesteld op CD3 positieve cellen(F) TCRVD1 (GD 1) en TCRVD2 (GD2) expressie werd geanalyseerd op CD3 + cellen. (G) CD4- en CD8-expressie werd geanalyseerd op GD1 + cellen. (H) TCRVD1 en TCRVD2 expressie werd geanalyseerd op gated CD3 negatieve cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Isolatie van endocervicale gamma-delta T-cellen (GD) door positieve magnetische scheiding. Frequentie van endocervicale GD T-cellen werd bevestigd voor en na de positieve magnetische scheiding. Endocervicale cellen werden eerst gemerkt met anti-TCR gamma'sdelta antilichaam en vervolgens met fluorescent gekleurd met anti-hapteen-FITC microbolletjes. Procent TCR GD + T-cellen voor en na het magnetic scheiding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evaluatie van de vrouwelijke geslachtsorganen lagere slijmvlies kwetsbaarheid is een essentieel onderdeel van de klinische onderzoeken naar het risico van HIV acquisitie en transmissie. Typisch FGT gevoeligheid voor HIV-infectie wordt geëvalueerd door het meten van oplosbare immunomodulatoren in genitale afscheidingen (cytokinen, chemokinen en antimicrobiële peptiden) 12, 13. Echter, deze biomarkers zijn slechts een indicatie van de vaginale ontsteking, worden beïnvloed door fysiologische en pathologische gebeurtenissen, en niet altijd directe schade mucosale vertegenwoordigen. Om ons begrip van hoe mucosale factoren verhogen de kans op het verkrijgen en overdracht van HIV te verbeteren, cellulaire markers van mucosale schade moeten worden ontwikkeld. GD intraepitheliale T-cellen aanwezig in de FGT, intercaleren tussen epitheelcellen en wordt verondersteld bij te dragen aan en homeostase als een eerste verdedigingslinie tegen milieu-uitdagingen. GD T-cellen hebben de poten Tial om een extra biomarker vormen voor mucosale kwetsbaarheid beoordelen in het FGT.
In dit protocol wordt getoond hoe intra-epitheliale lymfocyten bereid uit menselijk endocervical cytobrush monster en gemakkelijk beheerst. De meest kritische punt van dit proces is om cellevensvatbaarheid te handhaven door snelle verwerking van het monster en door het houden van de cellen op ijs gedurende de gehele procedure. De opbrengst cel zal afhangen cytobrush verzameling techniek handling vaardigheid en de infectiestatus (HIV infectie of andere virale infecties, bacteriële of schimmelinfecties). Onze groep en anderen hebben diverse studies beschrijven verschillende lymfocytpopulaties in menselijke voortplantingsorganen 9, 14, 15 geplaatst. In onze handen, kan men endocervicaal Cytobrush monster opleveren 0,5-5 x 10 6 cellen met 80-90% levensvatbaarheid. In vergelijking met de gebruikelijke isolatiewerkwijzeclass = "xref"> 14, 15, door onze werkwijze de levensvatbaarheid en celopbrengst verhoogd.
Deze werkwijze verschaft een krachtig en efficiënt middel om endocervicale intraepithelial gamma delta T-lymfocyten bestuderen en kan inzicht verschaffen in andere immune cellen die migreren naar dit compartiment tijdens infectie en / of ontsteking. De in vivo cellulaire samenstelling van de slijmvliezen is het vaak moeilijk om te onderzoeken op een alomvattende en kwantitatieve manier. Technieken zoals immunohistochemie en flowcytometrie worden beperkt door de beschikbaarheid van antigeen specifieke monoklonale antilichamen en door het kleine aantal parallelle metingen die worden uitgevoerd op elke individuele cel. Traditionele high-throughput assays, zoals genexpressie arrays, wanneer uitgevoerd op hele weefsels, mededelen gemiddeld niveau van genexpressie, en kan slechts indirect worden gecorreleerd kwantitatieve veranderingen in cellulaire subpopulaties.Deze beperkingen worden in het bijzonder moeilijk te overwinnen bij het bestuderen van minderheidsgroepen, of de cel bevolking die exclusieve markers ontbreken. Door het combineren van "fluorescentie-geactiveerde celsortering" (FACS) en "eencellige PCR genexpressie analyse" kan een high-throughput transcriptionele analyse van de intra-epitheliale GD T-cellen in endocervix voeren. Deze methode maakt gebruik van de capaciteit van moderne stromingscytometers individuele afzonderlijke cellen met nauwkeurigheid en precisie te sorteren, samen met het gebruik van microfluïdische voor ultieme gevoeligheid gemultiplexte PCR voorvormen van minuut hoeveelheden mRNA, waardoor parallelle analyse van de expressie van maximaal 96 genen waardoor voor elke afzonderlijke cel 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben geen commerciële of andere vereniging die een belangenconflict kunnen opleveren (bijvoorbeeld farmaceutische aandelenbezit, consultancy, adviesdiensten bestuurslidmaatschap, relevante octrooien, of de financiering van onderzoek).
Acknowledgments
Wij danken de Miami WIHS studie deelnemers voor hun bereidheid om deel te nemen aan dit werk. De gegevens in dit manuscript werden verzameld door de Miami Women's Interagency HIV Study (WIHS). De inhoud van deze publicatie zijn uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet de officiële standpunten van de National Institutes of Health (NIH) te vertegenwoordigen. Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten en Women's Interagency HIV-infectie Study (WIHS) [subsidie nummer U01 AI103397], Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten, National Institutes of Health [subsidie nummer P30AI073961], National Center for Advancing Translationeel Wetenschappen en het Nationaal Instituut voor Minority Health and Health verschillen, National Institute of Health [subsidie nummer UL1TR000460 en 1KL2TR000461], en het National Institute of Child Health and Human Development, National Institute of Health [subsidie nummer K23HD074489].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
