Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

בחיי עיר זיהוי, כימות תא בודד של תחמוצת מתכת חלקיקים באמצעות ניתוח Microprobe גרעיני

doi: 10.3791/55041 Published: February 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים הליך איתור אלמנטים כימיים נוכח באתרו בתוך התאים של האדם, כמו גם שלהם כימות במבחנה . השיטה הוא מתאים היטב לכל סוג התא, שימושי במיוחד עבור בדיקות כימיות כמותית של תאים בודדים בעקבות במבחנה חשיפה חלקיקי תחמוצת מתכת.

Abstract

טכניקות אנליטיות מיקרו מבוסס על יסוד כימי הדמיה לאפשר לוקליזציה כימות של ההרכב הכימי ברמה התאית. הם מציעים אפשרויות חדשות עבור אפיון מערכות החיים, מתאימים במיוחד עבור איתור, לוקליזציה של לכימות הנוכחות של חלקיקי תחמוצת מתכת הן הביולוגיים והן את הסביבה. אכן, כל הטכניקות הללו עומד בדרישות רלוונטי מבחינת רגישות (i) (מ 1 עד 10 µg.g-1 של המוני יבש), והרזולוציה המרחבית של טווח מיקרומטר (ii) ו- (iii) רכיבים מרובים זיהוי. לאור מאפיינים אלה, microbeam יסוד כימי הדמיה ניתן בעוצמה משלימים טכניקות הדמיה שגרתיות כגון אופטי ומיקרוסקופיה זריחה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניתוח microprobe גרעיני תאים בתרבית (U2OS) נחשפים טיטניום דיאוקסיד חלקיקים. התאים חייב לצמוח, להיחשף ישירות בעל מדגם שתוכנן במיוחד נעשה שימוש במיקרוסקופ אופטי, בשלבי ניתוח microprobe גרעינית. מים עמוקים-הקפאה קריוגני קיבעון של הדגימות שומרת על הארגון הסלולר והן את התפלגות יסוד כימי. Microprobe גרעיני סימולטני ניתוח (סריקה שידור יון מיקרוסקופ, מסות backscattering רתרפורד, החלקיקים הנגרמת שקרינת x) המבוצעת על הדגימה מספק מידע אודות הסלולר צפיפות, התפלגות מקומי יסודות כימיים, כמו גם את תוכן סלולרי חלקיקים. יש צורך הולך וגדל כלים אנליטיים כאלה בתוך הביולוגיה, במיוחד בהקשר המתעוררים של ננו טוקסיקולוגיה, ננו-רפואה אשר חייב להיות העמיקה הבנתנו של אינטראקציות בין חלקיקים דגימות ביולוגיות. בפרט, כפי microprobe גרעיני ניתוח אינה דורשת חלקיקים כדי להיות מתויג, ננו-חלקיק abundances הם לכימות עד לרמת תא בודד בקרב אוכלוסיה תא, ללא תלות במצבן משטח.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הומאוסטזיס הסלולר נקבעת על ידי ספיגת שליטה, הטמעה, לוקליזציה תאיים של יסודות קורט שונים (יונים, מתכות, חומרים אורגניים נדיפים אקסוגני). רכיבים אלה הם לעתים קרובות בצורה של עקבות, אבל בכל זאת עשוי להיות בעל השפעה ניכרת בפיזיולוגיה המערכת. לפיכך, המחקר של ביוכימיה התא במצבים רגילים והן הפתולוגיים/הדגיש היא צעד המפתח לקראת הבנה כללית של המנגנונים התאיים מטבולית. לכן, התפתחות טכניקות הדמיה אנליטיים שמאפשר חקירת תאיים abundances כימיים, הארגון מבניים, פונקציות מטבוליות הקשורות שלהם הופך להיות הכרחי. שיטות מעט מאוד מסוגלים לספק בחיי עיר כמותיים פיסת מידע הנוגע לטבעו כימי הכולל של דגימה נתון. מלבד שיטות ניתוח דגימות בצורה גורפת, ניתוחים בחיי עיר לשקול דגימות ביולוגיות ב integrality שלהם מבלי לאבד מידע בנפח גדול ומבניים, ובכך לשמר שלהם כימיקלים המרכיבים אותה (יסודות קורט, יונים), חלבונים. יתר על כן, כמו ננוטכנולוגיה להמשיך לפתח, הדמיה משופר ושיטות אנליטיות ניטור סביבתי את המשקל הסלולר יהיה צורך להתבונן ולכמת ננו-אובייקט התנהגויות ואינטראקציות. 1

חלקיקים (NPs) הוגדרו כאובייקטים מפגין הממד פנים אחד לפחות ב- טווח 1 ל- 100 ננומטר. 2 בשל תכונותיהם physicochemical מסוים, NPs נמצאים בשימוש נרחב בתעשייה. NPs מועסקים ביו-יישומים, ננו-רפואה. 3 , 4 למרות המאפיינים physicochemical רבים של NPs, הם עשויים ליצור כמה סיכונים של השפעות שליליות על בריאות האדם והסביבה. סיכונים אלה יכולה להיגרם על ידי חשיפות ממושכות והן חוזרות ברמות ריכוז שונים, זה לא עדיין בבירור הקימה. 5 , 6 , 7 , 8 בפרט, גורלו של NPs בתוך התאים ואת התגובות הסלולר משויכים הם, עד כה, לא לגמרי תיאר. . זאת בחלקו בשל המחסור שיטות המאפשרות זיהוי, כימות של NPs למביטה בתא יחיד. 9

כלים אנליטיים קלאסית המשמש להערכת המינון הסלולר של חלקיקים הם microscopies, ספקטרומטר מסה (MS), מצמידים inductively פלזמה MS (ICP-MS)10,11 ו כרומטוגרפיה נוזלית ש-MS (LC-MS), אבל הם מספקים רק מידע שימושי על הסולם מאקרוסקופית. אף אחד מהם לא יכול לספק הערכה מדויקת של התוכן NPs subcellular או ההתפלגות NPs ללא השימוש בשיטות fractionation. הערכה שיטתית של המנה-תגובה ולכן בלתי אפשרי באמצעות שיטות אלה, לעומת שיטות בהתבסס על ספקטרוסקופיה אטומית כגון גרעיני microprobe ניתוח12,13, סינכרוטרון רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ14 , ויון משני ספקטרומטר מסה (SIMS). 15 , 16 שיטות אלה הינם מעניינים במיוחד הם משלימים את תצפיותיו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, בייחוד כאשר NPs לא יכול להיקרא עם מולקולות פלורסנט נלמדים ובכך במצבם המקורי. במידה מסוימת, אפילו כאשר NPs מורכבים עם fluorophores, (i) כימות נשאר קשה כי רמת תיוג לכל NP אינו ידוע (ii) שינוי כימי של המשטח NP רשאית לשנות תפוצתו הסלולר.

