Abstract
Die weiblichen Fortpflanzungstrakt (FRT) Schleimhaut-Immunsystem dient als erste Verteidigungslinie. Bessere Kenntnis der Genitalschleimhaut ist daher wesentlich für das Verständnis der Pathogenität von verschiedenen Krankheitserregern wie HIV. Gamma delta (GD) T-Zellen sind der Prototyp "unkonventionelle" T-Zellen und eine relativ kleine Teilmenge von T-Zellen durch ihre Expression von heterodimeren T-Zell-Rezeptoren (TCRs), die aus gamma und delta-Ketten definiert darstellen. Das unterscheidet sie von den klassischen und viel besser CD4 + T - Helferzellen und CD8 + zytotoxischen T - Zellen bekannt , die durch Alpha-Beta - TZR definiert sind. GD-T-Zellen zeigen häufig gewebespezifische Lokalisation und in Epithel angereichert. GD T-Zellen dirigieren Immunreaktionen bei der Entzündung, Tumorüberwachung, Infektionskrankheiten und Autoimmunerkrankungen.
Hier präsentieren wir eine Methode, um reproduzierbar zu isolieren und die menschliche endocervical intraepitheliale GD T-Lymphozyten zu analysieren. Wir have verwendet endocervical Zytobürste Proben von Frauen in der Frauen-Vermittlungs-HIV-Infektion Study (WIHS) teilnehmen. Das Wissen über GD-T-Zellen-Wechselwirkungen bei Bedingungen, in denen es eine Beleidigung für die vaginale Schleimhaut ist, könnte zu einer klinischen Studie angewendet werden, bei denen der Schleimhaut Anfälligkeit gerichtet ist, einschließlich der Entwicklung von vaginalen microbicides.In hinaus sind Kenntnisse über Schleimhaut GD T-Zell-Reaktionen hat Potenzial für die Anwendung der GD T-Zell-basierte Immuntherapie bei der Behandlung von Infektionskrankheiten.
Introduction
Wir entwickelten Methodik der Verwendung von endozervikalen Bürstenproben intraepitheliale GD-T-Zellen zu bewerten. Der Endozervikalkanal wird durch eine einzige Schicht von Epithel ausgekleidet. Intraepitheliale Lymphozyten repräsentieren Front - Lymphozyten in der Epithelschicht Wohnsitz, die sich schnell Immunreaktionen auslösen können pathogene Mikroben 7 nach der Begegnung, 8. die immunologischen Ereignisse des endozervikalen intraepitheliale Kompartiment zu verstehen, ist für das Design von wirksamen Strategien wichtig zur Verhinderung von Infektionen, einschließlich HIV.
Unser Verfahren kann für frisch gesammeltem humanen endozervikalen Proben sowie gefrorene endozervikalen Zellen angewendet werden, um die Rolle von intraepithelialen GD T-Zellen bei Frauen mit HIV-Infektion erforschen oder einem Risiko für eine HIV-Infektion. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, neue immunologische Ereignisse in endocervical intraepitheliale Raum zu entdecken und zu evaluate GD T-Zell-Antworten als Marker mit einer HIV-Infektion bei Frauen Anfälligkeit der Schleimhaut.
Die erheblichen Lücken im Wissen um FGT Immunität sind teilweise aufgrund der Schwierigkeit bei der erfolgreichen Erfassung und Verarbeitung Schleimhautproben. Darüber hinaus ist die komplexe Heterogenität der Schleimhautimmunzellen und deren Vernetzung untereinander, sind große Herausforderungen zu klinisch relevanten Messungen zu identifizieren, die den Zustand und die Fähigkeit des Immunsystems widerspiegeln. Wir entwickelten eine Methode, hochgereinigtes intraepitheliale GD-T-Zellen zu erhalten, die weiter analysiert werden können hoch Multiplex, Single-Cell-Technologien, die für die Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen von FRT Immunität von entscheidender Bedeutung sein kann.
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Protocol
Study Aktivitäten fand an der Universität von Miami HIV Research Unit in Zusammenarbeit mit dem HIV-Vermittlungs-Studie Miami Frauen (WIHS) und dem Miami Zentrum für AIDS-Forschung (CFAR) .Institutional Review Board (University of Miami Miller School of Medicine) Genehmigung wurde vor erhalten zur Rekrutierung und jegliche Beurteilung oder Untersuchung im Zusammenhang mit Verfahren.
