Summary
Vi beskriver en metode til påvisning af kemiske elementer nuværende in situ i menneskeceller samt deres in vitro- kvantificering. Metoden er velegnet til enhver celletype og er især nyttig for kvantitative kemiske analyser i enkelt celler efter in vitro- metal oxide nanopartikler eksponering.
Abstract
Mikro-analytiske teknikker baseret på grundstof imaging aktiverer lokalisering og kvantificering af kemiske sammensætning på cellulært niveau. De tilbyder nye muligheder for karakterisering af levende systemer og er særlig velegnet til at opdage, lokalisere og kvantificering af tilstedeværelsen af metal metaloxid både i biologiske prøver og miljøet. Faktisk opfylde disse teknikker alle krav med hensyn til (i) følsomhed (fra 1 op til 10 µg.g-1 for tørre masse), (ii) mikrometer række rumlige opløsning og (iii) multi-element påvisning. I betragtning af disse karakteristika, microbeam grundstof imaging kan kraftigt supplere rutinemæssig Billeddannende teknikker såsom optiske og Fluorescens mikroskopi. Denne protokol beskriver, hvordan du udføre en nuklear microprobe analyse på kulturperler celler (U2OS) udsættes for titandioxid nanopartikler. Celler skal vokse og udsættes direkte i en specialdesignet prøveholderen anvendes på optisk mikroskop og nukleare microprobe analyse faser. Springet-freeze kryogene fiksering af prøverne bevarer både den cellulære organisation og grundstof distribution. Samtidige nukleare microprobe analyse (scanning transmission ion mikroskopi, Rutherford backscattering massespektrometri og partikel induceret X-ray emission) udføres på prøven indeholder oplysninger om den cellulære tæthed, den lokal distribution af de kemiske elementer, såvel som det cellulære indhold af nanopartikler. Der er et voksende behov for sådanne analytiske værktøjer inden for biologi, navnlig de nye led i projektgruppen for Nanotoksikologi og Nanomedicin som vores forståelse af samspillet mellem nanopartikler og biologiske prøver skal uddybes. Især som nukleare microprobe analyse ikke kræver nanopartikler skal mærkes, er nanopartikel mængder kvantificerbare en enkelt celle ad gangen i en celle population, uafhængigt af deres overflade tilstand.
Introduction
Cellulære homøostase bestemmes af optagelse kontrol, assimilation og intracellulære lokalisering af forskellige sporstoffer (ioner, metaller, eksogene uorganiske forbindelser). Disse komponenter er ofte i form af spor, men ikke desto mindre kan have en betydelig virkning i system fysiologi. Studiet af celle Biokemi i både normale og patologiske/stressede situationer er således en nøgle-skridt i retning af en samlet forståelse af cellulære metaboliske mekanismer. Derfor, udvikling af imaging og analytiske teknikker gør det muligt for undersøgelse af intracellulære kemiske mængder, strukturelle organisation og deres beslægtede metaboliske funktioner bliver nødvendigt. Meget få metoder er i stand til at give en i situ kvantitative stykke af oplysninger om den samlede kemiske natur for en given prøve. Bortset fra metoder analysere prøver i løs form, i situ analyser overveje biologiske prøver i deres fremsendte uden at miste masse og strukturelle oplysninger, dermed bevare deres konstituerende kemikalier (sporstoffer og ioner) og proteiner. Desuden, som nanovidenskab fortsætter med at udvikle, bedre billedbehandling og analysemetoder for miljøovervågning på det cellulære skala vil være nødvendigt at observere og kvantificere nano-objekt adfærd og interaktioner. 1
Nanopartikler (NPs) har været defineret som objekter udstiller mindst én facial dimension i række 1 og 100 nm. 2 på grund af deres særlige fysisk-kemiske egenskaber, NPs er flittigt brugt i industrien. NPs er ansat i bio-anvendelser og Nanomedicin. 3 , 4 trods de mange fysisk-kemiske egenskaber af NPs, kan de skabe nogle risici for negative virkninger på menneskers sundhed og miljøet. Disse risici kan være fremkaldt af både langvarige og gentagne engagementer på forskellige koncentrationsniveauer og dette endnu ikke blevet klart fastlagt. 5 , 6 , 7 , 8 især skæbne af NPs inde i cellerne og de tilknyttede cellulære svar er, til dato, ikke fuldt beskrevet. Dette er delvis på grund af knaphed på metoder, der giver mulighed for påvisning og kvantificering af internaliseret NPs i en enkelt celle. 9
De klassisk analytiske værktøjer, der anvendes til at anslå den cellulære dosis af nanopartikler er microscopies, massespektrometri (MS), koblet induktivt plasma MS (ICP-MS)10,11 og væskekromatografi MS (LC-MS), men de kun giver nyttige oplysninger på makroskopisk skala. Ingen af dem kan give en præcis vurdering af subcellulært NPs indholdet eller NPs distribution uden brug af fraktionering metoder. En systematisk vurdering af dosis-respons er dermed umuligt med disse metoder, i stedet for metoder baseret på atomare spektroskopi såsom nukleare microprobe analyse12,13, synkrotron X-ray Fluorescens mikroskopi14 , og sekundære Ion massespektrometri (SIMS). 15 , 16 disse metoder er særligt interessant, da de komplementerer bemærkninger ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, især når NPs ikke kan mærkes med fluorescerende molekyler og således undersøges i deres hjemstat. Til en vis grad, selv når NPs er podet med fluorophores, (i) kvantificering er fortsat vanskelig fordi det tagging niveau pr. NP er ukendt og (ii) den kemiske modifikation af NP overflade kan ændre dets cellulære fordeling.