במאמר זה, אנו מתמקדים שיטה המבוססת על שילוב של טכניקות microprobe גרעיני מכוון הדמיה של מורפולוגיה הרכב היסודות של דגימות ביולוגיות בלה מז'ור, מינור, ולאתר ריכוזים.

ניתוח microprobe גרעיני מוכיחה להיות מתאים במיוחד עבור המידה של יסודות כימיים קורט ברקמות ביולוגיות. רזולוציה לרוחב הקורה (0.3 עד 1 מיקרומטר) והן רגישות בזיהוי יסוד כימי (מ 1 עד 10 µg.g-1 יבש מסה) מתאימים היטב מחקרים ברמה התאית. Microprobe גרעיני טכניקות מבוססים על זיהוי החלקיקים (פוטונים, אלקטרונים, יונים) הנפלטים אחרי קרן יון (ריצה בדרך כלל על תהליך אנרגיות) אינטראקציה עם אטומים נוכח במדגם. אינטראקציות המתרחשים בתאים הם בעיקר: 1) עירור/יינון של אטומים ואחריו של פליטת פוטונים לאחר אטומים להחזיר למצב היסוד שלהם; ו- 2) דיפוזיה של חלקיקים נכנסות מובילים כדי לשנות את האנרגיה שלהם, כיוון. מדידת חלקיקים הנפלטים אנרגיה allowsthe זיהוי של אטומים המעורבים באינטראקציה. כדי לבצע מיפוי של רכיבי, microbeam יון שוב ושוב נסרק על פני מדגם, לעיתים קרובות על פני שטח של-100 מיקרומטר 1002 המכיל מספר תאים. חלקיקים הנפלטים מזוהים, האנרגיה שלהם נרשם לכל תפקיד קרן. מיון החלקיקים בהתאם למיקום קרן, ולכן זיהוי המבנה אחראי הפליטה של חלקיקים כאלה היא המטרה של הטיפול נתונים. כאן, אנו מתארים בדיוק גישה המבוססת על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ וניתוח microprobe גרעיני כדי לאתר, כמו גם לכמת NPs אקסוגני על המאזניים הסלולר וסלולריות תת, במטרה לחקור את ההשלכות של NP אינטראקציות עם החיים מערכות. במיוחד נתמקד ההזדמנויות המוצעים על ידי שיטה זו מבחינת בחיי עיר כימות של אגרגטים טיטניום דיאוקסיד חלקיקים (TiO2 NPs) ברמת subcellular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. מחזיק קליניים

  1. מדגם בעל עיצוב והכנת
    1. ייצור בעל מדגם על ידי קידוח ריבוע 5 מ מ x 5 מ מ בתוך מסגרת הצצה בעובי 1 מ מ.
    2. נקי על ידי שטיפה עם אתנול 70% (v/v) ולשמור על צלחות סטרילי עד מוכן לשימוש.
      רומן בעל מדגם מתאים תרבית תאים וטיפול תא נדרש. זה צריך להיות מתוכנן עבור תא culturing, תצפיות במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי, ו microprobe גרעיני אנליזה והדמיה. זה מחזיק עשוי מסגרת ' מבט מהיר '13.
  2. הכנת מחזיק הדוגמא
    1. הכינו את הפתרון Formvar על ידי המסת 1 מ ג של אבקת Formvar ב 100 מ של כלורופורם.
    2. למתוח את רדיד האלומיניום פוליקרבונט על מסגרת מתכת כך שיציג אין קיפול.
    3. השתמש טיפ סטרילי כדי להפיץ את הפתרון Formvar סביב החור בעל מדגם.
    4. . תניח בעדינות את בעל מדגם עם דבק על גבי מסכל נמתח פוליקרבונט (ריבוע 5 מ מ x 5 מ מ)
    5. חזור על הרצף הקודם כדי להתכונן בעל מדגם אחד כל שכפול.
      רומן הסרט פוליקרבונט (PC) הוא מסתיימים, מספיק עבה ועמיד בפני פרוטוקולים שונים של אילוצים אנליטית.
      זהירות- כלורופורם הוא רעיל. הימנע שאיפה, בליעה או מגע עם העור. השתמש תמיד ברדס fume כימי בתפקודה, המסננים המתאימים.
  3. לדוגמה מחזיק עיקור
    1. מקום בעל מדגם הנטען בקבוקון חרוט עם 50 מ"ל אתנול 70% (v/v) תחת עצבנות ב 180 סל ד ו +37 ° C בן לילה, באמצעות תועמלן/חממה.
    2. יש לשטוף את מחזיק מספר פעמים ב מים מזוקקים סטריליים.
    3. האוויר יבש אותם בתנאים סטריליים, חושפים את האור האולטרה סגול (קוטל חידקים המנורה אבטחה ספסל, class II) במשך 30 דקות בכל צד.
    4. שומרים את הדגימות ב 12-ובכן סטרילי צלחות (אחד בעל מדגם לכל טוב) עד מוכן לשימוש.
      הערה: מחזיקי דגימה מרובות ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר צלחות 12-ובכן וסטרילי, יבש אטום עם מצלמות-מיקרוסקופים במשך מספר ימים.

2. צמיחה של תאים בעל הדגימה המתאימה.

התראה: פרוטוקול חייב להתבצע בספסל זרימה שכבתית אבטחה (Class II) כדי לא לכלול מזהמים מיקרו אורגניזמים. להתמודד עם אנטיביוטיקה (למשל פניצילין, סטרפטומיצין) עם כפפות. לכבד מומלצות בעת טיפול חומרים ביולוגיים (שורות תאים, מהונדסים גנטית נגזר תאים אנושיים).

קריטית: הקווים תא המשמשים צריך להיבדק על מנת להבטיח כי הם לא נגועים Mycoplasma.

