Protocol
研究倫理委員会/機関審査委員会によるヒト試料の使用の承認を取得し、すべてのヒトのドナーから署名された同意を得ます。 MMAは、動物用倫理承認以下、人間のアッセイと同様に、マウスのPBMCを使用して行うことができます。 MMAは、無菌の組織培養技術を利用します。
メモ： 図1を参照してください。
注：我々は方法が唯一の「短期」とは、培養法であるとして、無菌技術を維持するために、アッセイ中にレベル2生物学的封じ込めのキャビネットを使用することをお勧めしますが、細菌がアッセイを汚染するため、実際に十分な時間がありません。したがって、レベル2の生物学的封じ込めキャビネットが存在するだけではなく、このアッセイのためにいずれかを購入していない場合、アッセイはオープンベンチに、生物学的封じ込めキャビネットの外で行うことができました。 5％CO 2で37℃のインキュベーターの使用は、しかしながら、オプションではなく、使用しなければなりません最適な結果を得ます。
1.末梢血単核細胞の単離
- 健康なドナーまたは酸 - クエン酸 - デキストロース（ACD）抗凝固剤（黄色のトップチューブ）を含むバキュテナーを使用して静脈穿刺を介して患者からのヒト全血を取得します。
注記：全血を、次のステップ11に進む前に、最大36時間、室温（18~22℃）でACDに格納することができます。通常は、全血の1-2 10-mLの真空採血管は、アッセイのために十分です。 - 暖かい完全RPMI培地中で1 V / V（RPMI-1640は、10％ウシ胎児血清、20mMのHEPES、0.01ミリグラム/ mlのゲンタマイシンを補充した）全血1に希釈します。
- 製造業者によって推奨されるように（材料のリストを参照）、密度勾配遠心分離を用いて希釈した全血から末梢血単核細胞（PBMC）を単離します。 （室温に加温し、18-22℃）で密度勾配上で非常にゆっくりと希釈した血液をレイヤ。
注：ミクシィの量を最小限に抑えます慎重に滴下様式で血液混合物を積層することによってまたはピペットを用いて、血液の最適分離するためのインタフェースでngの。- 血液混合物をゆっくりと密度勾配の近くにピペットチップを配置することにより、非常にゆっくりとチューブの側面を下に実行するために血液混合物を可能にすることによって、密度勾配の上部を上に層を許可します。
- 実験の規模に応じて、50ミリリットルの濃度勾配の15ミリリットルの上に密度勾配の3ミリリットル（15 mLチューブ内）または血液混合物の層を35mLの上に血液混合物の層を10mL（チューブ）。一般的に、全血10mLのは、いくつかのドナーへのドナーの変動で、千万のPBMCをもたらします。
注：これは、密度勾配と血液混合物のない混合が存在しないことが非常に重要です。血液混合物は、密度勾配を超える層と、すべての血液が密度勾配の上になるまでゆっくりと上昇する必要があります。 - ブレーキなしで30分間、700×gで層状混合物を遠心分離します。 CENTR血漿、バフィーコート（のPBMCを含む）、密度勾配材料、顆粒球、および赤血球：ifuged混合物は、（上から下へ）5層に分離する必要があります。
- 削除し、プラズマの大部分を破棄し、慎重にパスツールピペットと吸引バルブを使用して、新しい15 mLチューブにバフィーコート（PBMC）コンテンツを取得します。
注：バフィーコート層の除去を効果的に層の外側の周りの円運動を行いながら、チューブに対するピペットの先端で、パスツールピペットで吸引を適用することによって行われます。
- 洗浄の間に（フルブレーキで）10分間、350×gで遠心分離することによって単離されたPBMCをpH7.3のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄します。完全RPMI培地中でPBMCペレットを再構成します。ペレットの大きさに応じて、メディアの3-7 mLで十分です。
- トリパンブルーおよび血球計数器を使用してPBMCを数えます。トリパンブルーで染色されていないこれらの細胞のみをカウントします。 Reconstitut完全RPMI培地中1,750,000細胞/ mLに電子のPBMC。
- 8チャンバースライドの各ウェルにシード400μL（70万細胞）。 37℃で、完全に加湿した組織培養インキュベーター中でスライドをインキュベート単球/マクロファージが付着できるようにするために1時間（5％CO 2を補充しました）。
2.付着した単球の前処理
注：食作用を阻害または増強する方法を模索している場合、このステップが必要なだけです。
- 前処理は、関心のある任意の薬剤（複数可）または化合物（複数可）で単球を接着しました。完全RPMI培地を用いて、所望の濃度の薬剤（単数または複数）または他の試験材料を再構成します。
注：例えば、IVIG200μgの/ mLのは、典型的には、ヒト単球を使用した場合、食作用の95％〜100％阻害を得るために使用されます。 - 吸引は（ステップ1.6の後に）1時間のインキュベーションの後、8チャンバースライドから任意の非付着細胞を含む上清を廃棄し。 400と交換してください薬物または他の治療のμL、37℃で1時間インキュベートします。
- 8チャンバースライド中の溶液を吸引し、交換するときは、弱く付着した細胞は持ち上げないように、流体の流れを制御するようにしてください。また、一度に2-3空のウェルと協力し、ウェルを乾燥させないようにしてください。
