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Immunology and Infection

मूल्यांकन करने के लिए एक Monocyte Monolayer परख का उपयोग Fcγ रिसेप्टर की मध्यस्थता Phagocytosis

Published: January 2, 2017 doi: 10.3791/55039
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services

Protocol

अनुसंधान नैतिकता बोर्ड / संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा मानव नमूनों के उपयोग के लिए अनुमोदन प्राप्त है, और सभी मानव दाताओं से हस्ताक्षरित सहमति प्राप्त करते हैं। एमएमए भी पशु का उपयोग नैतिकता मंजूरी के बाद मानव परख के रूप में एक समान तरीके से माउस PBMCs का उपयोग किया जा सकता है। एमएमए मम्मियाँ टिशू कल्चर तकनीक का इस्तेमाल करता।

नोट: चित्रा 1 देखें।

नोट: हालांकि हम सड़न रोकनेवाला तकनीक बनाए रखने के लिए, के रूप में विधि केवल एक "अल्पकालिक" संस्कृति विधि है परख के दौरान एक स्तर 2 biocontainment कैबिनेट के उपयोग की सलाह देते हैं, वहाँ वास्तव में पर्याप्त समय बैक्टीरिया परख को दूषित करने के लिए नहीं है। इसलिए, यदि एक स्तर 2 biocontainment कैबिनेट मौजूद नहीं है, के बजाय सिर्फ इस परख के लिए एक खरीद, परख एक biocontainment कैबिनेट के बाहर, एक खुला बेंच पर प्रदर्शन किया जा सकता है। 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर का उपयोग करते हैं, हालांकि, एक विकल्प नहीं है और के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएइष्टतम परिणाम है।