  1. Transfect U2OS תא קו עם פלסמיד הנושאת מטריקס-roGFP 17,18,19 באמצעות שיטה תקנים בהתאם לפרוטוקול שנקבעו על-ידי היצרן.
  2. כדי לאשר תרביות תאים עם פלסמיד-לבצע החיישן, כדי למנוע אובדן פלסמיד, בחר ולתחזק את התאים transfected על המדיום המתאים תרבות.
  3. דמיינו transfected תאים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כדי להבטיח שתרביות תאים אירעה וכדי לאשר את הביטוי של זריחה התצוגה של הרשתית, צינורי רשת מיטוכונדריאלי19.
    להשהות את הנקודה: תאים שיכול להיות קפוא בחנקן נוזלי במשך מספר שנים.
  4. השתמש האוכלוסייה transfected התא על ידי culturing התאים המדיום המתאים על מנת לקבל תא confluent תת אוכלוסיות. לגדל תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% (v/v) CO2 באווירה רווי מים.
  5. זרע תאי ריכוז, כמה מהם ב- 80% הנהרות היום של קיבעון. בדרך כלל, ריכוז של 500 תאים לכל µL יכול לשמש. קציר תאים באמצעות µL 400 של טריפסין-EDTA 0.25% (v/v) ולשמור על 3 דקות ב 37 º C. להפסיק פעולה טריפסין 1 מ של תרבות בינוני. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 230 x g ו- +4 ° C, ואז להסיר את תגובת שיקוע והוסף האחסון הרצוי של מדיום תרבות טריים.
    הערה. הפרוטוקול ישימה לכל סוגי הסלולר והוא מספר התאים נזרע התלויים על גודל התא ועל תא הכפלת זמן.
    התראה: הימנע העמדת טריפסין, אנטיביוטיקה, סרום מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה. לשמור אותם סטרילי. לחלק את הפתרון מניות aliquots ומקפיאים -−20 מעלות צלזיוס. לאחסן את aliquots עד תאריך התפוגה. לשטוף היטב בגדר תא כדי להסיר לחלוטין את טריפסין. עקבות של טריפסין שיורית לעכב ולהקטין את היעילות ציפוי.
  6. לספור את התאים ולבצע לדילול טריים בינונית תרבות שלמה שמרו ב 37 ° C על מנת לקבל השעיה תא עם 500 תאים לכל µL.
    הערה: הריכוז של התליה תא חייב להיות מותאם כפונקציה של סוג התא, כדי צלחת טיפה 40 µL.
  7. צלחת טיפה 40 µL במרכז מסכל פוליקרבונט. בזהירות המקום המדגם 2 h ב +37 ° C, 5% (v/v) CO2 באווירה רווי מים.
    קריטי: ברגע המדגם ממוקמת בחממה, להגביל במידת האפשר כל תנועה מכנית לטובת תא מהיר קובץ מצורף. בהתאם לסוג התא, זה יכול להיות צורך דגירה התאים יותר מ 2 h ליעילות מיטבית platting. בדוק כי האווירה חממה הוא טוב רווי כדי למנוע טיפות מתאדים.
  8. בדוק כי תאים הם מחובר היטב על מסכל פוליקרבונט נעזרת במיקרוסקופ אופטי. בעדינות להוסיף 2 מיליליטר בינוני שלם טרי ולשמור במשך 24 שעות ביממה.

3. חלקיקים הכנה וחשיפה

הערה: פלורסנט לצבוע-השתנה TiO2 NPs היו תוכנן, מסונתז ו כימית שונה עם tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC). 20 , 21 שינוי פני השטח זה מאפשר זיהוי ננו-חלקיק, מעקב ולוקליזציה בחיי עיר וב ב cellulo בתאים קבוע וגם חי או אורגניזמים רב תאיים. 12 , 13 , 18

התראה: ננו חלקיקים יש לטפל בזהירות. הימנע שאיפה, בליעה או מגע עם העור. כדי למנוע הפצת באוויר, מתוחזקים חלקיקים בתמיסה (הנדסה גנטית מים).

  1. להכין השעיה של mg.mL 1− 1 שלTiO2 NPs במים הנדסה גנטית. לפזר את NPs2 TiO שימוש אינטנסיבי 1-מין sonication פולסים ב RT (750 W, 20 kHz, משרעת: 30%) באמצעות של מחולל אולטרא סאונד ו- microprobe חרוט ייעודי של.
  2. לדלל TiO2 NPs הריכוז הרצויה ביותר במדיום התרבות כדי להשיג על ההשעיה חשיפה של 4 µg.cm−2 (ריכוז סופי). להחליף בינוני עם נפח בינוני המכיל NPs על תאים המתאימים ומערבבים בעדינות להפצה הומוגנית של TiO2 NPs. הכן תאים שליטה באופן דומה ללא התוספת של TiO2 NPs.
  3. דגירה האוכלוסיות תא במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% (v/v) CO2 ואווירה רווי מים.

4. paraformaldehyde מיקרוסקופ קיבוע של זריחה.

  1. להכין פתרון טריים של פתרון paraformaldehyde (PFA, 4% w/v) במאגר פוספט מאגר מלוחים (PBS, pH 7.4).
    1. להמיס 4 גר' אבקה מחברים ב- 100 מ של PBS. מחממים את הפתרון עד 65 ° צלזיוס תוך ערבוב באמצעות מגנט של פגים בשכונה fume. להגדיל את ה-pH על-ידי הוספת 1 טיפה אחת של M NaOH עד הפתרון מנקה. מגניב הפתרון לטמפרטורת החדר והתאימו את ה-pH ל 7.4. השתמש הפתרון הטרי מיד או שתמשיכו +4 ° C, להגן מפני אור.
      הערה: פתרונות PFA מוכנות מראש יכול לשמש אולם הכנה המאולתרת של כדורגלן מבטיח איכות טובה יותר של קיבוע ושימור לטווח ארוך של הדגימות קבוע.
      התראה: כדורגלן רעיל; הימנע שאיפה, בליעה או מגע עם העור. השתמש תמיד ברדס fume כימי בתפקודה, המסננים המתאימים.
  2. פעם אחת, חלף זמן הדגירה, להסיר את המדיום התרבות התא המכיל טיו2 NPs. שטיפה האוכלוסיות תא פעם אחת עם טרי בינוני תרבות ופעם אחת עם PBS (2 מ"ל). הסר PBS, לשטוף במהירות עם aliquot של כדורגלן טריים וקרים (4% w/v, +4 ° C).
    1. להוסיף מחברים (2 מ"ל, 4% w/v, +4 ° C). דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הסר את כדורגלן, לשטוף את התאים עם PBS (2 מ ל שלוש פעמים, 5 דקות) תחת עצבנות.
      להשהות את הנקודה: אלה כימי קבוע דגימות יכולים לשמש עבור ההליך "מים עמוקים-אל תזוז" לאחר קרינה פלואורסצנטית הדמיה (םירוציק בשלב 5) או בשימוש רק עבור קרינה פלואורסצנטית הדמיה (ללכת צעד 4.3).
  3. כתם הגרעין עם Hoechst33342 המקננת התאים 10 דקות ב- PBS. Hoescht33342 ישמש בנקודת ריכוז סופי של 500 ננומטר. לאחר דגירה להסיר הפתרון ולשטוף עם PBS.
    התראה: Hoechst33342 תא permeant, עלולים להיות רעילים. להימנע ממגע ישיר, שימוש בכפפות בעת הכנת ושימוש Hoechst33342.
    קריטית: להבטיח כי Hoechst33342 מכתים פתרון טרי שהוכן וכי נשמר בתנאים סטריליים.
  4. תהליך קבוע דגימות בחיי עיר , תא בודד הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 1).

