Protocol
Obter a aprovação para o uso de amostras humanas pela diretoria / conselho de revisão institucional de ética em pesquisa, e obter o consentimento assinado por todos os doadores humanos. O MMA também pode ser realizada utilizando PBMCs de ratinho de uma forma semelhante como o ensaio de humano, após a aprovação uso de animais ética. A MMA utiliza técnicas de cultura de tecidos de assepsia.
NOTA: Veja a figura 1.
NOTA: Embora nós recomendamos o uso de um gabinete de isolamento biológico nível 2 durante o ensaio para manter uma técnica asséptica, como o método é apenas um "curto prazo" método de cultura, não há tempo realmente o suficiente para que as bactérias contaminam o ensaio. Portanto, se um armário biocontenção nível 2 não existe, em vez de apenas comprar um para este ensaio, o ensaio pode ser efectuado fora de um armário de isolamento biológico, num banco aberto. O uso de uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2, no entanto, não é uma opção e deve ser utilizado paraos melhores resultados.
1. Sangue Periférico isolamento de células mononucleares
- Uma amostra de sangue total humano de um dador saudável ou de um paciente através de venipunctura usando VACUTAINERS contendo ácido-citrato-dextrose (ACD) anticoagulante (tubos amarelo-top).
NOTA: O sangue total podem ser armazenados em ACD à temperatura ambiente (18-22 ° C) durante até 36 h antes de prosseguir para o próximo passo 11. Normalmente, 1-2 10 mL tubos vacutainer de sangue total são suficientes para o ensaio. - Dilui-se todo o sangue 1: 1 v / v em meio completo de RPMI morno (meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, HEPES 20 mM, e 0,01 mg / ml de gentamicina).
- Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir do sangue total diluído utilizando densidade de centrifugação em gradiente, como recomendado pelo fabricante (Veja Lista de Materiais). Camada de sangue diluída muito lentamente ao longo do gradiente de densidade (aquecida até à temperatura ambiente, 18-22 ° C).
NOTA: Minimizar a quantidade de mixing ao interface para a separação óptima do sangue por camadas cuidadosamente a mistura do sangue de uma maneira gota a gota, ou usando uma pipeta.- Permitir que a mistura de sangue para a camada lentamente ao longo do topo do gradiente de densidade colocando a ponta da pipeta perto do gradiente de densidade e ao permitir que a mistura de sangue a correr para o lado do tubo muito lentamente.
- Dependendo da escala da experiência, a camada de 10 mL de mistura sangue em cima de 3 mL de gradiente de densidade (em um tubo de 15 ml) ou uma camada de 35 mL de mistura sangue no topo de 15 ml de gradiente de densidade (em uma de 50 mL tubo). Tipicamente, 10 ml de sangue total produz 10 milhões de PBMC, com alguma variação doador para doador.
NOTA: É muito importante que não há mistura da mistura com o sangue por gradiente de densidade. A mistura de sangue deve camada sobre o gradiente de densidade e subir lentamente até que todo o sangue está no topo do gradiente de densidade. - Centrifugar a mistura em camadas a 700 g durante 30 min, sem freios. o centrmistura ifuged deve separar em 5 camadas (de cima para baixo): plasma, creme leucocitário (contendo PBMC), material de gradiente de densidade, granulócitos, e hemácias.
- Remover e descartar a maior parte do plasma e recuperar o conteúdo cuidadosamente buffy coat (PBMC) para um novo tubo de 15 ml, utilizando uma pipeta de Pasteur e uma bomba de sucção.
NOTA: A remoção da camada buffy coat é efectivamente feito através da aplicação de sucção na pipeta de Pasteur durante a execução de um movimento circular em torno do exterior da camada, com a ponta da pipeta contra o tubo.
- Lavam-se as PBMCs isoladas três vezes em solução salina tamponada a pH 7,3 com fosfato (PBS) por centrifugação a 350 xg durante 10 min (com freios completas) entre lavagens. Reconstituir o sedimento de PBMC em meio RPMI completo. Dependendo do tamanho do grânulo, 3-7 mL de meio é suficiente.