注：典型的には、各処理は、技術的な三連で実施されます。
- 8チャンバースライド中の溶液を吸引し、交換するときは、弱く付着した細胞は持ち上げないように、流体の流れを制御するようにしてください。また、一度に2-3空のウェルと協力し、ウェルを乾燥させないようにしてください。
3. R 2 R 2赤血球のオプソニン化を
注：ここで使用されるR 2、R 2は、採血センター（カナダ血液サービス）から取得されますが、彼らはまた、市販されています。オプソニンR 2 R 2 RBCをのFcγR媒介性食作用の陽性対照として使用されています。ナイーブR 2、R 2は、1ヶ月まで4℃で（貯蔵寿命を延ばすために）Alseverの溶液中に保存されるべきです。 Alseverのソリューションは、社内で作られ、0.8で構成されています％/ vのクエン酸三ナトリウム（二水和物）、1.9％W / Vのデキストロース、W 0.42％/ vの塩化ナトリウム、および0.05％W / Vクエン酸（一水和物）wです。 R 2 R 2セルが利用可能でない場合、例えば、R 1、R 2、R 1、R 1、R 1、R、またはR 2、Rのような他のRh表現型細胞を使用することができます。
- PBSで洗浄R 2 R 2（CDE / CDE）赤血球5分間、350×gの遠心分離を用いて3回の合計。
注：必要なRBCの量は実験的なサイズに依存し、逆算することができます。赤血球が原因で溶解または上清を除去する際に、各洗浄中に失われているので、常に、RBCの過剰量を洗います。たとえば、5トリートメント、2コントロール、技術的な三重で行われ、すべてを用いた実験では、21ウェルの合計があります。 400μL/ウェルの1.25％RBC混合物との21ウェルは、パックの105μLは、RBCが必要とされるオプソニン化することを示しています。 200 RBCのμLが最初に洗浄する必要がありますし、150＆＃181; Lは、食作用のステップのためのRBCのに十分な量があることを確認するためにオプソニン化する必要があります。 - ヒト血清から1 V / Vポリクローナル抗D抗体と断続的に混合して、37℃で1時間インキュベートする：1で洗浄し、R 2 R 2ペレットをオプソニン化。
注：ポリクローナル抗D抗体が利用できない場合、市販されているモノクローナル抗D抗体、または血液銀行または輸血から得ることができ、通常のRh免疫予防のために使用された抗Dを使用することが可能ですサービスを提供しています。アッセイを設定するとき、および未力価ポリクローナル抗体の多くを切り替えるたびに、またはモノクローナル抗体への切り替えを最適化試験は、初めに行われるべきです。これは、抗グロブリン試験3+間4+とカウント100単球あたり70から90の間の貪食RBCの食作用の結果の（IAT）結果のために必要な最適濃度または抗Dのボリュームを識別することです。 - オプソニン化を洗いますDのR 2、R 2、5分ごとに350×gで遠心分離を用いてPBS中で3回の合計。
注：R 2 R 2の成功オプソニン間接IATを実行することによって確認することができます。簡単に言えば、二次ポリクローナル抗ヒト抗体はRBCの表面上の主要なオプソニン抗体を結合するために添加され、増幅された信号は、血球凝集の形で観察することができます。詳細な製造業者のプロトコルは、補足資料ファイルに記載されています。 - 1.25％v / vの完全RPMI培地を使用する洗浄R 2 R 2ペレットを再構成します。
注：過剰オプソニンR 2、R 2は、一週間まで4℃でAlseverの溶液中で保存することができます。
4.のFc受容体媒介食作用
- 8チャンバースライドからの薬物または中上清を吸引除去し、1.25％v / vのR 2 R 2混合物の400μLを追加します。 2時間37℃でインキュベートします。
- アフトえーインキュベーションの2時間、メーカーのアダプタを使用してチャンバを削除します。ペーパータオルで余分なR 2 R 2をオフに軽くたたきます。スライドが乾燥しないことを確認してください。
- PBSで100 mLビーカーを埋めます。水没し、ゆっくりと未貪食R 2 R 2の大部分を除去するために、前後（30-40ストローク付近）スライドを移動させることにより、スライドを洗います。
- PBSからスライドを削除してください。ペーパータオルやティッシュ、空気乾燥スライドを使用して過剰のPBSをオフに軽くたたきます。
- 45秒間、100％メタノール中で空気乾燥したスライドを修正しました。次に、固定されたスライドを空気乾燥させます。
注：スライドは、グリュンワルド・ギムザ染色21またはライト・ギムザ染色22として、下流の染色のためのより多くの互換性のある別の方法を使用して固定することができます。 - インハウスメイドELVANOLマウンティング培地（または他の市販の封入剤）を使用してスライドをマウントし、カバースリップを追加します。
注：エルバノール封入剤は経口w / vの15％で構成されていますlyvinylアルコール樹脂、PBS中30％（v / v）のグリセリン。すべての樹脂が溶解するまで混合物を加熱し、グリセリンを均質に混合します。これは、他の市販のマウンティング培地と交換することができます。 - マウントは定量化する前に一晩乾燥することができます。