5. "מים עמוקים-הקפאה" קיבעון והתייבשות

  1. להכין צלחת אלומיניום העברה על ידי קירור זה חנקן נוזלי. חנות הצלחת לתוך תיבת מלא עם חנקן נוזלי, לשמור על פני צלחת מעל האדים קר חנקן נוזלי.
    הערה: יכול להיות עשוי לוח העברת בכל לוח מתכתי (כאן, השתמשנו אלומיניום) זה יכול להיות התקררה לטמפרטורת חנקן נוזלי, ואת זה יכולים להיכנס לתא ההקפאה-מייבש מדגם.
    קריטי: תיבת יש לשמור סגור במידת האפשר על מנת למנוע התצהיר אדי מים על גבי המשטח צלחת קר. המדגם המאוחסנים על הצלחת במהלך ההכנה לא יכוסה על ידי חנקן נוזלי.
  2. לשטוף את התאים פעם במדיום תרבות, ואז פעמיים יותר, בקצרה, במים וסטרילי, הנדסה גנטית כדי לקבל להיפטר עקבות של מלחי חוץ-תאית הנותרים.
    קריטי: ודא כי המדיה הם טריים המוכנים ולא נשמר בתנאים סטריליים. חום בכל אמצעי התקשורת ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש בו. יש לשטוף בטח מאוד קצר (מספר שניות), עודף של נוזלים על הדגימות להסיר כמה שיותר מהר.
  3. מים עמוקים-להקפיא התאים ב-150 מעלות צלזיוס בתוך נוזל מקורר-חנקן 2-methylbutane במהלך 30 s ומקום אותם על גבי האלומיניום להעביר לצלחת. חנות דוגמאות כאן במהלך הכנת כל דוגמאות אחרות. כאשר כל cryofixed הם דוגמאות, להעביר כל בו-זמנית על-ידי הצבת את הצלחת העברת מתקן הקפאת-ייבוש.
    קריטי: התהליך cryofixation הכולל צריך לא נמשך יותר מ 20 דקות על מנת למנוע שינויים מבניים יופיעו דוגמאות מאוחסנים באופן זמני תיבת העברה.
  4. שזה יבש והקפיא את הדגימות באמצעות רצפי הבאים: 1) לבצע לייבוש ראשוני של 12 עד 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) לחץ נמוך וטמפרטורה נמוכה, ואז 2) לבצע את שלב לייבוש משני עבור 24 שעות לפחות, הגדלת לטמפרטורה צלחת + 40 ° צלזיוס תוך שמירה על לחץ נמוך (+40 ° C, 10-3 mbar).
    התראה: חנקן נוזלי הוא קר מאוד והוא יכול לגרום נזק חמור כוויית קור או עין על קשר. השתמש מכולות העליון ספסל מותאם להעברה, ללבוש ציוד בטיחות (כפפות קריוגני, עין והגנה על הפנים).
    התראה: 2-Methylbutane הוא דליק ביותר. זיהום האוויר מזיקים ניתן להגיע מהר על אידוי של חומר זה ב +20 ° c הימנע שאיפה, בליעה או מגע עם העור. השתמש הנשימה ואת ההגנה על העין, כפפות מגן. השתמש תמיד ברדס fume כימי תקין. ניתן לאחסן ב +4 º C.
    קריטי: להשתמש מד טמפרטורה מתאימה (-150 מעלות צלזיוס) כדי לפקח הטמפרטורות 2-Methylbutane במהלך ההפעלה "מים עמוקים-אל תזוז". 2-methylbutane חייב להישמר מגניב בשלב נוזלי. העברת דגימות cryofixed האווירה הסביבתית עלול לגרום נזק עקב בטמפרטורה או אדי מים עיבוי על פני מדגם. בהתאם לכך, העברת צריכה להיעשות מהר ככל האפשר באופן סביר (30 s)
    להשהות את הנקודה: לאחר cryofixation, דוגמאות ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר ימים בתנאים סטריליים ויבש (מוגן מפני אבק ולחות). בזהירות להתמודד עם הדגימות עם מלקחיים בסדר ומניחים בצלחת 12-ובכן סטרילי אטום עם מצלמות-מיקרוסקופים. סופג לחות יכול לשמש כדי לייבש את האווירה.

6. גרעיני ניתוח Microprobe

הערה: ניתוח Microprobe גרעיני בוצע על קו microbeam של AIFIRA (יישומים Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en אקוויטניה Région) לשימוש בשיטות אנליטיות קרן החלקיקים הנגרמת שקרינת x (ממוצע-את יון משלימים פיקסלים) וסריקה שידור יון מיקרוסקופ (ממוצע-סאונד). המתקן מבוסס על מאיץ חלקיקים MV 3.5 אספקת קורות יון אור בטווח אנרגיה תהליך. 22 , 23

להשהות את הנקודה: AIFIRA הוא מתקן קרן יון בחסות האוניברסיטה של בורדו המציעה גישה נבחרות לאומיות ובינלאומיות לאחר הערכה מדעית של הניסוי המוצע.