1. परिधीय रक्त mononuclear सेल अलगाव

  1. एक स्वस्थ दाता या एसिड साइट्रेट-डेक्सट्रोज (एसीडी) थक्कारोधी (पीले शीर्ष ट्यूब) युक्त वैक्यूटेनर का उपयोग कर venipuncture के माध्यम से एक मरीज से मानव पूरे रक्त प्राप्त करते हैं।
    नोट: पूरे रक्त अगले कदम के लिए 11 आगे बढ़ने से पहले अप करने के लिए 36 घंटे के लिए कमरे के तापमान (18-22 डिग्री सेल्सियस) पर एसीडी में संग्रहित किया जा सकता है। आम तौर पर, 1-2 पूरे रक्त के 10 एमएल Vacutainer नलियों परख के लिए पर्याप्त हैं।
  2. पूरे रक्त पतला 1: 1 v / गर्म पूरा RPMI माध्यम में वी (RPMI 1640 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 20 मिमी HEPES, और 0.01 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन के साथ पूरक)।
  3. पतला पूरे रक्त से परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग, के रूप में निर्माता से सिफारिश की पृथक (सामग्री की सूची देखें)। घनत्व ढाल से ज्यादा पतला खून परत बहुत धीरे से (कमरे के तापमान 18-22 डिग्री सेल्सियस तक गर्म)।
    नोट: Mixi की मात्रा को कमध्यान से एक dropwise फैशन में रक्त मिश्रण लेयरिंग द्वारा या एक पिपेट का उपयोग करके रक्त का इष्टतम जुदाई के लिए इंटरफेस में एनजी।
    1. रक्त मिश्रण धीरे धीरे pipet टिप घनत्व ढाल के करीब रखने से और बहुत धीरे धीरे ट्यूब की ओर नीचे चलाने के लिए रक्त मिश्रण को सक्षम करने से घनत्व ढाल के शीर्ष पर परत करने की अनुमति दें।
    2. एक 50 एमएल में प्रयोग के पैमाने पर, परत (15 एमएल ट्यूब में) घनत्व ढाल के 3 एमएल के शीर्ष पर खून के मिश्रण या परत घनत्व ढाल (के 15 एमएल के शीर्ष पर खून के मिश्रण के 35 एमएल के 10 एमएल पर निर्भर करता है ट्यूब)। आमतौर पर, पूरे रक्त के 10 एमएल 10 लाख PBMCs पैदावार, कुछ दाता करने वाली दाता बदलाव के साथ।
      नोट: यह बहुत महत्वपूर्ण घनत्व ढाल के साथ खून मिश्रण का कोई मिश्रण है कि वहाँ है। रक्त मिश्रण घनत्व ढाल के ऊपर परत चाहिए और धीरे धीरे वृद्धि जब तक सभी रक्त घनत्व ढाल के शीर्ष पर है।
    3. ब्रेक के बिना 30 मिनट के लिए 700 XG पर बहुस्तरीय मिश्रण अपकेंद्रित्र। centrप्लाज्मा, बफी कोट (PBMCs युक्त), घनत्व ढाल सामग्री, granulocytes, और लाल रक्त कोशिकाओं: ifuged मिश्रण 5 परतों (ऊपर से नीचे तक) में अलग होना चाहिए।
    4. निकालें और प्लाज्मा के बहुमत त्यागने और ध्यान से एक पाश्चर विंदुक और एक सक्शन बल्ब का उपयोग कर एक नया 15-एमएल ट्यूब में बफी कोट (PBMC) सामग्री निकालते हैं।
      नोट: बफी कोट परत को हटाने के लिए प्रभावी ढंग से ट्यूब के खिलाफ पिपेट की नोक के साथ, जबकि परत के बाहर चारों ओर एक परिपत्र गति प्रदर्शन पाश्चर विंदुक पर सक्शन लागू करने, द्वारा किया जाता है।
  4. 350 XG पर (पूर्ण ब्रेक के साथ) washes के बीच में 10 मिनट के लिए centrifuging द्वारा पृथक PBMCs पीएच 7.3 फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में तीन बार धोएं। पूरा RPMI माध्यम में PBMC गोली Reconstitute। गोली के आकार पर निर्भर करता है, मध्यम के 3-7 एमएल पर्याप्त है।
  5. trypan नीले और एक hemocytometer का उपयोग PBMC गणना। केवल उन कोशिकाओं है कि trypan नीले रंग से दाग नहीं कर रहे हैं गिनती। Reconstitutई 1,750,000 कोशिकाओं / एमएल के लिए PBMCs पूरा RPMI माध्यम में।
  6. बीज 400 एक 8 चैम्बर स्लाइड के प्रत्येक कुएं में μL (700,000 कोशिकाओं)। एक 37 डिग्री सेल्सियस, पूरी तरह से humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में स्लाइड सेते monocyte / मैक्रोफेज पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए (5% सीओ 2 के साथ पूरक)।

2. पालन monocytes के पूर्व उपचार

नोट: यह कदम केवल आवश्यक है अगर तरीके रोकना या phagocytosis को बढ़ाने के लिए देख रहे हैं।

  1. पूर्व इलाज हित के किसी भी दवा (ओं) या यौगिक (एस) के साथ monocytes पालन किया। पूरा RPMI माध्यम का उपयोग कर वांछित एकाग्रता के लिए दवा (ओं) या अन्य परीक्षा सामग्री Reconstitute।
    नोट: उदाहरण के लिए, 200 माइक्रोग्राम / IVIG एमएल आम तौर पर जब मानव monocytes का उपयोग कर phagocytosis की एक 95-100% निषेध उपज के लिए प्रयोग किया जाता है।
  2. महाप्राण और 1-एच ऊष्मायन (1.6 कदम के बाद) के बाद 8 चैम्बर स्लाइड से किसी भी गैर पक्षपाती कोशिकाओं से युक्त सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 400 के साथ बदलेंएक दवा या अन्य उपचार के μL और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    1. जब श्वास और 8 चैम्बर स्लाइड में समाधान की जगह है, ताकि कमजोर पालन कोशिकाओं लिफ्ट बंद नहीं करते तरल पदार्थ के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए सुनिश्चित करें। इसके अलावा, एक समय में केवल 2-3 खाली कुओं के साथ काम करते हैं और कुओं सूखने से बचें।
      नोट: आमतौर पर, प्रत्येक उपचार तकनीकी triplicates में किया जाता है।

