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Chemistry

In Situ Deteção e única célula quantificação de nanopartículas de óxido de Metal usando análise de microsonda Nuclear

doi: 10.3791/55041 Published: February 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Descrevemos um procedimento para a detecção de elementos químicos presentes em situ em células humanas, bem como a sua quantificação em vitro . O método é adequado para qualquer tipo de célula e é particularmente útil para análises químicas quantitativas em células únicas em vitro exposição a nanopartículas de óxido metálico.

Abstract

Técnicas de microanálise com base nas imagens do elemento químico permitem a localização e quantificação de composição química a nível celular. Eles oferecem novas possibilidades para a caracterização dos sistemas vivos e são particularmente adequados para detectar, localizar e quantificar a presença de nanopartículas de óxido de metal, tanto em amostras biológicas e do ambiente. Na verdade, todas essas técnicas requisitos relevantes em termos de sensibilidade (i) (de 1 até 10-µg.g-1 de massa seca), micrômetro (ii) escala de resolução espacial e a detecção de vários elemento de (iii). Tendo em conta estas características, imagens de elemento químico microbeam podem poderosamente complementar técnicas de imagem de rotina tais como óptica e microscopia de fluorescência. Este protocolo descreve como realizar uma análise microsonda nuclear em células cultivadas (U2OS) expostas a nanopartículas de dióxido de titânio. As células devem crescer e ser expostas diretamente em um suporte de amostra especialmente projetado usado no microscópio óptico e na fase de análise microsonda nuclear. Mergulho-congelamento criogênica fixação das amostras preserva a organização celular e a distribuição do elemento químico. Análise de simultânea microsonda nuclear (microscopia de transmissão íon, espectrometria de Retrodispersão de Rutherford e partícula induzida por emissão de raios x) realizada na amostra fornece informações sobre a densidade celular, a distribuição local de os elementos químicos, bem como o conteúdo celular de nanopartículas. Há uma necessidade crescente de tais ferramentas analíticas dentro biologia, especialmente no contexto emergente de Nanotoxicology e nanomedicina para o qual deve ser aprofundado nossa compreensão das interacções entre as nanopartículas e amostras biológicas. Em particular, como análise de microsonda nuclear não requer nanopartículas de ser rotulados, abundâncias de nanopartículas são quantificáveis para o nível de células individuais em uma população celular, independentemente do seu estado de superfície.

Introduction

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Homeostase celular é determinado pelo controle de absorção, assimilação e localização intracelular de diferentes elementos de traço (íons, metais, compostos inorgânicos exógenos). Estes componentes são frequentemente sob a forma de vestígios, mas, no entanto, podem ter um impacto considerável na fisiologia do sistema. Assim, o estudo da bioquímica celular em situações normais e patológicos/estressado é um passo-chave para uma compreensão geral dos mecanismos metabólicos celulares. Portanto, o desenvolvimento de técnicas analíticas e de imagem, permitindo a investigação de abundâncias químicas intracelulares, organização estrutural e suas funções metabólicas relacionadas torna-se necessário. Muito poucos métodos são capazes de fornecer uma em situ parte quantitativa de informações relativas à natureza química geral de uma determinada amostra. Além de métodos de análise de amostras a granel, em situ análises consideram amostras biológicas em sua integralidade, sem perda de informações em massa e estruturais, preservando seus constituintes químicos (oligo-elementos e íons) e proteínas. Além disso, como as nanociências continuam a desenvolver, imagem melhorada e métodos analíticos para monitoramento ambiental à escala celular será necessários observar e quantificar as interações e comportamentos de nano-objeto. 1