  1. הר בעלי מדגם הצצה בצלחת apertured באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי.
  2. מקם את הצלחת תמיכה מדגם במישור האנכי בניצב לכיוון קרן.
  3. סגור לחדר ניתוח, אבק לחדר ניתוח.
  4. סריקה שידור יון מיקרוסקופ (ממוצע-סאונד)
    הערה: סאונד משמש לרישום מפות אמיתיות צפיפות של תאים לאחר המרה של אובדן אנרגיה מסה תאית, מנצל העובדה אובדן האנרגיה הוא יחסי מדגם הצפיפות אריאל (מבוטא µg.cm-2).
    1. להשתמש microbeam: הליום (He+) 2 תהליך בדיקה עם גודל במישור המוקד של בסביבות 300 ננומטר קוטר ו שטף נמוך (2000 ions.s-1). למדוד האנרגיה של היונים המשודרת עם גלאי הסיליקון מישורי (פיפס גלאי, 25 מ מ2, רזולוציה אנרגיה קוו 11 @ תהליך 5.4), ממוקמים מאחורי המדגם בציר הקורה.
  5. חלקיק המושרה שקרינת x (ממוצע-פיקסלים) ומסות Backscattering רתרפורד (ממוצע-RBS).
    הערה: ממוצע-פיקסלים וממוצע-RBS ניתוחים לספק את התפוצה המרחבית כימות של יסודות כימיים עם רזולוציה מיקרומטר המשנה.
    1. השתמש microbeam פרוטון (H.+) תהליך 1.5 (pA 50-150), התמקד עד קוטר של 1 מיקרומטר וסריקה מעל התאים באותו עניין על ידי סאונד בין 4 ל- 8 שעות ובסביבות 100 100x מיקרומטר2.
    2. לאסוף המושרה רנטגן פוטונים הנפלטים אטומים נוכח המדגם (כבד יותר Na) ברזולוציה גבוהה Si(Li) של מצב מוצק גלאי (145 eV אנרגיה רזולוציה, @Mn-Kα) ב 45 ° מהציר קרן נכנסות. משתמשים באנרגיה פוטון שאותרו כדי לזהות את טבעו של פולטי (למשל Z של יסוד) רנטגן בעוצמה כדי לקבוע ריכוז רכיב.
    3. במקביל לאסוף פזורים הגב הפרוטונים ב-135 ° עם גלאי הסיליקון (גלאי חלקית מדולדל, 25 מ מ2, 11 קוו FWHM @ תהליך 5.4) כדי למדוד את המספר הכולל של חלקיקים נכנסות, לנרמל את עוצמות רנטגן.
      קריטי: אוסף של סטנדרטים כיול מוסמכת על ריכוז אטומי כימות משמש על מנת לכייל את התגובה גלאי צילום רנטגן. חומר עזר הן אוסף של סרטים אטומי רזה שהופקדו על 6.3 מיקרומטר foils מיילר עבה. הנפלטים רנטגן אנרגיות נעות בין 0.6 (Li, קו K) 20.2 קוו (Rh, קו K).

7. ניתוח נתונים

  1. לשחזר מפות היסודות הכימיים באמצעות התוסף רשות השידור-J ImageJ. 24
    הערה: תוכנה ייעודית בצורה של תוסף עבור ImageJ פותחה כדי לעבד נתונים ניתוח microprobe גרעיני raw. הנתונים הגולמיים תואמות רשימת אירועים הנובעים לשגר קרן חלקיקים אינטראקציה עם תאים אשר נרשמות יחד עם המיקום קרן כמו רצף כרונולוגי.
    1. להשתמש תוסף רשות השידור-J כדי למיין אירועים בהתאם לסוג שלהם: מועבר יון אנרגיה (סאונד), backscattered יון אנרגיה (RBS) או צילום רנטגן פוטון אנרגיה (פיקסלים). לאחר מכן, תהליך בנפרד כל סוג נתונים.
    2. לחשב סאונד באזור במפת צפיפות
    3. חישוב ממוצע ספקטרה האנרגיה של פוטון רנטגן ולהגדיר עבור כל רכיב כימי עניין חלון אנרגיה על מנת לאחזר את התפוצה המרחבית של רכיב.
    4. הגדרת אזורים מעניינים (ROI) (למשל תאים בודדים, מבנה צפוף, אגרגטים, וכו '.) ולחשב ספקטרום רנטגן המתאימים.
  2. נתח ספקטרום ה-RBS המתאים כדי לחשב את המספר הכולל של חלקיקים התקרית25.
  3. מתאים ספקטרה רנטגן באמצעות תוכנת Gupix26 כדי לקבוע ריכוז רכיב עבור כל רואי.
    הערה: מגבלת טיפוסי של זיהוי (לוד) עבור פעולת השירות היא ב- 1 עד 10 µg.g טווח-1 במסה יבש בהתאם הוא ה מספר האטומי של יסודות (לוד הולך ופוחת עם Z).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תרבית תאים והדימות זריחה של TiO שכותרתו fluorescently 2 NPs

תיכננו בעל מדגם מותאם תרבית תאים, תא טיפול, כמו גם ניתוח עם מודאלים מרובים. באופן ספציפי, היה חשוב כי בעל מותר מיקרוסקופ אופטי שגרתיות כמו טוב כמו גרעיני microprobe אנליזה והדמיה. בעל מדגם זה מבוסס על תשובה מכשילה פוליקרבונט בעובי 2-מיקרומטר שהופקדו על מסגרת הצצה. התאים גדל ישירות על פוליקרבונט, בתנאים סטריליים תרבות במשך מספר ימים, לאחר מכן להשתמש עבור הגדרות ניסיוני שונות, כגון חשיפה NPs.

השינוי פני שטח הכימית עם fluorophores (TRITC) מותר הגילוי של NPs2 את טיו, כמו גם לוקליזציה שלהם בחיי עיר ו במבחנה חי או בכל paraformaldehyde קבוע תאים באמצעות מיקרוסקופ זריחה. גרעין התא, המיטוכונדריה היו מוכתם באמצעות את צבע חיוני Hoechst33342 (כחול עבור הגרעין) transfected המטריקס-roGFP (ירוק עבור המיטוכונדריה), בהתאמה. זה מכתים מרובים מותר לוקליזציה תאיים של NPs2 TRITC-טיו (על-ידי שלה אדום פולטת קרינה פלואורסצנטית) 20 h לאחר חשיפה. NPs נמצאו רק בציטופלסמה של תאים חשוף עם אין זיהוי בגרעין. NPs לשפות אחרות באופן אקראי באזור perinuclear של הציטופלסמה, נכללו לגמרי המיטוכונדריה (אין חפיפה בין TRITC ל- GFP אותות).

למרות פלורסצנטיות מיקרוסקופ הוא מאוד שימושי להתאים לשפה NPs בתוך תאים החשופים, הוא לא מסוגל להעריך את המספר המדויק של NPs בכל תא. הקושי המרכזי של מיקרוסקופיית פלורסצנטיות בנוגע כימות של NPs מקושר לאי-הודאות על (i) מספר fluorophores מצורף של NP נתון ויציבות הלבנת fluorophore שבחרת במהלך הצפייה ו (ii) מצב צבירה NPs בתוך התא.