3. opsonization आर के 2 2 आर लाल रक्त कोशिकाओं

नोट: 2 आर आर 2 यहां इस्तेमाल किया रक्त संग्रह केंद्र (कनाडा के रक्त सेवा) से प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन वे भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। Opsonized 2 आर आर 2 लाल रक्त कोशिकाओं FcγR की मध्यस्थता phagocytosis के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। भोले 2 आर आर 2 1 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर Alsever का समाधान (शेल्फ जीवन को लम्बा करने के लिए) में संग्रहित किया जाना चाहिए। Alsever के समाधान के लिए घर में बनाया गया है और 0.8 से बना हैw% / वी trisodium साइट्रेट (dihydrate), 1.9% w / v डेक्सट्रोज, 0.42% w / v सोडियम क्लोराइड, और 0.05% w / v साइट्रिक एसिड (monohydrate)। अगर 2 आर आर 2 कोशिकाओं उपलब्ध नहीं है, इस तरह के रूप में आर 1 2 आर, आर 1 आर 1, आर आर 1, या 2 आर आर, इस्तेमाल किया जा सकता अन्य आरएच phenotyped कोशिकाओं, कर रहे हैं।

  1. धो 2 आर आर 2 (सीडीई / सीडीई) 5 मिनट प्रत्येक के लिए 350 XG पर centrifugation का उपयोग कर तीन बार की कुल पीबीएस में लाल रक्त कोशिकाओं।
    नोट: जरूरत लाल रक्त कोशिकाओं की राशि प्रयोगात्मक आकार पर निर्भर करता है और बैक की गणना की जा सकती है। हमेशा की तरह, लाल रक्त कोशिकाओं की एक अतिरिक्त राशि धोने के बाद से लाल रक्त कोशिकाओं को सेल करने के लिए या सतह पर तैरनेवाला के हटाने के दौरान की वजह से प्रत्येक धोने के दौरान खो रहे हैं। उदाहरण के लिए, 5 उपचार और 2 नियंत्रण, सभी तकनीकी triplicates में आयोजित के साथ एक प्रयोग में, वहाँ 21 कुओं की कुल है। 400 μL / अच्छी तरह से 1.25% आरबीसी मिश्रण के साथ 21 कुओं को इंगित करता है कि पैक के 105 μL, opsonized आरबीसी की जरूरत है। 200 आरबीसी की μL शुरू में धोया जाना चाहिए और 150 & #181, एल सुनिश्चित करने के लिए वहाँ phagocytosis कदम के लिए लाल रक्त कोशिकाओं की एक पर्याप्त राशि है कि opsonized किया जाना चाहिए।
  2. 1 से धोया 2 आर आर 2 गोली Opsonize: मानव सीरम से 1 वी / वी पॉलीक्लोनल विरोधी डी एंटीबॉडी और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं, रुक-रुक कर मिश्रण के साथ।
    नोट: पॉलीक्लोनल विरोधी डी एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं, तो यह मोनोक्लोनल विरोधी डी एंटीबॉडी, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, या विरोधी-डी है कि सामान्य रूप से आरएच प्रतिरक्षा रोकथाम के लिए प्रयोग किया जाता है, जो रक्त बैंकों या आधान से प्राप्त किया जा सकता का उपयोग करना संभव है सेवाएं। अनुकूलन परीक्षण, शुरुआत में आयोजित किया जाना चाहिए जब परख की स्थापना, और जब भी संयुक्त राष्ट्र के titered पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के बहुत सारे स्विचन या एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए स्विचन। इस इष्टतम एकाग्रता या विरोधी-डी की मात्रा एक antiglobulin टेस्ट (आई ए टी) 3 + 4 + और और बीच 100 monocytes गिना प्रति 70-90 के बीच फैगोसाइटोसयुक्त लाल रक्त कोशिकाओं की एक phagocytosis परिणाम के परिणाम के लिए आवश्यक की पहचान है।
  3. opsonize धोडी आर 2 आर 2 पीबीएस में तीन बार की कुल 5 मिनट प्रत्येक के लिए 350 XG पर centrifugation का उपयोग।
    नोट: 2 आर आर 2 के सफल opsonization एक अप्रत्यक्ष आई ए टी प्रदर्शन से इस बात की पुष्टि की जा सकती है। संक्षेप में, माध्यमिक पॉलीक्लोनल विरोधी मानव एंटीबॉडी आरबीसी सतहों पर प्राथमिक opsonizing एंटीबॉडी के लिए बाध्य करने के लिए जोड़ रहे हैं, और परिलक्षित संकेत hemagglutination के रूप में मनाया जा सकता है। एक विस्तृत निर्माता प्रोटोकॉल पूरक सामग्री फ़ाइल में पाया जा सकता है।
  4. 1.25% वी / वी पूरा RPMI माध्यम का उपयोग करने के लिए धोया 2 आर आर 2 गोली Reconstitute।
    नोट: अतिरिक्त opsonized 2 आर आर 2 एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर Alsever के समाधान में संग्रहित किया जा सकता है।