I denne artikel vil vi fokusere på en metode baseret på en kombination af nukleare microprobe teknikker med henblik på imaging morfologi og elementært sammensætning af biologiske prøver i dur, mol, og spore koncentrationer.
Nukleare microprobe analyse viser sig for at være særligt velegnet til måling af kemisk sporstoffer i biologisk væv. Både beam laterale opløsning (0,3 til 1 µm) og følsomhed i grundstof påvisning (fra 1 til 10 µg.g-1 tør masse) er velegnet til studier på cellulært niveau. Nukleare microprobe teknikker er baseret på partikler påvisning (fotoner, elektroner, ioner) udsendes efter ion lysstråle (typisk kører på MeV energier) interagerer med atomer til stede i prøven. Interaktioner forekommer i celler er hovedsagelig: 1) excitation/ionisering af atomer efterfulgt af en emission af fotoner efter atomer tilbage til deres grundlæggende tilstand; og 2) udbredelse af indgående partikler fører til at ændre i deres energi og retning. Måling af udsendte partikel energi allowsthe identifikation af atomer involveret i samspillet. For at udføre kortlægning af elementer, er ion microbeam gentagne gange scannet over prøveoverfladen, ofte over et areal på omkring 100 af 100 µm2 indeholder flere celler. Udsendte partikler er opdaget og deres energi er registreret for hver bjælke. Sortering af partikler efter stråle position, er således at identificere den ansvarlige for udledningen af sådanne partikler struktur formålet med data behandling. Her, beskriver vi netop en fremgangsmåde baseret på Fluorescens mikroskopi og nukleare microprobe analyse til at opdage samt at kvantificere eksogene NPs på de cellulære og subcellulære skalaer, for at undersøge konsekvenserne af NP interaktioner med levende systemer. Vi skal især fokusere på de muligheder, som denne metode med hensyn til i situ kvantificering af titandioxid nanopartikler (TiO2 NPs) aggregater på subcellulært niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. indehaveren prøveforberedelse
-
Prøven indehaveren design og forberedelse
- Fremstille en prøveholderen ved at bore en 5 mm x 5 mm firkant i en 1 mm tyk PEEK ramme.
- Ren ved at skylle med ethanol 70% (v/v) og holde i sterile plader indtil klar til brug.
Bemærk. En passende cellekultur og celle håndtering prøveholderen er påkrævet. Det skal være konstrueret til celle dyrkning, in vitro- observationer med optisk mikroskopi og nukleare microprobe analyse og billedbehandling. Denne indehaveren er lavet af en PEEK ramme13.
- Prøveforberedelse indehaveren
- Forberede Formvar løsning ved at opløse 1 mg Formvar pulver i 100 mL chloroform.
- Strække polycarbonat folie på en metallisk ramme, således at det udgør ingen fold.
- Bruge en steril tip til at sprede Formvar løsningen omkring prøven indehaveren hul.
- Satte fint prøveholderen med lim på strakte polycarbonat folie (en 5 mm x 5 mm firkant).
- Gentage den foregående sekvens for at forberede en prøveholderen til hver replikeres.
Bemærk. Polycarbonat (PC)-film er biokompatible, tykke nok og modstandsdygtige over for de forskellige protokoller og analytiske begrænsninger.
Forsigtig- Chloroform er giftigt. Undgå indånding, indtagelse eller kontakt med huden. Brug altid en velfungerende kemiske stinkskab og passende filtre.
- Prøven indehaveren sterilisation
- Placer monteret prøveholderen i en konisk kolbe med 50 mL ethanol 70% (v/v) under agitation på 180 rpm og +37 ° C natten over, ved hjælp af en inkubator/omrører.
- Skyl indehaveren flere gange i sterilt destilleret vand.
- Luft tørre dem i sterile forhold og udsætte dem for ultraviolet lys (bakteriedræbende lampe fra biosikkerhed bænk, klasse II) i 30 min på hver side.
- Holde prøver i sterile 12-godt plader (én prøveholderen pr. brønd) indtil klar til brug.
Bemærk: Flere prøve indehavere kan opbevares ved stuetemperatur i steril og tørre 12-godt plader forseglet med parafilm i flere dage.
2. vækst af celler i passende prøveholderen.
Forsigtighed: Protokollen skal udføres i en biosikkerhed laminar flow bænk (klasse II) til at udelukke kontaminerende mikroorganismer. Håndtere antibiotika (fx penicillin, streptomycin) med handsker. Respektere bedste praksis ved håndtering af biologiske materialer (cellelinjer, genetisk modificeret afledt menneskelige celler).
Kritisk: cellelinjer brugt bør kontrolleres for at sikre, at de ikke er inficeret med Mycoplasma.
- Transfect U2OS cellelinje med plasmid forsynet med Matrix-roGFP 17,18,19 ved en Transfektion metode i henhold til protokollen fastsat af fabrikanten.