Figure 1
איור 1 : במבחנה, סיטו קרינה פלואורסצנטית הדמיה של תאים הטרנסגניים U20S לבטא מטריקס-RoGFP, נחשפים TRITC-טיו 2 NPs. תאים U2OS (למעלה) המסומנים Hoechst33342 (כחול), מטריקס-roGFP (ירוק) נחשפים חלקיקים-2 TiO התווית על-ידי TRITC2 µg.cm 4 (אדום) עבור ה 20 תצפיות מצביעות על זה TiO2 NPs צבירה בתאים אזור perinuclear. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כדי להתגבר על חסרונות אלה, גרעיני microprobe ניתוח techniquesprovide בגישה המשלימה מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי בשל את רגישותם NPs אשר מונע את השימוש של כל אות ביניים כמו זריחה של המושתל צבע. יתרה מזאת, הם גם לגמרי כמותיים, מתן נתונים אודות (i) את התוכן הביוכימי תת סלולרית אחרת אינו ידוע, (ii) הכמות תאיים של NPs ברמת תא בודד.

Cryofixation של תאים לאחר דימות בשידור חי.

האילוץ הגבוהה ביותר בביצוע ניתוח microprobe גרעינית היא לעבוד בתנאים ואקום. פיתחנו פרוטוקול קיבוע תא המאפשר שימור ultrastructure ביולוגית והיושרה הביוכימי של הדגימה ביולוגי. קיבוע כימי ידוע כדי לשנות את ההרכב יסוד קורט של תאים כי זה דורש ההחלפה של בינוני הסלולר שלהם על ידי פולימר המשמש כדי לשמר את ultrastructure הסלולר. יתר על כן, סילוק מים גם משחרר יונים חופשיים, מינים אחרים, אשר משנה הכולל לטעום קומפוזיציה. לפיכך, הוא הופך להיות חובה לתת עדיפות שיטת קיבוע הפיזי, ובייחוד קריוגני שיטות. הליכים אלה קריוגני לגרום הפסקתה מהירה של הפעילות התאית וזה, על ציר הזמן של אלפיות השנייה.

Microprobe גרעיני אנליזה מיקרוסקופית, כימות של NPs את המשקל הסלולר.

שידור סריקה יון מיקרוסקופ (ממוצע-סאונד) וניתוח פליטה (ממוצע-פיקסלים) חלקיק-induced רנטגן בוצעו על דגימות לאחר cryofixation והתייבשות כדי לקבל נתונים כמותיים מדויקים על ההרכב הכימי הבסיסי שלהם.

ממוצע-סאונד תמונות חשף הבדלי צפיפות המקומית ומאפשרת זיהוי מבנה התא כגון גרעין, הציטופלסמה. למרות הרזולוציה לרוחב הקורה מאפשר התבוננות צפופים מבנים כמו צרה כמו 300 ננומטר רחב, כמו דק אגרגטים גלוי כאן בציטופלסמה, השיטות סאונד לא יכול להפלות בין NP אגרגטים ומבנים אחרים התאית צפופה. הסיבה לכך היא, כמו במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM), תהליך פיזי שמוביל את הוריאציה האנרגיה המשודרת היא האינטראקציה של יונים נכנסות עם ענן אלקטרונים אטומי. בניגוד TEM ניתוח עם זאת, כי נפח התאים כל ניתוח מקומי עובי ווריאציות למנוע אפליה בין מבנים גבוהים-Z עלייה מקומית של צפיפות הסלולר.

Figure 2
איור 2 : תמונות של צפיפות, התפלגות היסודות מתקבל על ידי ממוצע-סאונד, ממוצע-פיקסלים על הקפאה-קבוע תאים U2OS. U2OS תאים שליטה (למעלה) בהשוואה חשוף הקפאה-קבוע תאים U2OS (נחשפים 4 µg.cm-2 TiO2 NPs, למטה), נצפתה באמצעות ניתוח microprobe גרעיני/מיקרוסקופ. מיקרוסקופ סאונד (משמאל, מפות בגווני אפור) נחשפו צפופה cellular "אינטרה" או תוספת מבנים (גרעין, אגרגטים מלח, חלקיקים). הרזולוציה המרחבית (300 ננומטר) להשוות פלורסצנטיות מיקרוסקופ ומראה מבנים כגון NP אגרגטים באזור perinuclear. זיהוי של מבנים המבוססת רק על דחיסות שלהן עשויות להיות רב-משמעי. ממוצע-פיקסלים המפות היסודות של K, P ו- Ti (סולם צבעים תרמי) הם משלימים למפות ממוצע-סאונד. הם יכולים לשמש כדי להבטיח הנוכחות של NPs בתאים. כל תא ניתן לנתח בנפרד מבחינת ריכוז יסוד (ראו איור 3). גודל ברים: סרגלי 10 מיקרומטר. צבעים בטווח שבין מינימום (כחול) העוצמה המקסימלית (אפור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כמופיע באיור2, עיבוד ממוצע-סאונד מאפשר ההכרה של תאים בודדים בתוך אוכלוסייה והן גם תאים תת תאיים כגון גרעינון, גרעין. למרבה הצער, כפי שהוזכר קודם לכן, NPs יכול לא תמיד יזוהו באמצעות שחזור ממוצע-סאונד.

חלקיק-induced רנטגן פליטה (ממוצע-פיקסלים) ניתוח מספק לא רק את ההרכב הכימי של המדגם, אלא גם מיפוי היסודות שלהם (איור 2). במהלך האינטראקציה עם קרן מרגש, יסודות כימיים עוברים תהליכי עירור-דה-עירור אטומי בסופו של דבר להוביל פליטת פוטון שמתועדות האנרגיה האופיינית של המספר האטומי של היסוד נרגש. קשת פיק אופייני בנוי מהסכום של כל האירועים הפוטונים הנפלטים ונחשב חתימה כימית של המדגם.

כיוונוני ניסיוני סטנדרטי וגלאים בשימוש לניסויים ממוצע-פיקסלים מאפשרים כימות בו זמנית של כל האלמנטים כבד יותר נה עם הגבלת זיהוי המוני יבש− 1 µg.g 1 עד 10. הדיוק במדידת ריכוזי היסודות מוגבלת בדרך כלל בסביבות 20% יעילות איסוף של גלאי תשלום.

במחקר זה, חלוקת אלמנטים כמו אשלגן וזרחן, לכמת את כמות TiO2 NPs עם טיטניום מיפוי תאיים נצפית על ידי ניתוח microprobe גרעיני יסוד כימי מפות מחושבים לאחר והפוטונים ממוינות בהתאם למיקום קרן על התזמון של הקלטה של הבחירה של חלון אנרגיה סביב רכיב ספציפי. מפות הן נציג של מספר אירועים שזוהו במיקום קרן והן כמותית. רעש וגם רקע מספרית מדומה, מסונן. יתר על כן, ניתן להשתמש במיפוי כימי כדי לחלץ את הספקטרום פיקסלים המקומי נדרש על כימות.