4. एफसी रिसेप्टर की मध्यस्थता Phagocytosis

  1. 8-चैम्बर स्लाइड से दवा या मध्यम सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 1.25% वी / वी आर 2 आर 2 मिश्रण के 400 μL जोड़ें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. पिछाड़ीएर ऊष्मायन के 2 घंटे, निर्माता के एडेप्टर का उपयोग कर कक्षों को हटा दें। एक कागज तौलिया पर बंद थपका अतिरिक्त 2 आर आर 2। सुनिश्चित करें कि स्लाइड बाहर सूखा नहीं है सुनिश्चित करें।
  3. पीबीएस के साथ एक 100 एमएल बीकर भरें। डूब और धीरे धीरे संयुक्त राष्ट्र के phagocytosed 2 आर आर 2 के बहुमत को दूर करने के लिए आगे और पीछे (30-40 स्ट्रोक के आसपास) स्लाइड ले जाकर स्लाइड धो लें।
  4. पीबीएस से स्लाइड निकालें। एक कागज तौलिया या ऊतक और का उपयोग कर अतिरिक्त पीबीएस बंद थपका स्लाइड हवा सूखी।
  5. 45 एस के लिए 100% मेथनॉल में हवा सूखे स्लाइड को ठीक करें। फिर, तय स्लाइड हवा सूखी।
    नोट: स्लाइड एक और तरीका है कि इस तरह के Grünwald-Giemsa दाग 21 या राइट Giemsa दाग 22 के रूप में नीचे की ओर धुंधला के लिए अधिक संगत है, का उपयोग करते हुए तय किया जा सकता है।
  6. एक घर में कर दिया है, elvanol बढ़ते मध्यम (या किसी अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बढ़ते मध्यम) और जोड़ने coverslips का उपयोग स्लाइड माउंट।
    नोट: Elvanol बढ़ते मध्यम डब्ल्यू / वी पो 15% से बना हैlyvinyl शराब राल और पीबीएस में 30% वी / वी ग्लिसरीन। मिश्रण गरम किया जाता है जब तक सभी राल भंग कर दिया है और ग्लिसरीन homogenously मिश्रित है। यह अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बढ़ते मध्यम के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  7. माउंट मात्रा का ठहराव से पहले रात भर सूखे की अनुमति दें।

5. phagocytosis की मात्रा

  1. एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप और एक 40x उद्देश्य लेंस का प्रयोग, मैन्युअल कम से कम 200 monocytes और इन monocytes भीतर phagocytosed 2 आर आर 2 की संख्या की गणना के द्वारा phagocytic घटनाओं की राशि यों। एक हाथ में एक काउंटर एक साथ monocytes की संख्या और phagocytosed 2 आर आर 2 की संख्या यों किया है।
  2. Monocytes की संख्या से phagocytosed 2 आर आर 2 की संख्या को विभाजित और 100 एक्सप्रेस मतलब (SEM) के मानक त्रुटि ± मतलब के रूप में डेटा (औसत phagocytic सूचकांक) से गुणा करके औसत phagocytic सूचकांक प्राप्त करते हैं।