貪食の5定量
- 位相差顕微鏡および40Xの対物レンズを使用して、手動で少なくとも200単球およびそれらの単球内の貪食R 2 R 2の数をカウントすることによって食イベントの量を定量化します。同時に、単球の数と貪食R 2 R 2の数を定量化するためにそれぞれの手で1カウンターを持っています。
- 単球数によって貪食R 2 R 2の数を割り、100 Expressの平均（SEM）の平均±標準誤差としてデータ（平均貪食指数）を乗じて平均貪食インデックスを取得します。
Representative Results
図1において非常に重要なステップと上記で概説した手順に従うことで、MMAは再現可能に行うことができます。 IVIGは、 図2の食作用の阻害のための例として使用しました。 IVIGは、このように食作用の下流の結果を阻害し、結合し、Fc受容体をブロックすることが知られています。使用IVIGの量を滴定することにより、用量依存的阻害とは、/ mLの全て（ 図2A）で阻害しなかった/ mLの0.5μgの下の100％に近い抑制および濃度をもたらした200μg以上の濃度、観察されます。食作用指数は、形質転換し、0％阻害、/ mLで決定することができるの3μgのIC 50（ 図2B）での阻害曲線としてR 2 R 2陽性対照に対して標準化されている場合。
一貫してアッセイを実施することに加えて、quantificaアッセイの化は、時には困難な場合があります。 図3は 、様々なMMAスライドの位相差顕微鏡画像のコレクションです。顕微鏡の経験では、1は、混入RBC（ 図3D）、または貪食RBC（ 図3B）からの液胞から単球を区別することができます。細胞および/または破片の密なクラスターは、定量化（ 図3EおよびF）の間に避けるべきです。また、1はオーバーオプソニン化単球の内部をovercrowdsし、正確な定量（ 図3C）に干渉する高め食作用につながるR 2 R 2 RBCを、避けるべきです。
MMAの1模式図を図。 MMAにおける重要なステップのステップバイステップの描写：全血からPBMCを単離し、付着しmonocytを供給オプソニン化R 2、R 2、およびチャンバースライドを洗浄とエス。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2静脈内のIgG（IVIG）は、MMAを用いてインビトロで食作用を阻害します。 IVIGは、食作用を阻害することが知られており、人間のMMAにおける阻害対照として使用します。 （A）IVIGの滴定は、未処理のR 2 R 2、対照と比較食作用の用量依存的阻害をもたらしました。結果は、n = 3回の実験の平均（SEM）の平均±標準誤差を示しています。統計分析は、 スチューデントt検定を用いて行った：**P≤0.01及び***P≤0.001。 IC 50 OでIVIGの（B）阻害曲線F 3 / mlの（点線）。結果は、未処理のR 2 R 2（0％阻害）に対して正規化したデータを示します。 n = 3の実験の平均±SEM。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
40X倍率下サンプルスライドの図3の位相差顕微鏡画像。 （A）単球が背景（白矢印）で非常に少数の汚染、非貪食R 2 R 2で、平均（独特のハロー輝きと黒の矢印）に1-2、R 2、R 2を貪食した完璧なスライド。貪食R 2、R 2と間違われることができ、このスライドに示すように、（B）、単球が時々拡大してきた空胞（白矢印）、。 （C <R 2、R 2は、上でオプソニン化されている場合には/）>強い、以上の4-5は、単球あたりR 2 R 2（黒矢印を貪食）R 2、R 2は、単球および別個の細胞内で混雑しているので、難しいカウント正確なレンダリング境界は区別することはできません。 （D）スライドの不十分な洗浄は、付着したRBCと間違われる可能性が豊富で、R 2、R 2汚染（白矢印）、につながります。 （E）場合によっては、単球および夾雑赤血球のクラスターを形成してもよいです。クラスタはまた避けるべきである細菌汚染を示しています。 （F）単球は、定量化の際に避けるべきであるより大きな凝集体を形成することができます。表示するために、フィールドのランダムな選択を使用して、パネルAは、MMAが適正に行われている場合に通常観察されるものです。スケールバーは20μmです。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
Discussion
MMAは、組織培養および顕微鏡の両方の専門知識を必要とする面倒な手法です。成功を確実にするには、いくつかの重要なステップがあります：単球、単層の1）の生成は、 RBCの2）オプソニン化、および3）マニュアル定量化。単球の単層は、チャンバースライドに非常に強く付着しないので、生理的pHは、アッセイ11を通じて維持されなければならないとPBMCの十分な数が播種されるべきです。接着した細胞を乱す可能性があり、激しいピペッティングは、避けるべきです。一つのアプローチは常に削除して、チャンバーの同じコーナーからソリューションを追加し、動きがゆっくりと着実であることを保証することです。同様に、過剰な赤血球を除去するための最後の洗浄工程の間に、動きがゆっくりと着実にする必要があります。