Nanopartículas (NPs) foram definidas como objetos exibindo ao menos uma dimensão facial na faixa 1 e 100 nm. 2 devido a suas propriedades físico-químicas particulares, NPs são amplamente utilizado na indústria. O NPs é empregado em aplicações de bio e em nanomedicina. 3 , 4 apesar de numerosas características físico-químicas do NPs, eles podem gerar alguns riscos de efeitos adversos na saúde humana e o ambiente. Estes riscos podem ser induzidos por exposição prolongada e repetitiva em vários níveis de concentração e isto ainda não foi claramente estabelecido. 5 , 6 , 7 , 8 em particular, o destino do NPs dentro de células e a resposta celular associada são, até à data, não totalmente descrito. Isto é em parte devido à escassez de métodos que permitir a detecção e quantificação de NPs interiorizado em uma única célula. 9

As ferramentas analíticas clássicas usadas para estimar a dose celular de nanopartículas são microscopies, espectrometria de massa (MS), acoplado indutivamente plasma MS (ICP-MS)10,11 e cromatografia líquida de que MS (LC-MS), mas eles só fornecem informações úteis à escala macroscópica. Nenhum deles pode fornecer uma avaliação exacta do NPs subcellular conteúdo nem a distribuição de NPs, sem o uso de métodos de fracionamento. Uma avaliação sistemática da dose-resposta, portanto, é impossível com esses métodos, ao contrário de métodos baseados em espectroscopia atômica como nuclear microsonda análise12,13, microscopia de fluorescência de raios-x de síncrotron14 e espectrometria de massa de iões secundários (SIMS). 15 , 16 estes métodos são particularmente interessantes como se complementam as observações feitas usando microscopia de fluorescência, especialmente quando o NPs não podem ser rotulado com moléculas fluorescentes e, portanto, é estudado em seu estado nativo. Em certa medida, mesmo quando NPs é enxertado com fluorophores, (i) a quantificação continua a ser difícil porque o nível de marcação por NP é desconhecido e (ii) a modificação química da superfície NP pode modificar sua distribuição celular.

Neste artigo, nós centrar-se em um método com base em uma combinação de técnicas nucleares microsonda visando a morfologia e a composição elementar da espécimes biológicos em maior, menor, de imagem e rastrear as concentrações.

Microsonda nuclear análise revela-se particularmente adequado para a medição de oligo-elementos químicos em tecidos biológicos. A resolução lateral de feixe (0,3 a 1 µm) e a sensibilidade na deteção de elemento químico (de 1 a 10 µg.g-1 massa seco) são adequados para estudos a nível celular. Microsonda nuclear técnicas baseiam-se na deteção de partículas (fótons, elétrons, íons) emitida depois que o feixe de iões (normalmente rodando a energias de MeV) interage com átomos presentes na amostra. Interações que ocorrem nas células são principalmente: 1) excitação/ionização de átomos, seguido de uma emissão de fótons depois de átomos retornam ao seu estado fundamental; e 2) difusão de partículas entradas levando a mudança em sua energia e direção. A medição de identificação de allowsthe de energia de partículas emitido dos átomos envolvidos na interação. Para executar o mapeamento de elementos, o íon microbeam é repetidamente verificada sobre a superfície da amostra, muitas vezes por uma área de cerca de 100 por 100 µm2 contendo várias células. São detectadas partículas emitidas e sua energia é registrada para cada posição do feixe. Classificação de partículas de acordo com a posição do feixe, assim, identificar a estrutura responsável pela emissão de partículas é o objetivo do tratamento de dados. Aqui, descrevemos precisamente uma abordagem baseada na análise de microsonda nuclear para detectar bem como quantificar exógeno NPs nos celulares e celulares sub escalas, a fim de investigar as consequências das interações NP com vivos e microscopia de fluorescência sistemas. Nós particularmente concentrará sobre as oportunidades oferecidas por esse método em termos de quantificação em situ de dióxido de titânio (TiO2 NPs) de nanopartículas agregados no nível subcellular.