- At bekræfte Transfektion med plasmid-bærer biosensor og for at forhindre tab af plasmid, Vælg og opretholde passende næringssubstratet transfected cellerne.
- Visualisere transfekteret celler ved Fluorescens mikroskopi til at sikre Transfektion er opstået og at bekræfte udtryk for fluorescens og visning af en reticular og rørformede mitokondrie netværk19.
Pause punkt: Celler kan fryses i flydende kvælstof i flere år. - Bruge transfekteret celle population ved dyrkning af celler i et passende medium for at opnå sub sammenflydende cellepopulationer. Vokse celler ved 37 ° C, 5% (v/v) CO2 i en mættet vand atmosfære.
- Frø-celler i en koncentration, som de er på 80% confluence dagen for fiksering. Typisk, en koncentration af 500 celler / µL kunne bruges. Høste celler ved hjælp af 400 µL af Trypsin-EDTA 0,25% (v/v) og holde i 3 minutter ved 37 ° C. Stop trypsin handling med 1 mL af næringssubstratet. Sammenpresse cellerne ved centrifugering i 5 min. ved 230 x g og + 4 ° C, så Fjern supernatanten, og tilføje den ønskede volumen af friske næringssubstratet.
Bemærk. Protokollen er gældende for alle cellulære typer og antallet celler seedede er afhængig af Cellestørrelse og på celle fordobling tid.
Forsigtighed: Undgå at udsætte trypsin, antibiotika og serum for gentagne fryse-tø cykler. Holde dem sterile. Opdele stamopløsningen i delprøver og fryse dem på −20 ° C. Gemme delprøver indtil udløbsdatoen. Skyl omhyggeligt celle pellet helt fjerne trypsin. Spor af resterende trypsin vil forsinke og mindske plating effektivitet. - Tælle cellerne og udføre en fortynding med friske komplet næringssubstratet holdt ved 37 ° C for at opnå en cellesuspension med 500 celler / µL.
Bemærk: Koncentrationen af cellesuspension har tilpasses som en funktion af typen celle for at plade en 40 µL drop. - Plade en 40 µL drop på midten af polycarbonat folie. Omhyggeligt placere prøve for 2 h ved +37 ° C, 5% (v/v) CO2 i en mættet vand atmosfære.
Kritisk: Når prøven er placeret i rugemaskinen, begrænse så meget som muligt enhver mekanisk bevægelse til at favorisere hurtig celle vedhæftet fil. Ifølge celletype, kunne det være nødvendigt at udruge celler længere end 2 h for optimal platting effektivitet. Tjek mættet at inkubator atmosfære er godt for at forhindre dråber fordamper. - Kontroller, at cellerne er godt vedlagte på polycarbonat folien ved hjælp af et optisk mikroskop. Forsigtigt tilsættes 2 mL frisk komplet medium og holde i 24 timer.
3. nanopartikler forberedelse og eksponering
Bemærk: Fluorescerende farvestof-modificerede TiO2 NPs var designet, syntetiseret og kemisk modificeret med tetramethyl rodamin isothiocyanat (TRITC). 20 , 21 denne overflade ændring kan nanopartikel påvisning, sporing og lokalisering i situ - og cellulo i både levende og faste celler eller flercellede organismer. 12 , 13 , 18
Forsigtighed: Nanomaterialer og nanopartikler skal håndteres med omhu. Undgå indånding, indtagelse eller kontakt med huden. For at forhindre udbredelse i luften, vedligeholdes nanopartikler i løsning (ultrarent vand).
- Der forberedes en suspension af 1 mg.mL1 afTiO2 NPs i ultrarent vand. Sprede TiO2 NPs ved hjælp af intense 1-min sonikering pulser på RT (750 W, 20 kHz, amplitude: 30%) ved hjælp af en ultra-lyd generator og en dedikeret konisk microprobe.
- Fortynd TiO2 NPs på den ønskede koncentration i substratet for at opnå en eksponering suspension af 4 µg.cm−2 (endelig koncentration). Erstatte medium med den passende mængde af medium indeholdende NPs på celler og bland forsigtigt for homogen fordeling af TiO2 NPs. Forbered kontrol celler på samme måde uden tilsætning af TiO2 NPs.
- Inkuber cellepopulationer i 24 timer ved 37 ° C, 5% (v/v) CO2 og mættede vand atmosfære.
4. PARAFORMALDEHYD fiksering og Fluorescens mikroskopi.
- Forberede en frisk løsning af PARAFORMALDEHYD løsning (PFA, 4% w/v) buffered i fosfat Buffer saltvand (PBS, pH 7,4).
- 4 g PFA pulver i 100 mL PBS opløses. Varme løsning til 65 ° C under omrøring ved hjælp af en magnet og en magnetomrører i et stinkskab. Øge pH ved at tilføje 1 M NaOH én dråbe ad gangen indtil løsningen rydder. Cool løsning til stuetemperatur og ph indstilles til 7,4. Bruge den frisklavede løsning umiddelbart eller holde ved + 4 ° C og beskytte mod lys.
Bemærk: Pre-Made PFA løsninger kunne bruges, men en tilberedning af PFA garanterer bedre fiksering kvalitet og langsigtet bevaring af de faste prøver.
Forsigtighed: PFA er giftige; Undgå indånding, indtagelse eller kontakt med huden. Brug altid en velfungerende kemiske stinkskab og passende filtre.
