Abstract
La femmina tratto riproduttivo (FRT) mucosa sistema immunitario serve come la prima linea di difesa. Una migliore conoscenza della mucosa genitale è quindi essenziale per comprendere la patogenicità dei diversi agenti patogeni, tra cui l'HIV. Gamma Delta cellule (GD) T sono il prototipo delle cellule T "non convenzionali" e rappresentano una parte relativamente piccola sottogruppo di cellule T definite dalla loro espressione dei recettori delle cellule T eterodimeriche (TCR) composte da catene di gamma e delta. Questo li distingue dalle cellule T classici e molto meglio noti CD4 + helper e le cellule CD8 + T citotossici che sono definiti da TCR alfa-beta. cellule T GD spesso mostrano la localizzazione tessuto-specifica e sono arricchiti in epitelio. le cellule T GD orchestrare le risposte immunitarie a infiammazione, la sorveglianza del tumore, malattie infettive, e autoimmunità.
Qui, vi presentiamo un metodo per isolare ed analizzare riproducibile endocervicali intraepiteliale linfociti T GD umani. noi ettarove utilizzati campioni cytobrush endocervicali da donne che partecipano alle donne Interagency HIV Infection Study (WIHS). La conoscenza GD cellule T interazioni durante le condizioni in cui vi è un insulto alla mucosa vaginale potrebbe essere applicata a qualsiasi studio clinico in cui la vulnerabilità della mucosa è rivolta, compreso lo sviluppo di oltre microbicides.In vaginale, la conoscenza di risposte delle cellule della mucosa GD T ha possibilità di applicazione di GD T cell-based terapia immunitaria nel trattamento delle malattie infettive.
Introduction
Abbiamo sviluppato la metodologia di utilizzo di campioni endocervicali pennello per valutare le cellule T GD intraepiteliali. Il canale endocervicale è rivestito da un singolo strato di epitelio colonnare. Linfociti intraepiteliali rappresentano linfociti di prima linea che risiedono all'interno dello strato epiteliale che può rapidamente avviare risposte immunitarie su di incontrare microbi patogeni 7, 8. Comprendere gli eventi immunologici del vano intraepiteliale endocervicale è importante per la progettazione di strategie efficaci per prevenire le infezioni, compreso l'HIV.
Il nostro metodo può essere applicato per i campioni endocervicali umane appena raccolti, nonché le cellule endocervicali congelati per esplorare ulteriormente il ruolo delle cellule T GD intraepiteliale nelle donne con infezione da HIV o a rischio di infezione da HIV. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di scoprire nuovi eventi immunologici nel vano intraepiteliale endocervicale e evaluatle risposte delle cellule T e GD come marker di vulnerabilità della mucosa nelle donne con infezione da HIV.
Le lacune sostanziali nella conoscenza intorno FGT immunità sono in parte a causa della difficoltà di raccolta e l'elaborazione dei campioni delle mucose con successo. Inoltre, il complesso eterogeneità delle cellule immunitarie mucosali, e la loro interconnessione tra loro, sono sfide importanti per identificare misurazioni clinicamente rilevanti che riflettono lo stato e la capacità del sistema immunitario. Abbiamo sviluppato un metodo per ottenere cellule altamente purificate intraepiteliali GD T che possono essere ulteriormente analizzate utilizzando altamente multiplex, tecnologie unicellulari che possono essere critiche per l'identificazione dei meccanismi alla base della FRT immunità.
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Protocol
attività di studio ha avuto luogo presso l'Università di Unità di Ricerca HIV Miami, in collaborazione con l'HIV Interagency Studi delle Donne Miami (WIHS) e il Miami Center for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (Università di Miami Miller School of Medicine) l'approvazione è stata ottenuta prima per il reclutamento e le eventuali procedure di valutazione o di studio correlati.
Raccolta del campione 1. endocervicale Brush
NOTA: I partecipanti sono stati sottoposti a un esame vaginale eseguito da MD addestrato o il ginecologo e la raccolta dei linfociti intraepiteliali sono stati eseguiti in esame con lo speculum inserendo cytobrush.
- caratteristiche dei partecipanti
- Reclutare donne partecipanti che sono tra i 18 ei 45 anni di età, sessualmente attivi, non è incinta e non sui farmaci contraccettivi o con un dispositivo intrauterino.
- Prima di un esame vaginale, hanno i partecipanti sono sottoposti a un pareggio 10 ml di sangue in verdevacutainer eparina top per l'isolamento delle cellule periferiche mononucleate del sangue (PBMC). per servire come controllo per endocervicale analisi intraepiteliale 9.