1. Endozervikale Pinsel Probenentnahme
HINWEIS: Die Teilnehmer unterzog sich einer vaginalen Untersuchung durch geschultes MD oder Gynäkologen und Sammlung von intraepitheliale Lymphozyten wurden durchgeführt durch das Einfügen Zytobürste unter Speculum Prüfung durchgeführt.
- Teilnehmer Merkmale
- Rekrutieren Frauen Teilnehmer, die 18 bis 45 Jahre alt sind, sexuell aktiv, nicht schwanger und nicht auf Verhütungsmittel Medikamente oder mit einem Intrauterinpessar.
- Vor vaginale Untersuchung unterziehen haben die Teilnehmer 10 ml Blut ziehen in grünTop-Heparin Vacutainer für Pbmc (PBMC) Isolierung. dienen als Kontrolle für endocervical intraepitheliale Analyse 9.
- Sammlung der endozervikale Proben
- Legen Sie eine sterile Speculum von geeigneter Größe in die Vagina ohne Schmierung. Verwenden Sie ein warmes Wasser Einführen des Spekulums zu erleichtern und steriler Gaze den Schleim zu reinigen. Die Position des Speculum ermöglicht eine vollständige Visualisierung des Os und ectocervix.
- Legen Sie endocervical Pinsel in die Endozervikalkanal, bis nur noch die Borsten am nächsten an der Hand sichtbar sind. Drehen Sie die Bürste im Uhrzeigersinn um 360 °. Übertragen Sie die Bürste in einem 15 ml-Röhrchen, die 5 ml IMDM-Medium.
- Unmittelbar nach der Entnahme wird das Reagenzglas Zytobürste auf Eis enthält. Um eine hohe Lebensfähigkeit der gesammelten intraepitheliale Zellen zu erhalten, liefern die Zytobürste ins Labor und Prozess innerhalb von 1 h.
- Vortex-Röhrchen mit endocervical Zytobürste Anwendung 4 kurz (10 sec) Schlägen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen, mit Zytobürste, 10 min bei 250 x g.
- Vorsichtig die Cytobrush aus dem Rohr zu entfernen (nicht das Pellet am Boden des Röhrchens zu stören) und 1 ml IMDM Medium hinzuzufügen und das Röhrchen auf Eis stellen.
- Legen Sie die Zytobürste auf der 100 mm Zelle Sieb auf dem 50-ml-Tube.
- Waschen Sie die Zytobürste mit 20 ml IMDM.
- Zentrifugenröhrchen für 10 Minuten bei 250 x g.
- Den Überstand abgießen und pelletierten Zellen resuspendieren in 1 ml IMDM und verbinden sich mit dem bereits wieder suspendierten Pellets in 2.3 beschrieben.
- Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler 10 oder die Zellen zählen Zählkammer durch die Kombination von 10 & mgr; l der Zellsuspension mit 10 & mgr; l Trypanblaufarbstoff. Pipettieren vorsichtig nach oben und unten zehnmal um die Zellen zu mischen und färben. Last 10 & mgr; ldes Gemisches in der Öffnung der einen der beiden Kammern Hämozytometer. Zählen Sie alle Zellen in den fünf Rasterflächen. Halten Sie eine separate Zählung der lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung der folgenden Formel:% Lebensfähige Zellen = Nicht lebensfähige Zellen x 100 / Gesamtzellzahl Zellen.
Bestimmen die nachfolgenden Zellkonzentration pro ml (und die Gesamtzahl der Zellen) unter Verwendung der folgenden Berechnungen. Insgesamt Zellen pro ml = Gesamt Zellen gezählt x (Verdünnungsfaktor / Anzahl der gezählten Quadrat) x 10.000 Zellen / ml. - Gefriert isoliert endozervikale Zellen mittels Einfrieren-Medium, enthaltend 10% DMSO und 90% FBS.
3. Durchflusszytometrie
- Re-suspendieren 1-3 x 10 5 Zellen endocervical in 100 ul FACS - Puffer (PBS , enthaltend 1% Rinderserumalbumin
- 1 & mgr; l / 10 6 , LIVE / DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit und Antikörper für Oberflächenmarker in den in Tabelle 1 beschrieben Konzentrationen.
- Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten bei 4 ° C, vor Licht geschützt.
- 1 ml FACS-Puffer und die Zellen und Zentrifugenröhrchen für 5 Minuten bei 350 xg
- Re-suspendieren Zellpellet in 300 & mgr; l 1% Paraformaldehyd.
- Bereiten Kompensationssteuerungen für die Färbung verwendet, um Perlen und Antikörper durch Zugabe von 100 & mgr; l FACS-Puffer und ein Tropfen der Perlen und die gleiche Konzentration der für die Probenfärbung verwendeten Antikörper.
- Erwerben gefärbten Perlen und Proben auf einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit 405 nm, 488 nm und 635 nm Laser.
4. Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen Isolation
- Magnetic - Bead - Isolation
- Re-suspend endocervical Zellpellet (≤10 7 insgesamt Zellen) beschrieben in 2,6, in 40 & mgr; l Puffer, die in der TCR gamma delta Mikrobead Kit in der Tabelle der Materialien und Reagenzien verwiesen.
- Folgen Sie den Anweisungen Kit für zweistufigen Färbeprotokolls: Erstens, Witzh anti-TCR gamma delta Hapten-Antikörper und der zweite, mit anti-Hapten-Mikrobeads-FITC
- Nach einer Inkubation von 15 min bei 4-8 ° C, wasche die Zellen durch Zugabe von 1 ml Puffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min. Den Überstand umfüllen durch das Rohr Umkehren und tippen Sie trocken mit Hilfe von einem Stück Papier.
- Re-suspendieren des Zellpellets in 500 & mgr; l Puffer zur Verfügung gestellt und bereiten die magnetische Säule, indem sie in geeigneten Magnetscheider Platzierung gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Bewerben Zellsuspension auf die Säule und sammeln unmarkierten Zellen, die durchlaufen und waschen Säule 3x mit entsprechenden Menge an Puffer (500 ul). Führen Waschschritte durch Zugabe von Puffer dreimal, jedes Mal, wenn die Spalte Behälter leer ist. Sammeln gesamten Ausflusses. Dies ist die unmarkierten, negativen Zellfraktion
- Entfernen Sie die Säule bilden die Magnetscheider und Pipette 1 ml Puffer auf die Säule und sofort spülen Fraktion mit dem magnetisch-Labeled-Zellen, indem Sie den Kolben mit der Säule geliefert Anwendung.
HINWEIS: Isolierte gamma delta T-Zellen sind bereits für durchflusszytometrische Analyse fluoreszenz gefärbt, da magnetisch markierten Anti-Hapten-Mikrokügelchen mit Fluoreszenzfarbstoff FITC konjugiert sind.
- Zellsortierung
- Für Zellsortierung, Etikett Endozervikalzellen mit Lebensfähigkeit sterben und Antikörper-Panel, wie in Kapitel 3 beschrieben.
- Richten Sie elektronische Tore auf dem Live - CD45 + CD3 + und Gamma - Delta - positive Zellen und Zellsortierung durchführen.
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Representative Results
Vor kurzem haben wir analysiert , endocervical intraepitheliale GD - T - Zellen , und wir waren die ersten, über den Verlust von endocervical Gamma - Delta - T - Zellen in HIV - infizierten Frauen 9, 11 zu melden. Hier beschreiben wir das Protokoll zu isolieren und die Teilmenge von endozervikalen gamma delta T-Zellen zu analysieren. Wie in Figur gezeigt ist, kann 1, GD T - Zellen leicht in die menschlichen endozervikalen Zellproben nachgewiesen werden.