- 4 g PFA pulver i 100 mL PBS opløses. Varme løsning til 65 ° C under omrøring ved hjælp af en magnet og en magnetomrører i et stinkskab. Øge pH ved at tilføje 1 M NaOH én dråbe ad gangen indtil løsningen rydder. Cool løsning til stuetemperatur og ph indstilles til 7,4. Bruge den frisklavede løsning umiddelbart eller holde ved + 4 ° C og beskytte mod lys.
- En gang, at Inkubationstiden er udløbet, skal du fjerne cellekulturmedium indeholdende TiO2 NPs. Skyl cellepopulationer engang med friske næringssubstratet og en gang med PBS (2 mL). Fjerne PBS, skylles hurtigt med en alikvot af friske og kolde PFA (4% w/v, + 4 ° C).
- Tilføje PFA (2 mL, 4% w/v, + 4 ° C). Inkuber 15 min ved stuetemperatur.
- Fjerne PFA, skyl celler med PBS (2 mL, 3 gange, 5 min) under omrøring.
Pause punkt: Disse kemisk fast prøver kan bruges til "springet-freeze" procedure efter fluorescens imaging (gå til trin 5) eller bruges kun til fluorescens imaging (gå til trin 4.3).
- Pletten kernen med Hoechst33342 inkubere celler i 10 min i PBS. Hoescht33342 bruges på en slutkoncentration på 500 nM. Efter inkubering fjerner løsningen og skyl med PBS.
Forsigtighed: Hoechst33342 er celle permeant og kan være giftige. Undgå direkte kontakt, og brug handsker under forberedelsen og ved hjælp af Hoechst33342.
Kritisk: sikre, Hoechst33342 farvning løsning frisk er udarbejdet og vedligeholdes under sterile forhold. - Proces fast prøver i situ og enkelt celle imaging ved hjælp af Fluorescens mikroskopi (figur 1).
5. "springet-frysning" fiksering og dehydrering
- Forberede en aluminiumplade overførsel ved at køle det i flydende kvælstof. Butik pladen ind i en kasse fyldt med flydende kvælstof og vedligeholde plade overflade over den pågældende væske i den kolde kvælstof damp.
Bemærk: Overførsel plade kan være lavet af en metal plade (her, vi brugt aluminium) der kunne køles til flydende kvælstof temperatur, og der kan indtaste fryse-tørretumbler prøve salen.
Kritisk: Boksen skal holdes lukkede så meget som muligt for at forhindre vand dampudfældning overfladen, kold plade. Prøven opbevares på pladen under forberedelse bør ikke være omfattet af flydende kvælstof. - Skyl celler engang i substratet og derefter to gange mere, kort, i sterilt og ultrarent vand at få slippe af med nogen spor af resterende ekstracellulære salte.
Kritisk: Sikre medierne frisk tilberedt og vedligeholdes under sterile forhold. Opvarm alle medier ved 37 ° C før de bruges. Skylles skal være meget kort (få sekunder) og overskydende væske på prøverne fjernet så hurtigt som muligt. - Springet-fryser cellerne ved-150 ° C i flydende nitrogen-kølet 2-methylbutane under 30 s og sted overføre dem på aluminium plade. Opbevare prøver her under forberedelsen af alle andre prøver. Når prøverne er alle cryofixed, overføre alt-i-gang ved at placere overførsel plade i en fryse-tørretumbler.
Kritisk: Den overordnede cryofixation proces bør ikke vare mere end 20 min for at forhindre konstruktionsmæssige ændringer at dukke op i prøver opbevares midlertidigt i boksen overførsel. - Frysetørre prøver ved hjælp af de følgende sekvenser: 1) udføre en primær udtørring i 12 til 24 timer (-99 ° C, 10-3 mbar) ved lavt tryk og lav temperatur, derefter 2) udføre en sekundær udtørring fase i mindst 24 timer, øge temperaturen i plade til + 40 ° C samtidig holde trykket lav (+ 40 ° C, 10-3 mbar).
Forsigtighed: Flydende nitrogen er ekstremt kolde og kan forårsage alvorlige forfrysninger eller øje skader ved kontakt. Bruge tilpasset bænk top beholdere til transport og bære sikkerhedsudstyr (kryogene handsker, øjen-og ansigt).
Forsigtighed: 2-Methylbutane er yderst brandfarlig. En skadelig forurening af luften kan nås hurtigt til fordampning af dette stof på + 20 ° C. Undgå indånding, indtagelse eller kontakt med huden. Bruge vejrtrækning og øjenbeskyttelse og beskyttelseshandsker. Brug altid en velfungerende kemiske stinkskab. Opbevares ved + 4 ° C.
Kritisk: Brug et termometer (-150 ° C) til at overvåge 2-Methylbutane temperaturerne under "Springet-freeze" session. 2-methylbutane skal opbevares køligt i en flydende fase. Overførsel af cryofixed prøver til den omgivende atmosfære kan forårsage cellulære skader forårsaget af temperaturstigning eller vanddamp kondensering på prøveoverfladen. I overensstemmelse hermed, overførslen bør gøres så hurtigt som muligt (30 s)
Pause punkt: Efter cryofixation, kan prøverne opbevares ved stuetemperatur i flere dage i steril og tørre forhold (beskyttet mod støv og fugt). Omhyggeligt håndtere prøverne med fine pincet og placere dem i en steril 12-godt plade forseglet med parafilm. Tørremidlet kan bruges til at tørre atmosfæren.