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Protocol

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1. preparação do suporte de amostra

  1. Preparação e projeto de titular de amostra
    1. Fabricar um porta-amostras perfurando um quadrado de 5 x 5 mm em um quadro PEEK espesso de 1 mm.
    2. Limpe por lavagem com etanol 70% (v/v) e manter-se em placas estéreis até que esteja pronto para usar.
      Romance Um porta-amostras apropriado para cultura de células e manipulação de célula é necessário. Ele precisa ser projetado para cultivo, observações em vitro com microscopia óptica e análise microsonda nuclear e a imagem latente de célula. Este suporte é feito de um PEEK quadro13.
  2. Preparação da amostra titular
    1. Prepare a solução de Formvar dissolvendo-se 1 mg de pó de Formvar em 100 mL de clorofórmio.
    2. Estica a folha de policarbonato em uma armação metálica para que ele não apresenta nenhuma dobra.
    3. Use uma ponta estéril para espalhar a solução de Formvar em torno do furo do suporte de amostra.
    4. Baixe delicadamente o porta-amostras com cola sobre a folha de policarbonato esticada (um quadrado de 5 x 5 mm).
    5. Repita a sequência anterior para preparar um porta-amostras para cada replicar.
      Romance O filme de policarbonato (PC) é biocompatível, suficientemente espessa e resistente para os diferentes protocolos e restrições analíticas.
      Cuidado- clorofórmio é tóxico. Evitar a inalação, ingestão ou contato com a pele. Utilize sempre uma funcionamento químico exaustora e filtros adequados.
  3. Esterilização de titular de amostra
    1. Coloque o suporte de amostra montado em um balão de Erlenmeyer com 50 mL de etanol 70% (v/v), sob agitação a 180 rpm e + 37 ° C durante a noite, utilizando um agitador/incubadora.
    2. Enxágue o titular várias vezes em água destilada estéril.
    3. Ar secá-las em condições estéreis e expô-los à luz ultravioleta (Lâmpada germicida de biossegurança bancada, classe II) por 30 min de cada lado.
    4. Mantenha as amostras em placas estéreis de 12-poços (titular de uma amostra por alvéolo) até que esteja pronto para usar.
      Nota: Múltiplos suportes de amostra podem ser armazenados em temperatura ambiente estéril e secas chapas 12-bem selado com parafilme durante vários dias.

2. o crescimento das células no porta-amostras adequadas.

Atenção: Protocolo deve ser realizado em um banco do fluxo laminar de segurança biológica (classe II) para excluir os microrganismos contaminantes. Lidar com antibióticos (por exemplo, penicilina, estreptomicina) com luvas. Respeitar as práticas recomendadas ao manusear materiais biológicos (linhas celulares, geneticamente modificadas derivada de células humanas).

Crítica: linhas celulares utilizadas devem ser verificadas para garantir que eles não estão infectados com Mycoplasma.