- Raccolta dei campioni endocervicali
- Inserire uno speculum sterile di dimensioni adeguate in vagina senza lubrificazione. Utilizzare acqua calda per facilitare l'inserimento del speculum e garza sterile per pulire il muco. La posizione del speculum consente la completa visualizzazione del sistema operativo e portio.
- Inserire la spazzola endocervicale nel canale endocervicale fino a quando solo le setole più vicini alla mano sono visibili. Ruotare il pennello in senso orario per 360 °. Trasferire la spazzola in un tubo da 15 ml contenente 5 ml di mezzo IMDM.
- Subito dopo la raccolta, posizionare il tubo contenente cytobrush sul ghiaccio. Per ottenere elevata vitalità delle cellule intraepiteliali raccolti, consegnare il cytobrush al laboratorio e processo entro 1 ora.
- Tubo Vortex contenente cytobrush endocervicale applicare 4 colpi (10 sec) brevi.
- Centrifugare la provetta contenente cytobrush, per 10 min a 250 x g.
- Rimuovere con attenzione il cytobrush dal tubo (non disturbare il pellet sul fondo della provetta) e aggiungere 1 ml di mezzi IMDM e posizionare il tubo in ghiaccio.
- Posizionare il cytobrush sul setaccio cella 100 mm superiore del tubo 50 ml.
- Lavare il cytobrush con 20 ml IMDM.
- provetta da centrifuga per 10 minuti a 250 x g.
- Decantare il surnatante e le cellule in pellet risospendere in 1 ml IMDM e si combinano con il pellet già ri-sospensione descritto in 2.3.
- Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato 10 o contare le cellule utilizzando emocitometro combinando 10 ml di sospensione cellulare con 10 ml di colorante blu trypan. Delicatamente pipettare su e giù dieci volte per mescolare le cellule e colorante. Carico di 10 microlitridella miscela nell'apertura di una delle due camere emocitometro. Contare tutte le celle in cinque aree della griglia. Tenere un conteggio separato delle cellule vitali e non vitali. Determinare la vitalità cellulare utilizzando la seguente formula:% di cellule vitali = cellule non vitali x 100 / totale cellule numero delle cellule.
Determinare la concentrazione successiva cellule per ml (e il numero totale di cellule) usando i seguenti calcoli. Totale cellule per ml = x cellule totali contate (fattore di diluizione / numero di piazza contate) x 10.000 cellule / ml. - Congelare isolate cellule endocervicali utilizzando media congelamento contenente il 10% di DMSO e il 90% FBS.
3. Citometria a Flusso
- Risospendere 1-3 x 10 5 cellule endocervicali in 100 microlitri di buffer FACS (PBS contenente 1% di albumina sierica bovina
- Aggiungere 1 ml / 10 6 Live / Dead fissabile giallo Morto kit cellulare Stain e anticorpi per marcatori di superficie alle concentrazioni descritte nella tabella 1.
- Incubare le cellule per 30 minuti a + 4 ° C, al riparo dalla luce.
- Aggiungere 1 mL FACS tampone e le cellule e provette da centrifuga per 5 min a 350 xg
- Risospendere pellet cellulare in 300 microlitri di 1% paraformaldeide.
- Preparare controlli compensazione utilizzando perline e anticorpi utilizzati per la colorazione aggiungendo 100 ml di tampone FACS e una goccia delle perle e la stessa concentrazione di anticorpi usati per la colorazione del campione.
- Acquisire perline colorate e campioni su un citofluorimetro, dotato di 405 nm, 488 nm e 635 nm laser.
L'isolamento delle cellule 4. endocervicale Gamma Delta T
- Isolamento tallone magnetico
- Risospendere endocervicale pellet cellulare (≤ 10 7 cellule totali), descritto in 2.6, in 40 ml di tampone incluso nel kit di Gamma Delta microperla TCR fa riferimento la tabella di materiali e reagenti.
- Seguire le istruzioni del kit per il protocollo di colorazione in due fasi: in primo luogo, ingegnoh anti-TCR gamma delta Hapten-anticorpo e la seconda, con l'anti-aptenici microsfere-FITC
- Dopo incubazione di 15 min a 4-8 ° C, lavare le cellule aggiungendo 1 ml di tampone e centrifugare a 300 xg per 10 min. Decantare il supernatante invertendo la provetta, e toccare secco con l'aiuto di un foglio di carta.
- Risospendere il pellet cellulare in 500 ml di condizione di buffer e preparare la colonna magnetica ponendolo in separatore magnetico appropriata secondo il protocollo del fornitore.