6. nukleare Microprobe analyse
Bemærk: Nukleare Microprobe analyse blev udført i den microbeam linje i AIFIRA (applikationer Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions da Région Aquitaine) ved hjælp af supplerende ion beam analytiske teknikker partikel induceret X-ray Emission (µ- PIXE) og Scanning Transmission Ion mikroskopi (µ-STIM). Anlægget er baseret på en 3,5 MV partikelaccelerator levere lys ion bjælker i rækken MeV energi. 22 , 23
Pause punkt: AIFIRA er en ion beam facilitet hostet af universitetet i Bordeaux, der giver en adgang til nationale og internationale hold efter en videnskabelig vurdering af de foreslåede eksperiment.
- Montere PEEK prøve indehavere på en apertured plade med dobbeltklæbende tape.
- Læg pladen støtte prøven i et lodret plan vinkelret på bjælken retning.
- Luk analyse kammer og vakuum analyse kammer.
- Scanning Transmission Ion mikroskopi (µ-STIM)
Bemærk: STIM bruges til at registrere datadensitet maps af celler efter konvertering af energitab til cellulære masse, at drage fordel af det faktum, at energitabet er proportional prøve datadensitet (udtrykt i µg.cm-2).- Bruge en 2 MeV Helium (He+) microbeam som en sonde med en størrelse i brændplanet af omkring 300 nm i diameter og på lave flydende (2000 ions.s-1). Foranstaltning energien af de overførte ioner med en planar silicium detektor (PIPS detektor, 25 mm2, 11 keV energi beslutning @ 5.4 MeV), placeret bag prøven i lysbundtets akse.
- Partikel induceret X-ray Emission (µ-PIXE) og Rutherford Backscattering massespektrometri (µ-RBS).
Bemærk: µ-Pixe og µ-RBS analyser giver den geografiske fordeling og kvantificering af grundstoffer med en sub mikrometer opløsning.- Brug et 1,5 MeV proton (H+) microbeam (50-150 pA), fokuseret ned til en diameter på 1 µm og scanning over de samme celler af interesse spottet af STIM fra 4 til 8 timer og omkring 100 x 100 µm2.
- Indsamle induceret X-ray fotoner udsendes fra atomer til stede i prøven (tungere end Na) af en høj opløsning Si(Li) solid-state detektor (145 eV energi opløsning, @Mn-Kα) placeret på 45 ° fra indgående lysbundtets akse. Brug den detekterede photon energi til at identificere art udledere (f.eks Z af element) og X-ray intensitet til at bestemme element koncentration.
- Samtidig indsamle back-spredt protoner ved-135 ° med en silicium detektor (delvist forarmet detektor, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5.4 MeV) til at måle det samlede antal indgående partikler og normalisere X-ray intensiteter.
Kritisk: En samling af certificerede Kalibreringsstandarder for atomic koncentration kvantificering bruges for at kalibrere X-ray detektorens respons. Referencemateriale er en samling af tynde atomic film deponeres på 6,3 µm tykt Mylar folier. Udsendes X-Ray energier spænder fra 0,6 (Li, K line) til 20,2 keV (Rh, K line).
7. dataanalyse
- Rekonstruere kemiske grundstoffer kort ved hjælp af IBA-J plugin for ImageJ. 24
Bemærk: Dedikeret software i form af et plugin for ImageJ er udviklet til at behandle rå nukleare microprobe analyse data. Rå data svarer til en liste over begivenheder som følge af partikel beam interaktion med celler, der er registreret sammen med positionen stråle i kronologisk rækkefølge.- Bruge IBA-J plugin til at sortere begivenheder efter deres type: indberetter ion energi (STIM), backscattered ion energi (RBS) eller X-ray photon Energi (PIXE). Derefter behandle særskilt hver datatype.
- Beregne STIM område tæthed kort
- Beregne gennemsnitlige X-ray photon Energi spectra og definere for hvert grundstof af interesse et energi-vindue for at hente elementet geografiske fordeling.
- Definere områder af interesse (ROI) (f.eks. individuelle celler, tætte struktur, aggregater, osv.) og beregne de tilsvarende x-ray spektre.
- Analysere de tilsvarende RBS spektre for at beregne det samlede antal hændelse partikler25.
- Passer X-ray spectra ved hjælp af Gupix software26 for at bestemme element koncentrationen for hver ROI.
Bemærk: Typisk grænse detektionsgrænsen (LOD) for metoden er i række 1 til 10 µg.g-1 i tør masse alt efter atomnummer elementer (LOD er faldende med Z).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellekultur og fluorescens billeddannelse af fluorescently mærket TiO 2 NPs
Vi designede en prøveholderen tilpasset cellekultur, celle håndtering samt multimodal analyse. Specifikt, var det vigtigt at indehaveren tilladt rutinemæssig Optisk mikroskopi som godt som nukleare microprobe analyse og billedbehandling. Denne prøveholderen er baseret på en 2 µm tykt polycarbonat folie deponeret på en PEEK ramme. Celler er direkte dyrkes på polycarbonat, i sterilt dyrkningsbetingelserne for flere dage og derefter brugt til forskellige eksperimentelle indstillinger, såsom NPs eksponering.