Representative Results

चित्रा 1 और प्रक्रिया ऊपर उल्लिखित में महत्वपूर्ण चरणों का पालन करके, एमएमए reproducibly किया जा सकता है। IVIG चित्रा 2 में phagocytosis के निषेध के लिए एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। IVIG बाँध और एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए, इस प्रकार phagocytosis के बहाव के परिणाम बाधा जाना जाता है। इस्तेमाल किया IVIG की राशि titrating करके, एक खुराक पर निर्भर निषेध मनाया जाता है, जिसमें 200 माइक्रोग्राम / एमएल 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल नीचे 100% निषेध के करीब है और सांद्रता में हुई सब (2A चित्रा) में बाधित नहीं किया ऊपर सांद्रता। Phagocytic सूचकांकों तब्दील हो और 0% निषेध, 3 ग्राम की एक आईसी 50 / एमएल निर्धारित किया जा सकता है (चित्रा 2 बी) के साथ एक निषेध वक्र के रूप में 2 आर आर 2 सकारात्मक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं।

लगातार परख प्रदर्शन के अलावा quantificaपरख की tion कभी कभी बहुत मुश्किल हो सकता है। चित्रा 3 विभिन्न एमएमए स्लाइड के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवियों का एक संग्रह है। माइक्रोस्कोपी के अनुभव के साथ, एक एक दूषित आरबीसी (चित्रा 3 डी), या एक फैगोसाइटोसयुक्त आरबीसी (3B चित्रा) से एक कोटर से एक एककेंद्रकश्वेतकोशिका भेद कर सकते हैं। कोशिकाओं और / या मलबे के घने समूहों मात्रा का ठहराव (आंकड़े 3E और एफ) के दौरान से बचा जाना चाहिए। इसके अलावा, एक से बचना चाहिए ओवर-opsonizing 2 आर आर 2 आरबीसी, जो बढ़ phagocytosis कि एककेंद्रकश्वेतकोशिका आंतरिक overcrowds और सटीक मात्रा का ठहराव (चित्रा 3 सी) के साथ हस्तक्षेप करने के लिए नेतृत्व करेंगे।

आकृति 1
चित्रा 1. एमएमए के योजनाबद्ध आरेख। एक कदम-दर-कदम एमएमए में महत्वपूर्ण कदम का चित्रण: पूरे रक्त से PBMC को अलग-थलग, पालन monocyt खिलासाथ opsonized 2 आर आर 2, और चैम्बर स्लाइड धोने तों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. अंतःशिरा आईजीजी (IVIG) एमएमए का उपयोग कर इन विट्रो में phagocytosis को रोकता है। IVIG phagocytosis को बाधित करने के लिए जाना जाता है और मानव एमएमए में एक अवरोध नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। (ए) IVIG का अनुमापन phagocytosis की एक खुराक पर निर्भर निषेध के परिणामस्वरूप जब इलाज 2 आर आर 2 नियंत्रण की तुलना में। परिणाम मतलब एन = 3 प्रयोगों के (SEM) के मानक त्रुटि ± मतलब दिखा। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र टी -Test का उपयोग किया गया था: ** P≤0.01 और *** P≤0.001। (बी) के एक आईसी 50 ओ के साथ IVIG का निषेध वक्रएफ 3 माइक्रोग्राम / एमएल (बिंदीदार रेखा)। परिणाम इलाज 2 आर आर 2 (0% निषेध) के लिए सामान्यीकृत डेटा दिखाने; एन = 3 प्रयोगों के ± SEM मतलब है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 40x बढ़ाई के तहत नमूना स्लाइड के 3. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवियों। (ए) सही स्लाइड जिसमें monocytes औसत (एक विशिष्ट प्रभामंडल चमक के साथ काला तीर) पर phagocytosed 1-2 2 आर आर 2, बहुत कुछ contaminating, संयुक्त राष्ट्र के फैगोसाइटोसयुक्त आर 2 पृष्ठभूमि (सफेद तीर) में आर 2 के साथ। (बी) के रूप में इस स्लाइड में दिखाया गया है, monocytes कभी कभी बढ़ा है रिक्तिकाएं (सफेद तीर), जो फैगोसाइटोसयुक्त 2 आर आर 2 के लिए गलत हो सकता है। (सी </ strong>) जब 2 आर आर 2, अधिक opsonized 4-5 से अधिक phagocytosed 2 आर आर 2 एककेंद्रकश्वेतकोशिका प्रति (काला तीर किया गया है) प्रस्तुत करना सटीक मुश्किल गिनती, क्योंकि 2 आर आर 2 monocyte और विशिष्ट कोशिका के भीतर भीड़ कर रहे हैं सीमाओं को प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। (डी) स्लाइड की अपर्याप्त धोने प्रचुर मात्रा में 2 आर आर 2 संदूषण (सफेद तीर), जो लाल रक्त कोशिकाओं पालन के लिए गलत हो सकता है की ओर जाता है। (ई) कभी कभी, monocytes और दूषित लाल रक्त कोशिकाओं समूहों के रूप में हो सकती है। क्लस्टर भी जीवाणु संक्रमण है, जो बचा जाना चाहिए संकेत मिलता है। (एफ) Monocytes बड़ा समुच्चय है, जो मात्रा का ठहराव के दौरान से बचा जाना चाहिए हो सकता है। देखने के लिए खेतों की यादृच्छिक चयन का प्रयोग, पैनल क्या आम तौर पर मनाया जाता है, तो एमएमए ठीक से प्रदर्शन किया गया है। स्केल बार 20 माइक्रोन है। कृपया यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