  1. Transfect U2OS linha de celular com plasmídeo Matrix-roGFP 17,18,19 , usando um método de Transfeccao de acordo com o protocolo estabelecido pelo fabricante do rolamento.
  2. Para confirmar a transfeccao com o plasmídeo-carregando o biosensor e para evitar a perda do plasmídeo, selecionar e manter as células transfectadas em meio de cultura apropriado.
  3. Visualize células transfectadas por microscopia de fluorescência para garantir que a transfecção ocorreu e confirmar a expressão da fluorescência e a exibição de uma rede mitocondrial reticular e tubular19.
    Pausa ponto: As células podem ser congeladas em nitrogênio líquido durante vários anos.
  4. Use a população de células transfectadas por cultivo de células em um meio adequado para obter populações de células sub confluente. Desenvolvem-se células a 37 ° C, 5% (v/v) de CO2 em um ambiente saturado de água.
  5. Semente de células em uma concentração, tais como eles estão na confluência de 80% no dia da fixação. Normalmente, uma concentração de 500 células por µ l poderia ser usada. Colheita de células usando a 400 µ l de EDTA-tripsina 0,25% (v/v) e manter por 3 min a 37 ° C. Pare a ação da tripsina com 1 mL de meio de cultura. Pelotas as células por centrifugação por 5 min em 230 x g e + 4 ° C, em seguida remover o sobrenadante e adicionar o volume desejado de meio de cultura fresco.
    Nota. O protocolo é aplicável para todos os tipos de celulares e o número de células semeado é dependente do tamanho da célula e na célula, tempo de duplicação.
    Atenção: Evite submeter a tripsina, antibióticos e soro a ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. Mantê-las estéreis. Dividir a solução em alíquotas e congelá-los a −20 ° C. Armazene as alíquotas até a data de validade. Lave cuidadosamente o centrifugado a fim de remover completamente a tripsina. Vestígios de tripsina residual irão retardar e diminuir a eficiência do chapeamento.
  6. Contar as células e realizar uma diluição com meio de cultura completo fresco mantido a 37 ° C, a fim de obter uma suspensão de células com 500 células por µ l.
    Nota: A concentração da suspensão celular deve ser adaptada em função do tipo de célula, a fim de uma gota de 40 µ l da placa.
  7. Uma gota de 40 µ l no centro da folha do policarbonato da placa. Coloque cuidadosamente a amostra para 2 h a 37 ° C, 5% (v/v) de CO2 em um ambiente saturado de água.
    Crítica: Uma vez que a amostra é colocada na incubadora, limite, tanto quanto possível qualquer movimento mecânico para favorecer a fixação rápida da célula. De acordo com o tipo de célula, pode ser necessário incubar mais de 2h para tecendo uma eficiência otimizada de células. Verifique que a atmosfera da incubadora está bem saturado para impedir a evaporação de gotas.
  8. Verifique se as células estão bem ligadas na película de policarbonato, usando um microscópio óptico. Delicadamente, adicione 2 mL de meio fresco completo e manter por 24h.

3. nanopartículas preparação e exposição

Nota: Fluorescente tintura-modificado TiO2 NPs foram projetados, sintetizado e quimicamente modificado com isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC). 20 , 21 esta modificação da superfície permite a deteção de nanopartículas, rastreamento e localização in situ e em cellulo nas células vivas e fixas ou em organismos multicelulares. 12 , 13 , 18

Atenção: Nanomateriais e nanopartículas devem ser manipuladas com cuidado. Evitar a inalação, ingestão ou contato com a pele. Para evitar a disseminação no ar, as nanopartículas são mantidas em solução (água ultrapura).

  1. Prepare uma suspensão de 1 mg.mL− 1 deTiO2 NPs em água ultrapura. Dispersar o TiO2 NPs usando pulsos intensos sonication 1-min em RT (750 W, 20 kHz, amplitude: 30%) usando um gerador de ultra-som e uma dedicado microsonda cónica.
  2. Dilua o TiO2 NPs na concentração desejada em meio de cultura a fim de obter uma suspensão de exposição de 4 µg.cm− 2 (concentração final). Substitua o volume apropriado de médio contendo NPs em células médio e misture delicadamente para distribuição homogênea do TiO2 NPs. Prepare controle células da mesma forma, sem a adição de TiO2 NPs.
  3. Incube as populações de células por 24 h a 37 ° C, 5% (v/v) de CO2 e uma atmosfera saturada de água.

4. microscopia de fixação e fluorescência paraformaldehyde.