Den kemiske overflade lempelse med fluorophores (TRITC) tilladt påvisning af TiO2 NPs samt deres i situ og in vitro- lokalisering i levende eller PARAFORMALDEHYD fast celler ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Cellekerne og mitokondrier var farves ved hjælp af den vitale-dye Hoechst33342 (blå for kernen) og den transfected Matrix-roGFP (grøn for mitokondrierne), henholdsvis. Denne flere farvning tilladt den intracellulære lokalisering af TRITC-TiO2 NPs (af sin red udsender fluorescens) 20 h efter eksponering. NPs fandtes kun i cytoplasma af udsatte celler med ingen opdagelse i kernen. NPs var tilfældigt lokaliseret i regionen perinuclear af cytoplasmaet og helt udelukket fra mitokondrierne (ingen overlapning mellem TRITC og normal god landbrugspraksis signaler).
Selvom Fluorescens mikroskopi er meget nyttig til at lokalisere NPs inde udsatte celler, er det ikke stand til at vurdere det nøjagtige antal af NPs pr. celle. Den største vanskelighed Fluorescens mikroskopi om kvantificeringen af NPs er forbundet med usikkerheden om (i) antallet af fluorophores knyttet til en given NP og blegning stabiliteten i den valgte fluorophore under observation og (ii) sammenlægning tilstand af NPs inde i cellen.
Figur 1 : in vitro- og in situ fluorescens imaging U20S transgene celler udtrykker Matrix-RoGFP og udsat for TRITC-TiO 2 NPs. U2OS celler (top) markeret med Hoechst33342 (blå), Matrix-roGFP (grøn) er udsat for 4 µg.cm-2 TRITC-mærket TiO2 nanopartikler (rød) til 20 h. observationer indikerer at TiO2 NPs samlede i celler i en perinuclear region. Skalalinjen: 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
At overvinde disse mangler, nukleare microprobe analyse techniquesprovide en komplementær tilgang til de konventionelle Optisk mikroskopi på grund af deres følsomhed over for de nationale parlamenter, der forhindrer brug af enhver mellemliggende signal som fluorescens fra en podede farvestof. De er desuden også fuldt kvantitative, leverer data om de subcellulære biokemiske indhold, som ellers er ukendt, og (ii) den intracellulære mængden af NPs på enkelt celle-niveau.
Cryofixation af celler efter live imaging.
Det højeste begrænsning i udførelsen af nukleare microprobe analyse er at arbejde under vakuum betingelser. Vi har udviklet en celle fiksering protokollen gør det muligt for bevarelsen af den biologiske ultrastruktur og biokemiske integriteten af biologiske modellen. Kemisk fiksering er kendt for at ændre mikronaeringsstof sammensætningen af celler, fordi det kræver udskiftning af deres cellulære medium af en polymer, der anvendes til at bevare den cellulære ultrastruktur. Desuden, fjernelse af vand også udgivelser frie ioner og andre arter, som ændrer samlet prøve sammensætning. Derfor bliver det obligatorisk at give prioritet til en fysisk fiksation metode, navnlig kryogene metoder. Disse kryogene procedurer fremkalde en swift ophør af den cellulære aktivitet, og dette i millisekund tidsskala.
Nukleare microprobe analyse mikroskopi og kvantificering af NPs cellulære målestoksforhold.
Scanning transmission ion mikroskopi (µ-STIM) og partikel-induceret X-ray emission (µ-PIXE) analyse blev udført på prøver efter cryofixation og dehydrering at opnå præcise kvantitative data på deres elementært kemiske sammensætning.
µ-STIM billeder afslørede de lokale forskelle i tæthed og giver mulighed for påvisning af cellestrukturer som kernen og cytoplasmaet. Selvom beam laterale opløsning giver mulighed for observation af tætte strukturer så smalle som 300 nm bred, lignende tynde aggregater synlige her i cytoplasmaet, STIM metoder kan ikke diskriminere mellem NP aggregater og andre tæt cellulære strukturer. Dette skyldes, ligesom for transmissions Elektron Mikroskopi (TEM), den fysiske proces fører til variation i overføres energi er samspillet mellem den indgående ion og den atomare elektron Sky. I modsætning til TEM analyse, forhindre fordi den hele cellevolumen er analyseret, lokale tykkelse variationer forskelsbehandling mellem høj-Z strukturer og en lokal forøgelse af cellulære tæthed.
Figur 2 : Billeder af tæthed og elementært distribution fremstillet ved µ-STIM og µ-PIXE på cryo-fast U2OS celler. U2OS kontrol celler (op) er i forhold til udsatte cryo-fast U2OS celler (udsat til 4 µg.cm-2 TiO2 NPs, ned) og observeres ved hjælp af nukleare microprobe analyse/mikroskopi. STIM mikroskopi (venstre, gråtoner maps) afslørede tætte samhandelen eller ekstra cellular strukturer (nucleus, salt aggregater, nanopartikler). Den rumlige opløsning (300 nm) er sammenlignelig med Fluorescens mikroskopi og viser strukturer såsom NP aggregater i regionen perinuclear. Identifikation af strukturer baseret kun på deres tæthed kan alligevel være tvetydige. µ-PIXE elementært kort over K, P og Ti (termisk farveskala) er komplementære µ-STIM Maps. De kan bruges til at sikre tilstedeværelsen af NPs i celler. Hver celle kan analyseres individuelt med hensyn til element koncentration (Se figur 3). Skalere barer: 10 µm. farveskalaer spænder fra minimum (blå) til maksimal intensitet (grå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Som illustreret i figur 2, µ-STIM rendering giver mulighed for anerkendelse af individuelle celler inden for både en befolkning, og også intracellulære sub rum såsom nucleolus og kerne. Desværre, og som nævnt tidligere, kunne NPs ikke altid registreres ved hjælp af µ-STIM genopbygning.