- Applicare sospensione cellulare nella colonna e raccogliere le cellule senza etichetta che attraversano e lavare colonna 3x con adeguate quantità di tampone (500 mL). Eseguire fasi di lavaggio aggiungendo tampone tre volte, ogni volta dopo il serbatoio colonna è vuota. Raccogliere dell'effluente totale. Questa è la frazione di cellule senza etichetta, negativo
- Rimuovere la colonna formano il separatore magnetico e pipetta 1 ml di tampone sulla colonna e subito scovare frazione con l'etichetta magneticamentecellule cato applicando saldamente lo stantuffo fornita con la colonna.
NOTA: Isolated Gamma Delta cellule T sono già fluorescente macchiato per analisi di flusso-citometria da magneticamente etichettati microsfere anti-aptene sono coniugati con FITC fluorescenti colorante.
- cell sorting
- Per l'ordinamento delle cellule, le cellule endocervicali etichette con Die vitalità e pannello di anticorpi come descritto nel paragrafo 3.
- Impostare varchi elettronici sul vivo, CD45 + CD3 + e delta gamma cellule positive e effettuare una cernita delle cellule.
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Representative Results
Recentemente, abbiamo analizzato intraepiteliale cellule T GD endocervicali e siamo stati il primo a riferire circa la perdita di cellule endocervicale T gamma delta in donne infette da HIV 9, 11. Qui, descriviamo il protocollo per isolare e analizzare il sottogruppo di cellule T gamma delta endocervicale. Come mostrato in figura 1, le cellule T GD possono essere facilmente rilevati nei campioni di cellule endocervicali umane.
Una popolazione unica di cellule endocervicale gamma delta V1 (GD1) T è stata descritta usando multiparametar flusso immunofenotipizzazione citometria a base di (figura 1). Una strategia rappresentante gating per HIV campione endocervicale non infetta è mostrato in Figura 1. L'analisi è stata effettuata su cellule totali endocervicale impostando il cancello elettronico sul scatter Forward / laterale (Figura 1A) seguito da tegli esclusione di doppietti cellulari (Figura 1B). Cellule vitali sono stati definiti per esclusione di cellule morte che utilizzano Live / Dead fissabile giallo Amine Morto Stain cellulare (Figura 1C). Analisi di espressione CD45 è stata effettuata su cellule vive gated (Figura 1D), seguita da analisi dell'espressione CD3 (Figura 1E). Gamma Delta 1 (GD1) o gamma Delta 2 (GD2) cellule positive sono state definite come una sottopopolazione di cellule CD3 + che esprimono GD TCR (TCR gamma delta V1 o TCR Gamma Delta V2). Inoltre, è stato confermato che solo le cellule T CD3 + esprimono TCR gamma delta dal gated CD3 - le cellule T non esprimono TCR gamma delta V1 o V2 delta. L'analisi fenotipica di cellule CD3 + + GD1 gated rivelate (Figura 1G), che la maggior parte delle cellule GD1 (~ 74%) sono CD4 - CD8 -.
Nel presente studio, la fattibilità di utilizzare endocecampioni spazzola rvical alle cellule purificate intraepiteliali GD T di selezione magnetica positiva è stata dimostrata (Figura 2).
Figura 1: Gamma Delta sottopopolazione di cellule (GD) T nella mucosa endocervicale analizzati mediante citometria di flusso. A seguito di strategia di gating è stato utilizzato per le popolazioni di cellule T endocervicale individuate: (A) cellule cytobrush endocervicali sono stati gated a seconda delle dimensioni e la granularità (FSC, side scatter in avanti vs SSC, side scatter). (B) doppietti cellulari sono stati esclusi impostando i varchi elettronici del FSC-A (area) vs SSC-W (larghezza). (C) cellule vive sono gated sulla popolazione colorante negativo vitalità. (D) cancello elettronico è stato impostato su cellule positive, vive CD45. (E) cancello elettronico per cellule positive CD45 è stata data alle cellule positive CD3(F) TCRVD1 (GD1) e TCRVD2 espressione (GD2) è stato analizzato su cellule CD3 +. (G) CD4 e CD8 espressione è stato analizzato su cellule GD1 +. (H) TCRVD1 e l'espressione TCRVD2 è stato analizzato su cellule CD3 negative gated. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'isolamento di cellule T gamma delta endocervicali (GD) di separazione magnetica positivo. Frequenza di cellule T GD endocervicale stata confermata prima e dopo la separazione magnetica positiva. Cellule endocervicali sono stati etichettati con anticorpi anti-TCR gamma delta e poi con fluorescente colorati con anti-aptene microsfere-FITC. Percentuale di cellule T TCR GD è stato segnalato prima e dopo mseparazione agnetica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Valutazione della vulnerabilità femminile della mucosa del tratto genitale inferiore è una componente essenziale di studi clinici che affrontano il rischio di acquisizione e trasmissione del virus HIV. Tipicamente FGT vulnerabilità alle infezioni da HIV è valutata misurando immunomodulatori solubili nelle secrezioni genitali (citochine, chemochine e peptidi antimicrobici) 12, 13. Tuttavia, questi marcatori sono solo indicative di infiammazione vaginale, sono influenzati da eventi fisiologici e patologici, e non sempre rappresentano un danno diretto della mucosa. Al fine di migliorare la nostra comprensione di come i fattori della mucosa aumentano il rischio di contrarre e trasmettere l'HIV, marcatori cellulari di danno della mucosa devono essere sviluppate. cellule GD intraepiteliale T sono presenti nella FGT, intercalate tra le cellule epiteliali, e si ritiene contribuiscano alla omeostasi nonché ad una prima linea di difesa contro sfide ambientali. le cellule T GD hanno il poten ziale a costituire un biomarker aggiuntivo per valutare la vulnerabilità della mucosa nella FGT.