כמופיע באיור2, זרחן למשל מופץ בתא עם, כצפוי, ריכוז גבוה יותר באזור גרעיני. אשלגן מופץ homogeneously נפח התאים. טיטניום ממוקם באזור cytoplasmic perinuclear בצורה של אגרגטים, כפי שצוין בעבר נצפו באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 1). NPs מוצגים באותו perinuclear לוקליזציה שיהיה מצב השטח שלהם: functionalized (איור 1) או מקורי (איור 2). בינתיים, אין זכר טיטניום זוהה תאים שליטה המאשר כי ההתפלגות טיטניום שנצפה על ידי ממוצע-פיקסלים עליך ניתן לייחס את טיו2 NPs, מסכים עם ניתוחים קודמים שלנו על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.

בנוסף, כפי שמוצג באיור2, אפשרי לחלץ את ההפצה תאיים של NPs וריכוזי NPs כמותיים מאזורים ספציפיים של עניין. בהתבסס על המפות סאונד, מתאם עם ההפצות זרחן/אשלגן, תא בודד ניתוח אפשרי.

Figure 3
איור 3 : ניתוח כמותי תא בודד באמצעות ממוצע-פיקסלים- ספקטרה רנטגן בודדים מחושב עבור תאים באיור 2 יכול להיות מותאם כדי לקבוע ריכוז רכיב ברמה התאית. תכונה זו היא מעניינת במיוחד עבור NP ניתוח שבו ריכוז הסלולר מראים בדרך כלל וריאציות חזק בתוך מאותה אוכלוסייה. לדוגמה, עבור אותו מתכוונת חשיפה, בטווח ריכוזים Ti 0.2 עד 1.8 µg.cm-2. פקדים יתאימו לאוכלוסיות תא ללא טיפול. מינון החשיפה: 4 µg.cm-2. Boxplots מייצגים את ההתפלגות של ריכוזים הסלולר בודדים עם הערך החציוני (קו אופקי) ומדד ברים המתפרש הגבוהים והנמוכים ערכים. לשלוט תאים: N = 14; נחשפו תאים: N = 16.

בהתאם, אנו יש לכמת את התוכן הממוצע של טיטניום באוכלוסיה תא אלא גם שמוצג ההתפלגות טיטניום בכל תא באוכלוסיה אחת במצב ניסיוני ספציפיים. התוכן החציוני של טיטניום נמדד כאן הוא די נמוך (500 ng.cm-2) לעומת המינון חשיפה-2 4 µg.cm של האוכלוסייה תא (איור 3) והוא וריאציה בין תאים גדולים (Ti ריכוזים נע בין 0.2 עד 1.8 µg.cm -2 לפי התאים שנותחה). . הבחנו גם עלייה של יונים תאיים כגון אשלגן וסידן בדגימות חשוף רומז הומאוסטזיס שינוי הסלולר המושרה על ידי הנוכחות של TiO2 NPs, כפי שתואר על ידי מספר סופרים. 21 , 27

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנו מתארים שיטה המספקת מידע שימושי מעבר מה אפשרי עם טכניקות הדמיה אחרות, במיוחד ברמה subcellular. בנוסף יכולת הדמיה, ניתוח microprobe גרעיני מציע גם אפשרויות של כימות של יסודות כימיים הזנת בהרכב של דגימה ביולוגית. בשנת העבודה הנוכחית, אנו למד אוכלוסיות תאים אנושיים, ממוקד עד הניתוח של אזור שבחרת עניין בהתבסס על תא בודד נחשף TiO2 NPs. השילוב שלו עם טכניקות אחרות מספק הדמיה הסלולר מורפולוגי והן נתונים כמותיים מדויקים על ההרכב הכימי היסודות.

להחלת בהצלחה ניתוח microprobe גרעינית, זה חובה לכבד את הנקודות הבאות כדי להימנע ממלכודות הפוטנציאל. קודם כל, זה הכרחי להשתמש עבור הקיבעון תא ההקפאה פרוטוקול כדי לשמר את ultrastructure שלה ואת שלמותו הביוכימי. שנית, הוא גם חובה לבצע ניתוח של דגימות דק בעובי מתחת 20 מיקרומטר. אם יש צורך, חלוקתה של דגימות cryofixed יכול להתבצע. דוגמאות יש בהחלט לשמור קפוא. שלישית, חשוב גם לזכור כי ניתוח microprobe הגרעיני חושף ייצוג דו מימדי של דגימות ביולוגיות. לכן, התפלגות יסוד כימי שהושג הוא הקרנה מימדי ואולי יכול להציג את misinterpretations. מגבלה זו לעקוף בעתיד השימוש של רכישת טומוגרפי.

ניתוח microprobe גרעינית יש גם מגבלות. יש להדגיש כי את האילוץ העיקרי שלה הוא הצורך לבצע ניתוח תחת ואקום. לכן, זה הכרחי כדי להשתמש בפרוטוקולים קיבוע תא ששומרת תאים ultrastructure ויושר הביוכימי. לכן, יש לבחון את ההתנגדות של דגימות ביולוגיות להליך קריאוגניקה (ללא התוספת של שרף כימי). זה יכול להגביל את השימוש microprobe גרעיני ניתוח.

מגבלה נוספת היא הנגישות למתקני לביצוע ניתוח microprobe גרעינית. השעות המוקצות קרן מוגבלים ולכן לפעמים, וזה אילוץ נוסף עבור סוג זה של הניסוי גוזלת זמן. כמה שעות יש לעיתים קרובות צורך רכישה אחת.

טכניקה זו היא שונה בשיטות אנליטיות אחרות, כולל מיקרוסקופ, ספקטרומטר מסה (MS), מצמידים inductively פלזמה MS (ICP-MS), כרומטוגרפיה נוזלית MS (LC - MS), ואיזוטופ רדיואקטיבי. האחרון משמשים אכן כדי להעריך את המינון הסלולר של יסודות כימיים אך הם רק לספק מידע מאקרוסקופית קנה מידה דהיינו על כמות מאקרוסקופית של מדגם. אף אחד מהם לא ניתן להעניק גישה, כמו גם ניתוח microprobe גרעינית, זיהוי מדויק, מיפוי של מנה subcellular של יסודות כימיים ספציפיים (יונים, מתכת או מתכת תחמוצות NPs). נתונים אלו מסייעים גישה כדי מחקר שיטתי נוסף של ההערכה מנה-תגובה.