Partikel-induceret X-ray emission (µ-PIXE) analyse giver ikke kun den kemiske sammensætning af prøven, men også deres elementært kortlægning (figur 2). I samspil med den spændende stråle undergår de kemiske elementer atomic excitation-de-excitation processer, der i sidste ende fører til emission af en foton, som udviser den karakteristiske energi af elementet ophidset atomnummer. Et karakteristisk højdepunkt spektrum er bygget fra summen af alle de udsendte photon begivenheder og betragtes som en kemisk underskrift af prøven.
Standard eksperimentelle opsætninger og detektorer anvendes til µ-PIXE eksperimenter tillade samtidige kvantificering af alle elementer tungere end Nielsen med en 1-10 µg.g1 tør masse detektionsgrænsen. Nøjagtighed i målingen af elementært koncentrationer er normalt begrænset til omkring 20% på grund af afgift samling og detektor effektivitetsgevinster.
I denne undersøgelse er fordelingen af elementer som kalium og fosfor og at kvantificere den intracellulære mængden af TiO2 NPs med titanium kortlægning observeret af nukleare microprobe analyse. Grundstof maps er beregnet efter fotonerne er sorteret efter stråle position på timingen af registrering og udvælgelse af en energi vindue centreret omkring et specifikt element. Kortene er repræsentant for antallet af registrerede hændelser på positionen beam og er kvantitative. Både støj og baggrunden er numerisk simuleret og filtreret ud. Kemiske kortlægning kan desuden bruges til at udtrække den lokale PIXE spektrum kræves for kvantificering.
Som illustreret i figur 2, fosfor homogen måde distribueres i cellen med, som forventet, en langt højere koncentration på det nukleare område. Kalium er ensartet fordelt i cellevolumen. Titanium er beliggende i regionen cytoplasmatisk perinuclear i form af aggregater, som tidligere observeret ved hjælp af Fluorescens mikroskopi (figur 1). NPs vises den samme perinuclear lokalisering uanset deres overflade tilstand: functionalized (figur 1) eller indfødt (figur 2). I mellemtiden, ingen spor af titanium blev opdaget i kontrol celler bekræfter at titanium distribution observeret af µ-PIXE skal tilskrives TiO2 NPs, efter aftale med vores tidligere analyser af Fluorescens mikroskopi.
Hertil kommer, som illustreret i figur 2, er det muligt at udtrække den intracellulære fordeling af NPs og kvantitative NPs koncentrationer fra specifikke områder af interesse. Baseret på STIM maps og i sammenhæng med fosfor/kalium-distributioner, er enkelt celle analyse muligt.
Figur 3 : Enkelt celle kvantitativ analyse ved hjælp af µ-PIXE. Enkelte X-ray spectra beregnet for celler, der er vist i figur 2 kan monteres for at bestemme element koncentration på cellulært niveau. Denne funktion er særlig interessant for NP analyse hvor cellulære koncentrationer normalt vise stærk variationer indenfor den samme population. For eksempel, for det samme betyde eksponering, Ti koncentrationer spænder fra 0,2 op til 1,8 µg.cm-2. Kontrol svarer til ubehandlet cellepopulationer. Eksponering dosis: 4 µg.cm-2. Boxplots repræsenterer fordelingen af cellulære koncentrationer med middelværdien (vandret streg) og barer hælder mod laveste og højeste målte værdier. Styre celler: N = 14; Udsat celler: N = 16.
Derfor har vi ikke blot kvantificeres det gennemsnitlige indhold af Titan i en celle population men også vist titanium fordeling pr. celle i en befolkning i en specifik eksperimentel tilstand. Den mediane indhold af titanium målt her er ganske lav (500 ng.cm-2) i forhold til 4 µg.cm-2 eksponering dosis af cellen befolkningen (figur 3) og variation mellem celler er stor (Ti koncentrationer spænder fra 0,2 op til 1,8 µg.cm -2 efter de analyserede celler). Vi har også bemærket en stigning af intracellulære ioner som kalium og calcium i udsatte prøver tyder på en cellulær ændring homøostase induceret af tilstedeværelsen af TiO2 NPs, som tidligere beskrevet af flere forfattere. 21 , 27
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metode at give nyttige oplysninger ud over hvad der er muligt med andre billeddiagnostiske teknikker, navnlig på subcellulært niveau. Ud over sin billeddannelse evne tilbyder nukleare microprobe analyse også mulighederne for kvantificering af kemiske elementer ind i sammensætningen af en biologisk prøve. I det foreliggende arbejde, vi undersøgte menneskelige cellepopulationer og fokuseret ned til analyse af en valgte region af interesse baseret på en enkelt celle udsat for TiO2 NPs. Kombination med andre teknikker giver både morfologiske cellulære imaging og præcise kvantitative data om elementære kemiske sammensætning.