まだ未貪食RBCの大部分を除去しながらこれは、単層に最小限の妨害を保証します。不十分な洗浄は、手動の資格を行い、混入RBCの高いバックグラウンド、につながりますntification難しいです。第二に、R 2、R 2 RBCが十分に貪食制御のための80から120までの平均貪食インデックスを取得するためにオプソニン化する必要があります。この目的の食作用範囲はカウントのしやすさとのバランスを打つと統計分析のための食作用の十分な量を維持する（ 例えば、5つ以上の単球は、赤血球を正確に定量化することは困難である貪食しました）。オプソニン作用の程度は、IATによって確認することができ、4+ 3+との間の読み取りが必要です。 R 2、R洗浄の間の過剰な溶解があるとき上清は暗赤色に変わったら、または食作用の有意な減少は、ストレージ内の細胞の老化に起因する実験で観察されたときに2個のRBCは、破棄されるべきです。最後に、顕微鏡を使用して手動定量は、実験室の担当者の間や実験間でカウントを比較する場合は特に、注意が必要です。各ウェルに同じフィールドを調べることによって、または単により多くの細胞を計数することによってより一貫性のある数を得ることができます。経験豊富な技術とトレーニング用スライドの指定されたセットを使用したサイド・バイ・サイドのトレーニングが推奨されます。
MMAの主要な批判は、手動の定量化ステップの主観です。しかし、適切な訓練で、一貫性が異なるカウンタ渡って得ることができます。別の制限は、ヒト試料を扱うデータ変動の源である2 R 2表面抗原の発現レベルを、単球食作用能力およびRにおいて内因性のドナーからドナーの違いです。
他の代替技術は、FcγRを媒介食作用を調べるために利用可能です。市販のキットの大部分は、食作用をモニターするための蛍光出力を利用して（ 例えば、生体粒子、pH感受性蛍光タンパク質、またはIgG標識蛍光ラテックスビーズ）。蛍光出力の使用は、より客観的な定量化を提供しますが、1はまた、コンする必要があります可用性、コスト、および蛍光顕微鏡やフローサイトメーターと同様に、市販のキットの際に後続依存の使用に関連するトレーニングサイダー。
最後に、このアッセイは、研究の質問に応じて変更することができます。食作用の薬物阻害をテストする場合、例えば、単球を前処理することができるいずれかまたは薬物およびオプソニン化赤血球（ すなわち、競合アッセイ）の両方と共培養しました。異なるサブタイプ、キメラ抗体、または組換え構築物の抗体の下流のシグナル伝達も試験することができます。普遍的抗原ヌル血液24の開発における最近のブレークスルーでは、MMAは、食作用を誘発における低下効果が実際に存在するかどうかを評価するために様々な抗体を用いたこれらの抗原ヌルRBCの初期画面で利用することができます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers | BD | REF364606 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R8758 | |
| HEPES | Bioshop | HEP003.100 | |
| Fetal bovine serum | Multicell | 080150 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-64 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-03 | https://www.gelifesciences.com/ |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| 8-chamber slides | Lab-Tek-ll | 154534 | |
| R2R2 (cDE/cDE) red blood cells | Canadian Blood Services | Commercially available (e.g., http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells) | |
| Polyclonal anti-D from human serum | Gamma Biologics | DIN 02247724 | Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin |
| 100% methanol | Caledon | 6700-1-42 | |
| Polyvinyl alcohol resin | Sigma | P8136 | Can be substituted with commercially available mount |
| UltraPure glycerine | Invitrogen | 15514-011 | |
| Cover slips | VWR | 48366 067 | |
| Novaclone anti-IgG | Immucorgamma | 5461023 | Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf) |
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