- Contar o PBMC usando azul de tripano e um hemocitómetro. Contam apenas as células que não estão manchados pelo azul de tripano. Reconstitute as PBMC a 1.750.000 células / ml em meio RPMI completo.
- Semente 400 ul (700000 células) em cada poço de uma corrediça 8 câmaras. Incubar a lâmina em uma temperatura de 37 ° C, totalmente humidificado incubador de cultura de tecido (suplementado com 5% de CO 2) durante 1 h para permitir que os monócitos / macrófagos a aderir.
2. Pré-tratamento da aderidos monócitos
NOTA: Este passo só é necessário se à procura de formas de inibir ou aumentar a fagocitose.
- Pré-tratamento com monócitos aderidos qualquer droga (s) ou composto (s) de interesse. Reconstituir o fármaco (s) ou outro material de teste para a concentração desejada com meio RPMI completo.
NOTA: Por exemplo, 200 ug / mL de IVIG é normalmente usado para produzir uma inibição de 95-100% de fagocitose quando utilizando monócitos humanos. - Aspirar e desprezar o sobrenadante contendo as células não aderentes a partir da corrediça de 8 câmaras após a incubação de 1 h (a seguir ao passo 1.6). Substitua-o por 400uL de uma droga ou outro tipo de tratamento e incubar durante 1 h a 37 ° C.
- Quando aspiração e substituindo soluções no slide 8-câmara, certifique-se de controlar o fluxo dos fluidos de modo que as células fracamente aderentes não decolar. Além disso, trabalhar com apenas 2-3 poços vazios de cada vez e evitar a secagem dos poços.
NOTA: Tipicamente, cada tratamento é realizado em triplicado técnicas.
- Quando aspiração e substituindo soluções no slide 8-câmara, certifique-se de controlar o fluxo dos fluidos de modo que as células fracamente aderentes não decolar. Além disso, trabalhar com apenas 2-3 poços vazios de cada vez e evitar a secagem dos poços.
3. Opsonização de R 2 R 2 Glóbulos vermelhos
NOTA: O R 2 R 2 utilizadas aqui são obtidas a partir da Colecção Blood Center (Canadian Blood Services), mas que também estão comercialmente disponíveis. Opsonizado R 2 R 2 GVs são utilizados como um controlo positivo para a fagocitose mediada por FcyR. Naïve R 2 R 2 deve ser armazenado em solução de Alsever (para prolongar a vida de prateleira) a 4 ° C durante até 1 mês. A solução da Alsever é feito em casa e composta por 0,8% W / v de citrato de trissódio (di-hidratado), 1,9% w / v de dextrose, 0,42% w / v de cloreto de sódio, e 0,05% w / v de ácido cítrico (mono-hidrato). Se R 2 R 2 células não estão disponíveis, outras células Rh-fenotipados, tais como R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R, ou R2 R, pode ser utilizado.
- Lavar R2 R2 (CDE / CDE), células vermelhas do sangue em PBS um total de três vezes utilizando centrifugação a 350 xg durante 5 min cada.
NOTA: A quantidade de glóbulos vermelhos necessários depende do tamanho experimental e pode ser re-calculado. Sempre lavar uma quantidade em excesso de glóbulos vermelhos, uma vez que os glóbulos vermelhos são perdidas durante cada lavagem devido à lise ou durante a remoção do sobrenadante. Por exemplo, numa experiência com 5 tratamentos e 2 os controlos, todos realizados em triplicado técnicos, há um total de 21 poços. 21 poços com 400 ul / cavidade de 1,25% indica que RBC mistura 105 ul de pré-embaladas, opsonizado RBC são necessários. 200 uL de RBC deve ser inicialmente lavado e 150 & #181; L deve ser opsonizados para assegurar que existe uma quantidade adequada de glóbulos vermelhos para o passo de fagocitose. - Opsonizar o lavado R 2 R 2 pelete com 1: 1 de anticorpos v / v de anti-D policlonais a partir de soro humano e incubar durante 1 h a 37 ° C, com agitação intermitente.