Du kan med succes anvende nukleare microprobe analyse, er det obligatorisk at overholde følgende punkter for at undgå potentielle faldgruber. For det første er det bydende nødvendigt at bruge en kryogene protokol til celle fiksation for at bevare sin ultrastruktur og dens biokemiske integritet. For det andet er det også obligatorisk at udføre analyse af tynde prøver med tykkelse under 20 µm. Hvis det er nødvendigt, kunne skæring af cryofixed prøver udføres. Prøverne bør absolut holdes frossen. For det tredje er det også vigtigt at huske at nukleare microprobe analyse afslører en to-dimensional repræsentation af biologiske prøver. Grundstof distribution opnået er således en todimensional projektion, der eventuelt kunne indføre fejlfortolkninger. Denne begrænsning vil blive omgået i fremtiden ved brug af tomografisk erhvervelse.
Nukleare microprobe analyse har også begrænsninger. Det må understreges, at dens vigtigste begrænsning er behovet for at udføre analyse under vakuum. Derfor er det bydende nødvendigt at bruge celle fiksering protokoller, der bevarer celler ultrastruktur og biokemiske integritet. Det er derfor nødvendigt at teste modstanden i de biologiske prøver til cryogenics procedure (uden tilsætning af kemiske harpiks). Dette kan begrænse brugen af nukleare microprobe analyse.
En anden begrænsning er tilgængeligheden til faciliteterne for at udføre nukleare microprobe analyse. De tildelte beam tider er derfor undertiden begrænset, og dette er en yderligere betingelse for denne form for tidskrævende eksperiment. Flere timer er ofte behov for en erhvervelse.
Denne teknik er forskellig fra andre analytiske metoder, herunder mikroskopi, massespektrometri (MS), Induktivt koblet plasma MS (ICP-MS), væskekromatografi MS (LC - MS), og radioaktiv isotop. Sidstnævnte er faktisk anvendes til at anslå den cellulære dosis af kemiske elementer, men de er kun i stand til at give oplysninger på en makroskopisk skala dvs på en makroskopisk beløb af en stikprøve. Ingen af dem kan give adgang, ligesom nukleare microprobe analyse til en præcis registrering og kortlægning af en subcellulært dosis af bestemte grundstoffer (ioner, metal eller metal oxide NPs). Disse data hjælpe med adgang til en yderligere systematisk undersøgelse af dosis-respons evaluering.
Den præcise vurdering af dosis når man studerer internalisering af NPs i celler er afgørende fra både kvantitative NP toksikologi og farmakologi synspunkter. Som foreslået af den store uoverensstemmelse observerede NP indholdet, som viser en 10-fold forskel mellem minimum og maksimum observerede koncentrationer (figur 3), cellulære gennemsnitskoncentration kan ikke være en relevant parameter til at beskrive den fænomenet med partikel eksponering. Dette gælder især, når en tærskel effekt formodes for at finde sted, fordi inhomogene dosis eksponering kan føre til modstridende observationer. Eftersom fraktionerede arten af nanopartikler vises tydeligt på cellulært niveau, rejser denne undersøgelse derfor igen spørgsmålet om relevansen af metoder baseret på analyse af globale variabler i behandle spørgsmål omkring funktionsmåden af celler udsat for inhomogene doser af forurenende stoffer.
Som illustreret i tilfældet studerede her, giver observation og kvantificering af NPs inden for enkelte celler os til bedre at forstå Bioakkumuleringskriteriet af endogene/eksogene elementer som metaloxid NPs. Dette er en kritisk opgave for yderligere anvendelser af NPs i biomedicin, hvor en dårlig forståelse af de underliggende NP distribution i celler kan føre til fejlfortolket resultater.
Denne protokol fremhæver egnethed ved hjælp af nukleare microprobe analyse med andre teknikker til fremtidige vurderinger af NP interaktioner med biologiske prøver. Den kvantitative tilgang giver oplysninger om virkningerne af sådanne nationale parlamenter med hensyn til påvisning, identifikation, lokalisering og kvantificering på niveau med en enkelt celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Serge Borderes for lede og redigering af video. Agenturets franske National forskning støtter forskningsprogrammet TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). CNRS og det Europæiske Fællesskab som integration virksomhed leveret "støtte af offentlige og industrielle forskning ved hjælp af Ion stråle teknologi (ånden)" under EF kontrakt n ° 227012. Dette arbejde er blevet støttet af Marie Curie-aktioner - indledende uddannelse netværk (ITN) som en "integrere aktivitet støtte Postgraduate Research med praktikophold i industri og uddannelse Excellence" (SPRITE, D1.3) under EF kontrakt nr. 317169. C'NANO Grand Sud Ouest og regionen Aquitaine støtter forskningsprogrammet TOX-NANO (n ° 20111201003) og forskningsprogrammet POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
- Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
- Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
- Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
- Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
- Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
- Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
- Olesik, J. W. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , Elsevier Ltd. (2014).
- Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
- Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
- Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
- Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
- Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
- Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
- Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
- Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
- Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
- Mayer, M. SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113. , Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).
- Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
- Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).