Discussion

एमएमए एक थका देने वाली तकनीक है कि दोनों टिशू कल्चर और माइक्रोस्कोपी में विशेषज्ञता की आवश्यकता है। वहाँ सफलता सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) एककेंद्रकश्वेतकोशिका monolayer की पीढ़ी; 2) लाल रक्त कोशिकाओं की opsonization, और 3) मैनुअल मात्रा का ठहराव। एककेंद्रकश्वेतकोशिका monolayer चैम्बर स्लाइड करने के लिए बहुत दृढ़ता से पालन नहीं करता है, तो शारीरिक पीएच परख 11 भर में बनाए रखा जाना चाहिए और PBMCs की एक पर्याप्त संख्या वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए। जोरदार pipetting, जो पालन कोशिकाओं परेशान हो सकता है, बचा जाना चाहिए। एक दृष्टिकोण हमेशा हटाने और चैम्बर के एक ही कोने से समाधान जोड़ सकते हैं और यह सुनिश्चित करने के लिए कि गति धीमी और स्थिर है करने के लिए है। इसी तरह, अंतिम चरण धोने के अतिरिक्त लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के दौरान, आंदोलन धीमी और स्थिर होना चाहिए। यह जबकि अभी भी संयुक्त राष्ट्र के phagocytosed लाल रक्त कोशिकाओं के बहुमत को हटाने monolayer करने के लिए कम से कम अशांति सुनिश्चित करता है। अपर्याप्त धोने contaminating लाल रक्त कोशिकाओं के एक उच्च पृष्ठभूमि, जो मैनुअल योग्यता के रूप में आता है को बढ़ावा मिलेगाntification मुश्किल है। दूसरे, 2 आर आर 2 लाल रक्त कोशिकाओं को पर्याप्त phagocytosis नियंत्रण के लिए 80-120 के एक औसत phagocytic सूचकांक प्राप्त करने के लिए opsonized किया जाना चाहिए। यह वांछित phagocytic रेंज गिनती की आसानी के बीच एक संतुलन बनाता है (उदाहरण के लिए, अधिक से अधिक 5 से monocytes phagocytosed लाल रक्त कोशिकाओं को सही अंदाजा लगाना मुश्किल कर रहे हैं) और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए phagocytosis की एक पर्याप्त राशि को बनाए रखने। opsonization की डिग्री एक आई ए टी द्वारा की पुष्टि की जा सकती है, और 4 + 3 + करने के बीच एक पढ़ने की जरूरत है। 2 आर आर 2 लाल रक्त कोशिकाओं जब वहाँ धोने के दौरान अतिरिक्त सेल है, जब सतह पर तैरनेवाला गहरे लाल रंग बदल जाता है, या खारिज किया जाना चाहिए phagocytosis में एक महत्वपूर्ण कमी भंडारण में कोशिकाओं की उम्र बढ़ने के कारण प्रयोगों में मनाया जाता है। अन्त में, मैनुअल माइक्रोस्कोप का उपयोग मात्रा का ठहराव, खासकर जब प्रयोगशाला कर्मियों के बीच और प्रयोगों के बीच में गिना जाता है की तुलना, मुश्किल हो सकता है। अच्छी तरह से प्रत्येक पर एक ही क्षेत्र की जांच करके, या बस अधिक कोशिकाओं की गणना के द्वाराएक और अधिक सुसंगत गिनती प्राप्त किया जा सकता है। साइड-बाई-साइड एक अनुभवी तकनीशियन और प्रशिक्षण स्लाइड के एक नामित सेट के उपयोग के साथ प्रशिक्षण की सिफारिश की है।