Eine einzigartige Population von endocervical Gamma - Delta V1 (GD1) T - Zellen wurde beschrieben multiparametar Zytometrie-basierte Immunophänotypisierung fließen (Abbildung 1). Eine repräsentative Gating - Strategie für HIV uninfizierten endocervical Probe wird in Abbildung 1 dargestellt. Die Analyse wurde durch Einstellen des elektronischen Tor , gefolgt von t auf Forward / Side Scatter (Abbildung 1A) auf die gesamten Endozervikalzellen ausgeführter Ausschluss von Zell Dubletten (1B). Lebensfähige Zellen wurden durch Ausschluss von toten Zellen definiert unter Verwendung von Live / Dead Fixable Yellow Amine Dead Cell Stain (Abbildung 1C). Analyse der CD45 - Expression wurde auf Live - gated - Zellen (1D), durch die Analyse der CD3 - Expression (Figur 1E) gefolgt ausgeführt. Gamma - Delta 1 (GD1) oder Gamma - Delta - 2 (GD2) positive Zellen wurden als Subpopulation von CD3 + Zellen definiert , die GD TCR (TCR Gamma - Delta V1 oder TCR Gamma - Delta V2) zum Ausdruck bringen. Darüber hinaus wurde bestätigt , dass nur CD3 + T - Zellen , da gated CD3 TCR gamma delta express - T - Zellen nicht TCR gamma delta V1 oder V2 delta exprimieren. Die phänotypische Analyse von gated CD3 + GD1 + Zellen zeigte (1G), dass die Mehrheit der GD1 Zellen (~ 74%) sind CD4 - CD8 -.
In der vorliegenden Studie, die Durchführbarkeit der Verwendung von endocervical Bürsten Proben gereinigter intraepitheliale GD T - Zellen durch positive magnetische Selektion wurde nachgewiesen (Abbildung 2).
Abbildung 1: Gamma delta (GD) T - Zell - Subpopulation in Gebärmutterhalsschleimhaut durch Durchflusszytometrie analysiert. Nach Gating - Strategie wurde identifiziert endocervical T - Zell - Populationen verwendet: (A) endocervical Zytobürste Zellen wurden gated nach der Größe und Granularität (FSC, vorwärts Seitenstreuung vs SSC, Seitenstreuung). (B) Cell Dubletten , indem die elektronischen Tore in der FSC-A ausgeschlossen wurden (Bereich) vs SSC-W (Breite). (C) Lebende Zellen sind auf die Lebensfähigkeit Farbstoff-negativen Population gated. (D) wurde elektronisches Tor gesetzt auf Live, CD45 - positive Zellen. (E) Elektronische Tor für positive Zellen CD45 wurde auf CD3 - positiven Zellen eingestellt(F) TCRVD1 (GD1) und TCRVD2 (GD2) Expression wurde auf CD3 + Zellen analysiert. (G) CD4 und CD8 - Expression wurde auf GD1 + -Zellen analysiert. (H) TCRVD1 und TCRVD2 Expression wurde auf gated CD3 - negativen Zellen analysiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Isolierung von endocervical Gamma - Delta - T - Zellen (GD) durch positive magnetische Trennung. Die Häufigkeit der endocervical GD T-Zellen wurde vor und nach der positiven magnetischen Trennung bestätigt. Endozervikale Zellen wurden zunächst mit Anti-TCR Gamma - Delta - Antikörper und dann mit fluoreszenz gefärbt mit Anti-Hapten Microbeads-FITC markiert. Prozent der TCR GD + T-Zellen wurde vor und nach m berichtetagnetic Trennung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Bewertung der weiblichen Genitaltrakts unteren Anfälligkeit Schleimhaut ist ein wesentlicher Bestandteil von klinischen Studien Risiko einer HIV-Erfassung und Übertragung Adressierung. Typischerweise wird FGT Anfälligkeit für eine HIV - Infektion durch Messung löslichen Immunmodulatoren in Genitalsekreten (Zytokine, Chemokine und antimikrobielle Peptide) bewertet 12, 13. Allerdings sind diese Biomarker nur indikativ für vaginale Entzündung, werden von physiologischen und pathologischen Ereignisse beeinflusst, und nicht immer direkte Schädigung der Schleimhaut darstellen. Um unser Verständnis, wie Schleimhaut Faktoren erhöhen das Risiko für die Erfassung und Übertragung von HIV, zellulären Marker der Schädigung der Schleimhaut zu verbessern müssen entwickelt werden. GD intraepitheliale T-Zellen sind in der FGT, intercalate zwischen Epithelzellen und sind gedacht, um beitragen sowie zu einer ersten Verteidigungslinie gegen Umweltprobleme zur Homöostase. GD-T-Zellen haben die poten TiAl eine zusätzliche Biomarker zu bilden Schleimhaut Verwundbarkeit im FGT zu beurteilen.