NOTA: Se os anticorpos anti-D policlonais não estão disponíveis, é possível a utilização de anticorpos monoclonais anti-D, os quais estão comercialmente disponíveis, ou anti-D, que é normalmente utilizado para Rh profilaxia imunitária, que pode ser obtido a partir de bancos de sangue ou transfusão Serviços. testes de otimização deve ser realizada no início, durante a configuração do ensaio, e sempre que mudar um monte de anticorpos policlonais titulados-un ou a mudança para um anticorpo monoclonal. Este é o de identificar a melhor concentração ou o volume de anti-D necessário para um teste de antiglobulina (IAT) resultado de entre 3+ e 4+ e um resultado de fagocitose entre 70-90 GVs fagocitados por 100 monócitos contados. - Lava-se a opsonizard R 2 um total de três vezes em PBS utilizando centrifugação a 350 xg durante 5 min cada R 2.
NOTA: opsonização bem sucedida de R 2 R 2 pode ser confirmada através da realização de uma IAT indirecta. Resumidamente, anticorpos policlonais anti-humanos secundários são adicionados para se ligar anticorpos opsonizantes primários em superfícies de RBC, e o sinal amplificado pode ser observada sob a forma de hemaglutinação. Um protocolo fabricante detalhada pode ser encontrada no arquivo de materiais suplementares. - Reconstituir o lavado R 2 R 2 pelete a 1,25% v / v, utilizando meio RPMI completo.
NOTA: O excesso de R opsonizado 2 R 2 podem ser armazenados em solução de Alsever a 4 ° C durante até uma semana.
4. A fagocitose mediada pelo receptor Fc
- Aspirar o sobrenadante do meio de droga ou a partir do slide 8-câmara e adicionar 400 uL de a 1,25% v / v de R 2 R 2 mistura. Incubar a 37 ° C durante 2 h.
- à réer 2 h de incubação, remove as câmaras que utilizam adaptadores do fabricante. Dab o excesso de R 2 R 2 sobre uma toalha de papel. Certifique-se de que o slide não seque.
- Encher um copo de 100 mL com PBS. Submerge e lavar a lâmina lentamente movendo a lâmina e para trás (cerca de 30-40 pancadas) para remover a maioria do fagocitados-un R 2 R 2.
- Remova a lâmina do PBS. Dab o excesso de PBS utilizando uma toalha de papel ou tecido e deixe secar o slide.
- Fixar a lâmina seca ao ar em 100% de metanol durante 45 s. Em seguida, deixe secar a lâmina fixa.
NOTA: As lâminas podem ser corrigidos usando um outro método que é mais compatível para a coloração jusante, como a mancha Grünwald-Giemsa 21 ou a mancha Wright-Giemsa 22. - Monte a lâmina utilizando um in-house-made de montagem ELVANOL médio (ou outro meio de montagem disponível no mercado) e adicionar lamelas.
NOTA: Elvanol meio de montagem é composto por 15% w / v poresina de álcool lyvinyl e 30% v / v de glicerina em PBS. A mistura é aquecida até que toda a resina tenha dissolvido e a glicerina é misturado de forma homogénea. Isto pode ser substituído por outro meio de montagem disponível comercialmente. - Permitir ao monte a secar durante a noite antes da quantificação.
5. A quantificação da fagocitose
- Usando um microscópio de contraste de fase e uma lente de objectiva de 40x, quantificar manualmente a quantidade de eventos fagocíticas contando pelo menos 200 monócitos e o número de fagocitados R 2 R 2 dentro desses monócitos. Possui um contador em cada mão para quantificar simultaneamente o número de monócitos e o número de fagocitados R 2 R 2.
- Obter o índice fagocítica média dividindo-se o número de fagocitados R 2 R 2 pelo número de monócitos e multiplicando por 100. expressar os dados como a média (média) de índice fagocítica ± o erro padrão da média (SEM).
Representative Results
Seguindo os passos cruciais na Figura 1 e o procedimento acima descrito, o MMA pode ser realizada de forma reprodutível. IVIG foi usado como um exemplo para a inibição da fagocitose na Figura 2. IVIG é conhecido por se ligar e bloquear os receptores Fc, inibindo, assim, o resultado a jusante de fagocitose. Por titulação da quantidade de IVIG utilizado, uma inibição dependente da dose é observada, em que as concentrações acima de 200 ng / mL resultou em perto de 100% de inibição e as concentrações inferiores a 0,5 ug / ml não inibiu a todos (Figura 2A). Quando os índices fagocíticas são transformadas e normalizada para o controlo positivo R 2 R 2 como 0% de inibição, uma curva de inibição, com uma IC50 de 3 ng / mL pode ser determinada (Figura 2B).