एमएमए के एक प्रमुख आलोचक मैनुअल मात्रा का ठहराव कदम की आत्मीयता है। हालांकि, पर्याप्त प्रशिक्षण के साथ, स्थिरता विभिन्न काउंटरों भर में प्राप्त किया जा सकता है। एक और सीमा 2 आर 2 सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति के स्तर है, जो डेटा बदलाव का एक स्रोत है जब मानव नमूनों के साथ काम कर रहा है monocyte phagocytic क्षमताओं में और अनुसंधान में आंतरिक दाता करने वाली दाता मतभेद है।

अन्य वैकल्पिक तकनीकों FcγR की मध्यस्थता phagocytosis की जांच के लिए उपलब्ध हैं। वाणिज्यिक किट के बहुमत phagocytosis की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट उत्पादन का उपयोग (जैसे, bioparticles, पीएच के प्रति संवेदनशील प्रतिदीप्ति प्रोटीन, या आईजीजी लेबल फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती)। फ्लोरोसेंट उत्पादन का उपयोग अधिक उद्देश्य मात्रा का ठहराव की पेशकश करता है, लेकिन एक भी चुनाव करने की जरूरत हैदोबारा उपलब्धता, लागत, और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या एक प्रवाह कोशिकामापी, साथ ही व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट पर आगामी निर्भरता के इस्तेमाल से जुड़े प्रशिक्षण।

अंत में, इस परख अनुसंधान प्रश्न के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जब phagocytosis की दवा निषेध का परीक्षण, monocytes पूर्व में इलाज किया जा सकता है या तो या दोनों दवाओं और opsonized लाल रक्त कोशिकाओं (यानी, एक प्रतियोगिता परख) के साथ सह-incubated। विभिन्न उपप्रकार, chimeric एंटीबॉडी, या पुनः संयोजक निर्माणों की एंटीबॉडी के बहाव के संकेत भी परीक्षण किया जा सकता है। एक सार्वभौमिक प्रतिजन अशक्त रक्त 24 के विकास में हाल ही में सफलताओं के साथ, एमएमए का आकलन करने के लिए वहाँ वास्तव में phagocytosis ट्रिगर में एक कम प्रभावकारिता है कि क्या विभिन्न एंटीबॉडी के साथ इन प्रतिजन अशक्त लाल रक्त कोशिकाओं की प्रारंभिक स्क्रीन में उपयोग किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers BD REF364606
RPMI 1640 Sigma R8758
HEPES Bioshop HEP003.100
Fetal bovine serum Multicell  080150
Gentamicin Gibco 15710-64
Ficoll-Paque PLUS GE 17-1440-03 https://www.gelifesciences.com/
Phosphate buffered saline Sigma D8537
8-chamber slides Lab-Tek-ll 154534
R2R2 (cDE/cDE) red blood cells Canadian Blood Services Commercially available (e.g., http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
Polyclonal anti-D from human serum Gamma Biologics DIN 02247724 Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin
100% methanol Caledon 6700-1-42
Polyvinyl alcohol resin Sigma P8136 Can be substituted with commercially available mount
UltraPure glycerine Invitrogen 15514-011
Cover slips VWR 48366 067
Novaclone anti-IgG Immucorgamma 5461023 Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 119 phagocytosis एककेंद्रकश्वेतकोशिका मैक्रोफेज एफसी रिसेप्टर्स एंटीबॉडी opsonization,
मूल्यांकन करने के लिए एक Monocyte Monolayer परख का उपयोग Fcγ रिसेप्टर की मध्यस्थता Phagocytosis
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Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a… More

Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis. J. Vis. Exp. (119), e55039, doi:10.3791/55039 (2017).

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