הערכה מדויקת של המינון כשלמדתי ההפנמה של NPs בתאים חיוני הן כמותית NP הרעלים ו פרמקולוגיה נקודות מבט. כפי שהוצע על ידי הפער גדול בתוכן NP שנצפו, אשר מראה הבדל 10-fold בין מינימום ומקסימום נצפתה ריכוזי (איור 3), לא יהיה ריכוז הסלולר רשע פרמטר רלוונטי כדי לתאר תופעת החשיפה של חלקיקים. דבר זה נכון במיוחד כאשר תופעת הסף אמור להתקיים כי מינון inhomogeneous חשיפה יכולה להוביל תצפיות סותרות. מאז הטבע fractionated של חלקיקים מופיע בבירור ברמה התאית, מחקר זה ולכן מהווה שוב שאלת הרלוונטיות של שיטות בהתבסס על ניתוח משתנים גלובליים בשאלות המיעון סביב ההתנהגות של תאים נחשפים מינונים inhomogeneous של מזהמים.

כמופיע במקרה למד פה, התבוננות, כימות של NPs בתוך תאים נפרדים מאפשרים לנו להבין טוב יותר את bioaccumulation של רכיבים אנדוגני אקסוגני כגון תחמוצת מתכת NPs. זוהי פעילות קריטית עבור יישומים נוספים של NPs וההתערבות, שם הבנה המסכן של הבסיסית NP הפצה בתאים יכול להוביל לתוצאות שלא כהלכה.

פרוטוקול זה מדגיש את התאמת באמצעות ניתוח microprobe גרעיני עם טכניקות טיפול נוספות על הערכות עתידיות של NP אינטראקציות עם דגימות ביולוגיות. הגישה הכמותית מספקת מידע לגבי ההשפעה של NPs כזה מבחינת איתור, זיהוי, לוקליזציה, כימות ברמה של תא בודד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים Borderes סרג בימוי ועריכה של הוידאו. הסוכנות למחקר לאומי צרפתי תומך בתוכנית מחקר TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). ה-CNRS הקהילה האירופית כפעילות בשילוב מסופקים "תמיכה של הציבור, תעשייתי המחקר באמצעות יון קרן טכנולוגיה (הרוח) תחת EC החוזה n ° 227012. עבודה זו היא נתמכה על ידי מארי קירי פעולות - רשתות ההכשרה הראשונית (ITN) כמו שילוב פעילות תמיכה לתארים מתקדמים מחקר עם התמחות בתעשייה, הדרכה מצויינות"(ספרייט, D1.3) תחת חוזה EC מס 317169. Sud Ouest גרנד את C'NANO של אקיטן אזור תמיכה את תוכנית המחקר רעלים-ננו (n ° 20111201003), את תוכנית המחקר POPRA (n ° 14006636-034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
U2OS ATCC, LGC STANDARDS ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine Dominique DUTSCHER L0211-500
FBS 500 mL Dominique DUTSCHER 500105U
Penicillin/Streptomycin  ThermoFisher Scientific 11548876
 L-Glutamine 200 mM, 100 mL  Invitrogen 25030024
Geneticin,  20 mL ThermoFisher Scientific 10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL ThermoFisher Scientific 11570626
Viromer Red Lipocalyx VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid AddGene #49437
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H3570 Handle with care
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) SIGMA-ALDRICH T3163 Surface modification of NPs
Sample preparation
Polycarbonate foil Goodfellow CT301020
Polyether Ether Ketone support (PEEK) Matechplast A-239-4047
Ethanol, ACS absolute SIGMA-ALDRICH 02860-6x1L
Chlorform, Anhydrous, 99% SIGMA-ALDRICH 372978-1L  Caution toxic
Formvar 100 g Agar Scientific AGR1201 Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform
NaOH SIGMA-ALDRICH S5881-500G
Sample fixation
Powder, 95% Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500G Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS
PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) ThermoFisher Scientific 11503387
Prolong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific P36934
Triton X-100 SIGMA-ALDRICH 93443 Harmful
Sample cryofixation
Liquid nitrogen air liquids sante Harmful
Methylbutane >=99% SIGMA-ALDRICH  M32631-1L Caution toxic
Aluminium transfer plate Home-made
Distilled and deionized water Home-made Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system
Parafilm VWR 52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure ThermoFisher Scientific 50129870
Biosafety bench, class II ThermoFisher Scientific MSC-Advantage
TC20 automated cell counter Biorad 145-0102SP
Counting slides 2 wells Biorad 1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV Canberra  PD25-12-100AM
High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED)  Orsay Physics 1-SED
XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl Micromatter 34381
XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 Micromatter 34382
XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal Micromatter 34383
XRF Calibration Standard Silicon as SiO Micromatter 34384
XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx Micromatter 34385
XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 Micromatter 34387
XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal Micromatter 34388
XRF Calibration Standard Iron as Fe metal Micromatter 34389
Sonicator 750W Sonics Materials 11743619
3MM microprobe Bioblock scientific 220-05
Lyophilizer in vacuum Elexience EK3147
Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 431006-9901
Motorized stage xy Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420781-9910
Zeiss filterset 02 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 488002-9901
Zeiss filterset 38HE Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 489038-9901
Zeiss filterset 31 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 000000-1031-350
Chemical fume hood Erlab Captair SD321
Particle accelerator HVEE singletron
Software
ImageJ software National Institutes of health, USA ImageJ 1.51
SimNRA software Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany SIMNRA 6.06
Gupix software Guelph university, Canada GUPIXWIN 2.2.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50, (6), 1260-1278 (2011).
  2. Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113, (3-4), 133-140 (2006).
  3. Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2, (2), 125-169 (2013).
  4. Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. 89-105 (2009).
  5. Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review. Saf. Sci. 48, (8), 957-963 (2010).
  6. Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review. Toxicol. 269, (2-3), 92-104 (2010).
  7. Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258, (2), 151-165 (2012).
  8. Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1, (2), 229-234 (2006).
  9. Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
  10. Olesik, J. W. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. Elsevier Ltd. (2014).
  11. Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105, (November 2011), 39-43 (2012).
  12. Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8, (4), 159-167 (2015).
  13. Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86, (15), 7311-7319 (2014).
  14. Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89, (1), 22-41 (2017).
  15. Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
  16. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75, (16), 5036-5051 (2012).
  17. Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, (3), 526-535 (2010).
  18. Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279, (21), 22284-22293 (2004).
  19. Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279, (13), 13044-13053 (2004).
  20. Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107, (7), 2891-2959 (2007).
  21. Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5, (June), 125-139 (2011).
  22. Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
  23. Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269, (20), 2163-2167 (2011).
  24. Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
  25. Mayer, M. SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113. Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).
  26. Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268, (20), 3356-3363 (2010).
  27. Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. 1-17 (2015).
<em>בחיי עיר</em> זיהוי, כימות תא בודד של תחמוצת מתכת חלקיקים באמצעות ניתוח Microprobe גרעיני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).More

Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter