Abstract
Den kvinnliga fortplantningsorganen (FRT) mukosala immunsystemet fungerar som den första försvarslinjen. Bättre kunskap om genitalslemhinnan är därför viktigt för att förstå sjukdomsframkallande egenskaper hos olika patogener, inklusive HIV. Gamma delta (GD) T-celler är prototypen för 'okonventionella' T-celler och representerar en relativt liten undergrupp av T-celler definierade av deras expression av heterodimera T-cellreceptorer (TCR) som består av gamma- och delta-kedjor. Detta skiljer dem från de klassiska och mycket mer kända CD4 + hjälpar-T-celler och CD8 + cytotoxiska T-celler som är definierade av alfa-beta TCR. GD T-celler visar ofta vävnadsspecifika lokalisering och berikas i epitel. GD T-celler orchestrate immunsvar in inflammation, tumörövervakning, infektionssjukdomar, och autoimmunitet.
Här presenterar vi en metod för att reproducerbart isolera och analysera mänskliga endocervikala intraepithelial GD T-lymfocyter. vi Have används endocervikala cytobrush prover från kvinnor som deltar i kvinnoInter HIV-infektion Studie (WIHS). Kunskap om GD T-celler interaktion under förhållanden där det är en förolämpning mot den vaginala mucosal skulle kunna tillämpas på någon klinisk studie i vilken slemhinna sårbarhet riktar, inklusive utveckling av vaginal microbicides.In Dessutom kunskap om mucosal GD T-cellssvar har potential för tillämpning av GD T-cellsbaserad immunterapi vid behandling av infektionssjukdomar.
Introduction
Vi utvecklade metoder för att använda endocervikala borstprover för att utvärdera intraepitelial GD T celler. Den endocervikala kanalen är fodrad med ett enda skikt av kolumnär epitel. Intraepiteliala lymfocyter utgör frontlinjen lymfocyter bosatta inom epiteliala skikt som snabbt kan initiera immunsvar på att möta patogena mikrober 7, 8. Att förstå de immunologiska händelser endocervikalt intraepitelial fack är viktig för utformningen av effektiva strategier för att förebygga infektioner, inklusive HIV.
Vår metod kan användas för nyuppsamlade mänskliga endocervikala prover samt frusna endocervikala celler att ytterligare undersöka vilken roll intraepithelial GD T-celler hos kvinnor med HIV-infektion eller med risk för HIV-infektion. Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att upptäcka nya immunologiska händelser i endocervikala intraepitelial facket och evaluate GD T-cellssvar som en markör för mucosal sårbarhet hos kvinnor med HIV-infektion.
De betydande kunskapsluckor kring FGT immunitet är delvis på grund av svårigheten att framgångsrikt samla in och bearbeta slemhinnor prover. Dessutom komplexa heterogenitet slemhinnor immunceller, och deras samhörighet med varandra, är stora utmaningar för att identifiera kliniskt relevanta mätningar som återspeglar tillståndet och förmåga av immunsystemet. Vi utvecklade en metod för att erhålla höggradigt renade intraepithelial GD T-celler som kan vara ytterligare analyserade med hjälp av mycket multiplexerade, teknik encelliga som kan vara avgörande för att identifiera de bakomliggande mekanismerna för FRT immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studieverksamhet ägde rum på University of Miami HIV Research Unit i samarbete med Miami kvinno HIV Inter Study (WIHS) och Miami Center for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (University of Miami Miller School of Medicine) godkännande erhölls tidigare rekrytering och eventuella bedömningar eller studierelaterade procedurer.
1. Endocervikala Brush Provtagning
OBS: Deltagarna genomgick en vaginal undersökning utföras av utbildad MD eller gynekolog och insamling av intraepiteliala lymfocyter utfördes under spekulum undersökning genom att sätta cytobrush.
- deltagarnas egenskaper
- Rekrytera kvinnliga deltagare som är i åldern 18 till 45 år, sexuellt aktiva, inte är gravid och inte på preventivmedel mediciner eller med en spiral.
- Innan vaginal undersökning, har deltagarna genomgå en 10 ml blod oavgjort i gröntbästa heparin Vacutainers för perifert blod mononukleära celler (PBMC) isolering. att fungera som en kontroll för endocervikalt intraepitelial analys 9.