Além de realizar o ensaio de forma consistente, quantificação do ensaio, por vezes, pode ser difícil. A Figura 3 é um conjunto de imagens de microscopia de contraste de fase de vários diapositivos de MMA. Com microscopia experiência, pode-se distinguir um monócitos a partir de um contaminante de RBC (Figura 3D), ou de um vacúolo de um RBC fagocitado (Figura 3B). Conjuntos densos de células e / ou detritos deve ser evitada durante a quantificação (Figuras 3E e F). Além disso, deve-se evitar o excesso de opsonizantes o R 2 R 2 RBC, o que levaria a fagocitose aumentada que superlota o interior de monócitos e interfere com a quantificação exacta (Figura 3C).
Figura 1. Diagrama esquemático do MMA. Uma descrição passo a passo dos passos cruciais no MMA: isolamento de PBMC a partir de sangue total, que alimenta o monocyt aderidaES opsonizado com R 2 R 2, e lavagem das lâminas de câmara. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. IgG intravenosa (IVIG) inibe a fagocitose in vitro, utilizando o MMA. IVIG é que inibem a fagocitose e é usado como um controlo de inibição no MMA humano. (A) A titulação de IVIG resultou numa inibição dependente da dose da fagocitose quando em comparação com o não tratado R 2 R 2 controle. Os resultados mostram a média ± o erro padrão da média (SEM) de n = 3 experiências. A análise estatística foi realizada utilizando Student t -test: ** p≤0.01 e *** p≤0.001. (B) curva de inibição de IVIG com uma IC 50 OF 3? g / mL (linha pontilhada). Os resultados mostram dados normalizados para não tratado R 2 R 2 (0% de inibição); média ± SEM de n = 3 experiências. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. As imagens de microscopia de contraste de fase de lâminas de amostra em 40X. (A) O slide perfeito em que os monócitos fagocitado 1-2 R 2 R 2, em média (setas pretas com um brilho de halo distintivo), com muito poucos contaminantes, un-fagocitado R 2 R 2 no fundo (setas brancas). Vacúolos (B) Como mostrado neste slide, monócitos, por vezes, têm aumentado (setas brancas), que podem ser confundidos com fagocitado R 2 R 2. (C </ forte>) Quando R 2 R 2 foram sobre-opsonizado, mais do que 4-5 fagocitados R 2 R 2 por monócitos (setas pretas) rende exacta contando difícil, uma vez que a R 2 R 2 são aglomeradas no monócitos e células distintas limites não podem ser distinguidos. (D) lavagem inadequada do slide leva a abundante R2 R2 contaminação (setas brancas), que poderia ser confundido com hemácias aderiram. (E) Às vezes, monócitos e glóbulos vermelhos contaminantes podem formar clusters. Clusters também indicar a contaminação bacteriana, o que deve ser evitado. (F) Os monócitos podem formar agregados maiores, que devem ser evitados durante a quantificação. Usando seleção aleatória dos campos para ver, painel A é o que é geralmente observado se o MMA tem sido realizada corretamente. barra de escala é de 20 mm. Por favor, clique aquipara ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O MMA é uma técnica trabalhosa que requer experiência tanto em cultura de tecidos e microscopia. Há vários passos críticos para garantir o sucesso: 1) geração da monocamada de monócitos; 2) opsonização dos glóbulos vermelhos, e 3) quantificação manual. A monocamada de monócitos não adere muito fortemente ao slide câmara, de modo que o pH fisiológico deve ser mantida durante todo o ensaio de 11 e um número adequado de PBMC deve ser semeadas. pipetagem vigorosa, a qual poderia perturbar as células aderidas, devem ser evitados. Uma abordagem é sempre remover e adicionar soluções a partir do mesmo canto da câmara, e para assegurar que o movimento é lento e constante. Do mesmo modo, durante o último passo de lavagem para remover o excesso de glóbulos vermelhos, o movimento deve ser lento e constante. Isto garante um mínimo de perturbações para a monocamada enquanto ainda remover a maioria dos GVs fagocitados-un. lavagem inadequada irá conduzir a uma elevada interferência de fundo dos GVs contaminantes, o que torna o manual quantification difícil. Em