In questo protocollo, si è mostrato come preparare linfociti intraepiteliali dal campione cytobrush endocervicale umano ed è facilmente masterizzato. Il punto più critico di questo processo è quello di mantenere la vitalità cellulare mediante elaborazione veloce del campione e mantenendo le cellule in ghiaccio durante l'intera procedura. La quantità di cellule dipenderà tecnica di raccolta cytobrush, manipolazione giocata nonché lo stato infettiva (infezione da HIV o altre infezioni virali, batteriche o infezioni fungine). Il nostro gruppo e altri hanno pubblicato diversi studi che descrivono le diverse popolazioni di linfociti nel tratto genitale umano 9, 14, 15. Nelle nostre mani, un campione cytobrush endocervicale può fornire 0,5-5 x 10 6 cellule con 80-90% la vitalità. In confronto con il metodo di isolamento comunemente usatoclass = "xref"> 14, 15, dal nostro metodo la resa vitalità e cellule aumenta.
Questo metodo fornisce un potente e uno strumento efficace per lo studio endocervicali intraepiteliale gamma delta linfociti T e potrebbe fornire una visione in altre cellule immunitarie che migrano a questo comparto durante l'infezione e / o infiammazione. La composizione in vivo di cellule mucose è spesso difficile indagare in modo completo e quantitativa. Tecniche come immunoistochimica e citofluorimetria sono limitate dalla disponibilità di antigene specifici anticorpi monoclonali e dal piccolo numero di misurazioni parallele che può essere eseguita su ogni singola cella. saggi high-throughput tradizionali, come gli array di espressione genica, se eseguito sui tessuti interi, forniscono informazioni sul livello medio di espressione genica, e possono essere solo indirettamente correlate alle modifiche quantitative in sottopopolazioni cellulari.Queste limitazioni diventano particolarmente difficili da superare quando si studia la minoranza della popolazione, o la popolazione di cellule che mancano i marcatori esclusivi. Grazie alla combinazione di "fluorescenza cell sorting attivato" (FACS) e "cella singola analisi PCR di espressione genica" si può eseguire un high-throughput analisi trascrizionale delle cellule intraepiteliali GD T in endocervice. Questo metodo sfrutta la capacità dei moderni citometri a flusso per ordinare singole celle singole con accuratezza e precisione, insieme con l'uso di tecnologie microfluidica preformare elevata sensibilità multiplato PCR da piccole quantità di mRNA, consentendo così analisi parallela dell'espressione di fino a 96 geni per ogni singola cella 16.
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Disclosures
Gli autori non hanno commerciale o di altra associazione che potrebbe rappresentare un conflitto di interesse (ad esempio, magazzino farmaceutico di proprietà, di consulenza, l'appartenenza Advisory Board, brevetti rilevanti, o finanziamenti per la ricerca).
Acknowledgments
Ringraziamo i partecipanti allo studio Miami WIHS per la loro disponibilità a partecipare a questo lavoro. I dati in questo manoscritto sono stati raccolti dalle donne Miami Interagency HIV Study (WIHS). I contenuti di questa pubblicazione sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano le posizioni ufficiali del National Institutes of Health (NIH). Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Allergy e Malattie infettive e Interagency HIV Infection Study femminile (WIHS) [concessione numero U01 AI103397], National Institute of Allergy e Malattie infettive, National Institutes of Health [codice di autorizzazione P30AI073961], Centro Nazionale per l'avanzamento traslazionale Scienze e l'Istituto nazionale sulla minoranza Salute e disparità, Istituto nazionale della Salute [codice di autorizzazione UL1TR000460 e 1KL2TR000461], e National Institute of Child Health e lo sviluppo umano, National Institute of Health [codice di autorizzazione K23HD074489].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
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