- Insamling av de endocervikala prover
- Sätt en steril spekulum av lämplig storlek in i slidan utan smörjning. Använda ett varmt vatten för att underlätta införandet av spekulum och steril gasbinda för att rengöra slem. Placeringen av spekulum möjliggör fullständig visualisering av os och livmodertappen.
- Sätt endocervikalt penseln i livmoderhalskanalen tills endast borsten närmast handen är synliga. Rotera borsten medurs för 360 °. Överföra borsten i ett 15 ml rör innehållande 5 ml av IMDM-medium.
- Omedelbart efter insamling, placera röret innehållande cytobrush på is. För att erhålla hög lönsamhet av insamlade intraepithelial celler, leverera cytobrush till labbet och processen inom en timme.
- Vortexrör innehåller endocervikala cytobrush tillämpa 4 korta (10 sek) slag.
- Centrifugera röret, innehållande cytobrush, i 10 min vid 250 x g.
- Försiktigt bort cytobrush från röret (inte störa pelleten i botten av röret) och tillsätt 1 ml IMDM media och placera röret på is.
- Placera cytobrush på 100 mm cellfilter ovanpå 50 ml rör.
- Tvätta cytobrush med 20 ml IMDM.
- Centrifugrör under 10 min vid 250 x g.
- Dekantera supernatanten och pellet celler slamma i 1 ml IMDM och kombineras med redan åter suspenderade pelleten som beskrivs i 2.3.
- Räkna celler med användning av en automatiserad cellräknare 10 eller räkna cellerna med hjälp av hemocytometer genom att kombinera 10 mikroliter av cellsuspensionen med 10 mikroliter av trypanblått färgämne. pipettera försiktigt upp och ner tio gånger för att blanda celler och färgämne. Belastning 10 mikroliterav blandningen in i öppningen av endera av de två hemocytometer kamrarna. Räkna alla celler i nätområden fem. Håll en separat räkning av livsdugliga och icke livsdugliga celler. Bestämma cellviabiliteten med användning av följande formel:% viabla celler = Icke-viabla celler x 100 / totala cellantalet celler.
Bestämma den efterföljande cellkoncentrationen per ml (och det totala antalet celler) med användning av de följande beräkningarna. Totalt celler per ml = totalt räknade celler x (utspädningsfaktor / antal räknade kvadrat) x 10.000 celler / ml. - Frysa isolerade endocervikala celler med användning av frysmedium innehållande 10% DMSO och 90% FBS.
3. Flödescytometri
- Återsuspendera 1-3 x 10 5 endocervikala celler i 100 mikroliter FACS buffert (PBS innehållande 1% bovint serumalbumin
- Lägg 1 mikroliter / 10 6 LIVE / DEAD fastställbara Gul Dead Cell Stain kit och antikroppar för ytmarkörer vid de koncentrationer som beskrivs i Tabell 1.
- Inkubera cellerna i 30 min vid 4 ° C, skyddad från ljus.
- Tillsätt 1 ml FACS-buffert och cellerna och centrifugrören i 5 min vid 350 xg
- Återsuspendera cellpelleten i 300 | il 1% paraformaldehyd.
- Förbereda kompensations kontroller med hjälp av pärlor och antikroppar som används för färgning genom tillsats av 100 mikroliter av FACS-buffert och en droppe av pärlorna och samma koncentration av de antikroppar som användes för provfärgning.
- Förvärva färgade pärlor och prover på en flödescytometer, försedd med 405 nm, 488 nm och 635 nm laser.
4. Endocervikala Gamma delta T Cell Isolering
- Magnetisk pärla isolering
- Återsuspendera endocervikala cellpelleten (≤ 10 7 totala celler), som beskrivs i 2,6, i 40 mikroliter av bufferten ingår i TCR gamma delta-mikrokorn kit refereras i Tabell över Material och reagens.
- Följ kit instruktioner för två steg färgningsprotokollet: först, intelligensh anti-TCR gamma delta hapten-antikropp och andra, med anti-hapten mikropärlor-FITC
- Efter inkubation av 15 min vid 4-8 ° C, tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml av buffert och centrifugera vid 300 xg under 10 min. Dekantera supernatanten genom att vända röret, och knacka torr med hjälp av en bit papper.
- Återsuspendera cellpelleten i 500 mikroliter av tillgänglig buffert och förbereda den magnetiska kolonnen genom att placera den i lämplig magnetisk separator enligt leverantörens protokoll.