segundo lugar, os R 2 R 2 hemácias deve ser suficientemente opsonizado para se obter um índice médio de 80-120 fagocítica para o controlo fagocitose. Esta gama fagocítica desejado estabelece um equilíbrio entre a facilidade de contagem (por exemplo, monócitos com mais de 5 fagocitados GVs são difíceis de quantificar com precisão) e manutenção de uma quantidade adequada de fagocitose para análise estatística. O grau de opsonização pode ser confirmada por um IAT, e é necessária uma leitura entre 3+ a 4+. O R 2 R 2 hemácias deve ser descartado quando não há excesso de lise durante a lavagem, em que o sobrenadante passa a vermelho escuro, ou quando ocorre uma diminuição significativa na fagocitose é observado em experiências devido ao envelhecimento das células em armazenamento. Por último, a quantificação manual usando o microscópio pode ser complicado, especialmente quando se compara contagens entre o pessoal de laboratório e entre experimentos. Ao examinar o mesmo campo em cada poço, ou simplesmente pela contagem mais células, Uma contagem mais consistente pode ser obtido. formação lado-a-lado com um técnico experiente e a utilização de um conjunto de lâminas de formação designada é recomendado.
Uma grande crítica do MMA é a subjetividade da etapa de quantificação manual. No entanto, com formação adequada, a consistência pode ser obtido através de diferentes contadores. Outra limitação é a diferenças intrínsecas doador-a-doador em monócitos capacidades fagocíticas e em R 2 R níveis de expressão do antigénio de superfície 2, que é uma fonte de variação dos dados quando se lida com amostras humanas.
Outras técnicas alternativas estão disponíveis para examinar a fagocitose FcyR mediada. A maioria dos kits comerciais utilizam saída fluorescente para monitorizar a fagocitose (por exemplo, biopartículas, a proteína de fluorescência sensível ao pH, ou IgG-esferas de látex marcadas fluorescentes). O uso de saída fluorescente não oferecem quantificação mais objetiva, mas também é preciso conconsiderar as disponibilidade, custo, e de formação associada com o uso de um microscópio de fluorescência ou um citómetro de fluxo, bem como a dependência que se seguiu após kits disponíveis comercialmente.
Finalmente, este ensaio pode ser modificado, dependendo da questão de pesquisa. Por exemplo, no ensaio de inibição de droga de fagocitose, monócitos pode ser pré-tratado ou co-incubadas com ambos os fármacos e RBCs opsonizadas (ou seja, um ensaio de competição). A sinalização a jusante de anticorpos de diferentes subtipos, anticorpos quiméricos, ou construções recombinantes pode também ser testada. Com os recentes avanços no desenvolvimento de um sangue antígeno-nulo universal 24, o MMA poderia ser utilizada em telas iniciais desses hemácias antígeno-nulo com vários anticorpos para avaliar se há de fato uma eficácia reduzida no desencadeamento de fagocitose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers | BD | REF364606 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R8758 | |
| HEPES | Bioshop | HEP003.100 | |
| Fetal bovine serum | Multicell | 080150 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-64 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-03 | https://www.gelifesciences.com/ |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| 8-chamber slides | Lab-Tek-ll | 154534 | |
| R2R2 (cDE/cDE) red blood cells | Canadian Blood Services | Commercially available (e.g., http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells) | |
| Polyclonal anti-D from human serum | Gamma Biologics | DIN 02247724 | Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin |
| 100% methanol | Caledon | 6700-1-42 | |
| Polyvinyl alcohol resin | Sigma | P8136 | Can be substituted with commercially available mount |
| UltraPure glycerine | Invitrogen | 15514-011 | |
| Cover slips | VWR | 48366 067 | |
| Novaclone anti-IgG | Immucorgamma | 5461023 | Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf) |
References
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