In diesem Protokoll wird gezeigt, wie intraepitheliale Lymphozyten aus humanem endocervical Cytobrush Probe herzustellen und leicht zu beherrschen. Der kritischste Punkt dieses Verfahrens ist, die Lebensfähigkeit der Zellen durch eine schnelle Verarbeitung der Probe sowie indem die Zellen auf Eis während des gesamten Verfahrens aufrecht zu erhalten. Die Zellausbeute wird auf Zytobürste Sammeltechnik abhängen, Handhabung Geschick sowie den Infektionsstatus (HIV-Infektion oder anderen viralen Infektionen, bakterielle oder Pilzinfektionen). Unsere Gruppe und andere haben verschiedene Studien beschreiben verschiedene Lymphozyten - Populationen im menschlichen Genitaltrakt 9, 14, 15 veröffentlicht. In unseren Händen, kann man endocervical Zytobürste Probe liefern 0,5-5 x 10 6 Zellen mit 80-90% Lebensfähigkeit. Im Vergleich mit der üblicherweise verwendeten Isolationsverfahrenclass = "xref"> 14, 15, durch unser Verfahren wird die Lebensfähigkeit und Zellausbeute erhöht.
Dieses Verfahren stellt ein leistungsfähiges und ein effizientes Werkzeug endocervical intraepitheliale gamma delta T-Lymphozyten zu studieren und Einblick in andere Immunzellen liefern könnte, die zu diesem Fach während einer Infektion und / oder Entzündung wandern. Die in vivo zellulären Zusammensetzung von Schleimhautgewebe ist häufig schwierig , eine umfassende und quantitative Art und Weise zu untersuchen. Techniken wie die Immunhistochemie und Durchflusszytometrie werden durch die Verfügbarkeit von Antigen-spezifischen monoclonalen Antikörpern und durch die geringe Anzahl von parallelen Messungen begrenzt, der auf jeder einzelnen Zelle durchgeführt werden kann. Traditionelle Assays mit hohem Durchsatz, wie Gen-Expressionsarrays, wenn auf ganze Gewebe durchgeführt werden, liefern Informationen über durchschnittliche Genexpression Ebene und kann nur indirekt auf quantitative Veränderungen in der zellulären Subpopulationen korreliert werden.Diese Beschränkungen werden besonders schwer zu überwinden, wenn Minderheiten zu studieren, oder die Zellpopulation, die exklusive Marker fehlen. Durch die Kombination von "fluorescence activated cell sorting" (FACS) und "single-cell-PCR-Gen-expression analysis" kann man ein Hochdurchsatz-Analyse der Transkriptions intraepitheliale GD T-Zellen in Endocervix zuführen. Dieses Verfahren nutzt die Fähigkeit der modernen Durchflusszytometer einzelnen Einzelzellen sortiert werden mit Genauigkeit und Präzision, zusammen mit der Verwendung von mikrofluidischen Technologien hoher Empfindlichkeit gemultiplexten PCR aus winzigen Mengen von mRNA vorzuformen, um dadurch parallele Analyse der Expression von bis zu 96 Gene ermöglichen für jede einzelne Zelle 16.
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Disclosures
Autoren haben keine gewerblichen oder anderen Verein, der einen Interessenkonflikt (zB Pharma Aktienbesitz, Beratung, Beirat Mitgliedschaft, relevante Patente oder Forschungsförderung) darstellen könnten.
Acknowledgments
Wir danken den Studienteilnehmern Miami WIHS für ihre Bereitschaft, an dieser Arbeit teilzunehmen. Die Daten in diesem Manuskript wurden von der Vermittlungs-HIV-Studie Miami gesammelt Frauen (WIHS). Der Inhalt dieser Veröffentlichung sind allein in der Verantwortung der Autoren und nicht die offizielle Position der National Institutes of Health (NIH) darstellen. Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für Allergie und Infektionskrankheiten unterstützt und Vermittlungs-HIV-Infektion Studie Frauen (WIHS) [Gewährungsnummer U01 AI103397], Nationales Institut für Allergie und Infektionskrankheiten, National Institutes of Health [Grant-Nummer P30AI073961], National Center for Advancing Translational Sciences und das Nationale Institut für Minderheiten Gesundheit und Gesundheit Disparitäten, National Institute of Health [Gewährungsnummer UL1TR000460 und 1KL2TR000461] und National Institute of Child Health und Human Development, National Institute of Health [Gewährungsnummer K23HD074489].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
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