- Applicera cellsuspension på kolonnen och samla omärkta celler som passerar genom och tvätta kolonnen 3x med lämplig mängd buffert (500 | il). Utför tvättsteg genom att lägga buffert tre gånger, varje gång när kolonnen behållaren är tom. Samla totala utflödet. Detta är den omärkta, negativ cellfraktion
- Ta bort kolumnen bildar den magnetiska separatorn och pipettera 1 ml av buffert på kolonnen och omedelbart spola ut fraktion med den magnetiskt etiketted celler genom fast tillämpning av kolven medföljer kolonnen.
OBS: Isolerad gamma delta T cell redan fluorescerande färgas för flödes cytometrisk analys sedan magnetiskt märkta anti-hapten mikropärlor är konjugerade med fluorescerande färgämne FITC.
- cellsortering
- För cellsortering, etikett endocervikala celler med livskraft dör och antikropp panel som beskrivs i avsnitt 3.
- Inrätta elektroniska grindar på levande, CD45 + CD3 + och gamma delta positiva celler och utföra cellsortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyligen analyserade vi endocervikala intraepithelial GD T-celler och vi var den första att rapportera om förlusten av endocervikala gamma delta T-celler i HIV-infekterade kvinnor 9, 11. Här beskriver vi protokoll för att isolera och analysera delmängd av endocervikala gamma delta T-celler. Såsom visas i figur 1, kan GD T-celler lätt detekteras i humana endocervikala cellprover de.
En unik population av endocervikala gamma delta-V1 (GD1) T-celler har beskrivits med användning av multiparametar flödescytometri-baserad immunfenotypning (Figur 1). En representativ gating strategi för HIV oinfekterade endocervikala prov visas i figur 1. Analys utfördes på det totala antalet endocervikala cellerna genom att sätta elektronisk grind på framåt / Side scatter (Figur 1A) följt av than uteslutning av cell dubletter (Figur 1B). Livsdugliga celler definierades genom uteslutning av döda celler med användning av LIVE / DEAD fastställbara Gul Amin Dead Cell Stain (Figur 1C). Analys av CD45 uttryck utfördes på levande gated celler (Figur 1D), följt av analys av CD3-expression (figur 1E). Gamma delta en (GD1) eller gamma delta 2 (GD2) positiva celler definierades som en subpopulation av CD3 + celler som uttrycker GD TCR (TCR gamma delta V1 eller TCR gamma delta V2). Vidare bekräftades det att endast CD3 + T-celler uttrycker TCR gamma delta eftersom gated CD3 - do T-celler inte uttrycker TCR gamma delta V1 eller delta V2. Fenotypisk analys av gated CD3 + GD1 + celler avslöjade (figur 1G), att majoriteten av GD1 celler (~ 74%) är CD4 - CD8 -.
I föreliggande studie, möjligheten att utnyttja endocervical borst prover till renade intraepithelial GD T-celler genom positiv magnetisk urval visades (Figur 2).
Figur 1: Gamma delta (GD) T-cell-underpopulation i endocervikala mukosa analyserades med flödescytometri. Efter gating strategi användes för att identifierade cell endocervikala T populationer: (A) endocervikala cytobrush celler gated enligt storlek och granularitet (FSC, framåt sidospridning vs SSC, sidospridning). (B) Cell dubletter uteslöts genom att ställa in elektroniska grindar i FSC-A (område) vs SSC-W (bredd). (C) Levande celler är gated på lönsamheten färg negativ befolknings. (D) elektronisk grind sattes på levande, CD45-positiva celler. (E) elektronisk grind för CD45 positiva celler sattes på CD3-positiva celler(F) TCRVD1 (GD1) och TCRVD2 (GD2) uttryck analyserades på CD3 + celler. (G) CD4 och CD8 uttryck analyserades på GD1 + celler. (H) TCRVD1 och TCRVD2 uttryck analyserades på gated CD3-negativa celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Isolering av endocervikala gamma delta T-celler (GD) av positiv magnetisk separation. Frekvens av endocervikala GD T-celler bekräftades före och efter positiv magnetisk separation. Endocervikala cellerna först märktes med anti-TCR-gamma delta-antikropp och sedan med fluorescent färgades med anti-hapten mikropärlor-FITC. Procent av TCR GD + T-celler rapporterades före och efter magnetic separation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bedömning av kvinnliga lägre könsorgan mucosal sårbarhet är en viktig del av kliniska studier som behandlar risken för HIV-förvärv och överföring. Typiskt FGT sårbarhet för HIV-infektion utvärderas genom mätning av lösliga immunmodulatorer i genitala sekret (cytokiner, kemokiner och antimikrobiella peptider) 12, 13. Men dessa biomarkörer är bara ett tecken på vaginal inflammation, påverkas av fysiologiska och patologiska händelser, och representerar inte alltid direkt slemhinneskada. För att förbättra vår förståelse av hur slemhinnor faktorer ökar risken för att förvärva och överföra HIV, cellulära markörer för slemhinneskada behöver utvecklas. GD Intraepitelial T-celler finns i FGT, interkalerar mellan epitelceller, och tros bidra till homeostas samt en första försvarslinje mot miljöutmaningar. GD-T-celler har poten tial att utgöra en ytterligare biomarkör för att bedöma mucosal sårbarhet i FGT.
I detta protokoll, visas det hur man förbereder intraepiteliala lymfocyter från endocervikala cytobrush prov mänsklig och är lätt att bemästra. Den mest kritiska punkten av denna process är att upprätthålla cellviabiliteten med snabb bearbetning av provet samt genom att hålla cellerna på is under hela förfarandet. Cell Utbytet kommer att bero på cytobrush uppsamlingsteknik, hantering skicklighet liksom det infektiösa status (HIV-infektion eller andra virusinfektioner, bakteriell eller svampinfektioner). Vår grupp och andra publicerat olika studier som beskriver olika lymfocytpopulationer i humant könsorganen 9, 14, 15. I våra händer, kan ett endocervikalt cytobrush prov ger 0,5-5 x 10 6 celler med 80-90% viabilitet. I jämförelse med den vanligen använda isoleringsmetodenclass = "xref"> 14, 15, genom vår metod livskraft och cellutbytet ökas.
Denna metod ger ett kraftfullt och effektivt verktyg för att studera endocervikala intraepitelial gamma delta T-lymfocyter och kan ge insikt i andra immunceller som migrerar till denna avdelning under infektion och / eller inflammation. Den cellulära sammansättning in vivo av slemhinnevävnader är ofta svårt att undersöka i en omfattande och kvantitativt sätt. Tekniker såsom immunohistokemi och flödescytometri är begränsade av tillgängligheten av antigen-specifika monoklonala antikroppar och genom mindre antal parallella mätningar som kan utföras på varje individuell cell. Traditionella hög genomströmning analyser, såsom genuttryck arrayer, när de utförs på hela vävnader, lämna information i genomsnitt genuttryck nivå, och kan endast indirekt korrelerade kvantitativa ändringar i cellulära subpopulationer.Dessa begränsningar blir särskilt svårt att övervinna när man studerar minoritetsgrupper, eller cellpopulationen som saknar exklusiva markörer. Genom att kombinera "fluorescensaktiverad cellsortering" (FACS) och "single-cell PCR-gen-expressionsanalys" en kan utföra en high-throughput transkriptionell analys av intraepithelial GD T-celler i endocervix. Denna metod utnyttjar kapaciteten hos moderna flödescytometrar för att sortera individuella enstaka celler med noggrannhet och precision, tillsammans med användningen av mikroflödesteknik att förforma hög känslighet multiplexerade PCR från små mängder av mRNA, vilket möjliggör parallell analys av uttrycket av upp till 96 gener för varje enskild cell 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inte kommersiell eller annan sammanslutning som kan innebära en intressekonflikt (t.ex. läkemedelsaktieägande, rådgivning, advisory board medlemskap relevanta patent, eller forskningsfinansiering).
Acknowledgments
Vi tackar Miami WIHS studiedeltagarna för sin vilja att delta i detta arbete. Data i detta manuskript samlades av Miami kvinnoInter HIV Study (WIHS). Innehållet i denna publikation är helt och hållet författarnas egna och representerar inte officiella ståndpunkter National Institutes of Health (NIH). Detta arbete stöddes av National Institute of Allergy och infektionssjukdomar och kvinnors Inter HIV-infektion Studie (WIHS) [licensnummer U01 AI103397], National Institute of Allergy och Infectious Diseases, National Institutes of Health [licensnummer P30AI073961], Nationellt centrum för främjande translationella Sciences och National Institute on fåtalhälsa och hälsa skillnader, National Institute of Health [licensnummer UL1TR000460 och 1KL2TR000461], och National Institute of Child Health and Human Development, National Institute of Health [licensnummer K23HD074489].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