  1. Prepare uma solução fresca de solução de paraformaldeído (PFA, 4% w/v) armazenados em buffer na salina de tampão fosfato (PBS, pH 7,4).
    1. Dissolva 4 g de pó PFA em 100 mL de PBS. Aquece a solução a 65 ° C, agitando usando um ímã e um agitador magnético em uma coifa. Aumente o pH, adicionando 1 gota de NaOH M um de cada vez até que a solução limpa. Esfriar a solução à temperatura ambiente e ajustar o pH para 7,4. Use a solução recentemente preparada imediatamente ou manter a + 4 ° C e proteger da luz.
      Nota: Soluções PFA pré-fabricados poderiam ser usadas no entanto uma preparação extemporânea do PFA garante melhor qualidade de fixação e conservação a longo prazo das amostras fixas.
      Atenção: PFA é tóxico; evitar a inalação, ingestão ou contato com a pele. Utilize sempre uma funcionamento químico exaustora e filtros adequados.
  2. Uma vez decorrido o tempo de incubação, remover o meio de cultura celular contendo o TiO2 NPs. lavar as populações de células, uma vez com meio de cultura fresco e uma vez com PBS (2 mL). Remover a PBS, enxágue rapidamente com uma alíquota de PFA fresco e frio (4% w/v, + 4 ° C).
    1. Adicione PFA (mL 2, 4% w/v, + 4 ° C). Incube 15 minutos à temperatura ambiente.
    2. Remover o PFA, enxágue as células com PBS (2 mL, 3 vezes, 5 min) sob agitação.
      Pausa ponto: Estes quimicamente fixa as amostras podem ser usados para o procedimento de "mergulho-congelamento" depois da fluorescência de imagem (vá para o passo 5) ou usado somente para fluorescência de imagem (vá para o passo 4.3).
  3. Mancha do núcleo com Hoechst33342 incubar as células por 10 min em PBS. Hoescht33342 é usado em uma concentração final de 500 nM. Após a incubação, remover a solução e enxágue com PBS.
    Atenção: Hoechst33342 é célula permeant e podem ser tóxicos. Evite o contato direto e usar luvas enquanto se preparando e usando Hoechst33342.
    Crítica: garantir a Hoechst33342 coloração solução recentemente preparada e mantida em condições estéreis.
  4. Processo fixo amostras para in situ e de imagem única célula usando microscopia de fluorescência (Figura 1).

5. "desidratação e fixação de mergulho congelamento"

  1. Prepare um prato de transferência de alumínio-refrigeração em nitrogênio líquido. Loja a placa em uma caixa cheia de nitrogênio líquido e manter a superfície da placa acima do líquido em vapor a frio de nitrogênio.
    Nota: A placa de transferência pode ser feita de qualquer chapa metálica (aqui, nós usamos o alumínio) que poderia ser arrefecido à temperatura do nitrogênio líquido, e que pode entrar na câmara de amostra liofilizador.
    Crítica: A caixa deve ser mantida fechada, tanto quanto possível para evitar a deposição de vapor de água sobre a superfície do prato frio. A amostra armazenada na placa durante a preparação não deve ser coberta por nitrogênio líquido.
  2. Enxagúe as células uma vez no meio de cultura e depois duas vezes mais, brevemente, em água estéril e ultrapura para obter livrar de qualquer vestígio de sais extracelulares restantes.
    Crítica: Certifique-se que os meios de comunicação são recém preparados e mantidos em condições estéreis. Aqueça todos os meios a 37 ° C antes de serem utilizados. O enxágue deve ser muito breve (alguns segundos) e o excesso de líquido em amostras removido o mais rápido possível.
  3. Mergulho-congelar as células a-150 ° C no líquido refrigerado por nitrogênio 2-methylbutane durante 30 s e lugá-los para o alumínio transferir a placa. Armazenar as amostras aqui durante a preparação de todas as outras amostras. Quando as amostras são todos cryofixed, transferi todo-de uma vez, colocando a placa de transferência em um liofilizador.
    Crítica: O processo de cryofixation global não deve durar mais de 20 min para evitar modificações estruturais para aparecer nas amostras temporariamente armazenadas na caixa de transferência.
  4. Congelar as amostras usando as seguintes sequências: 1) realizar uma primária dessecação por 12 a 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) a baixa pressão e baixa temperatura e, em seguida, 2) realizar uma fase secundária dessecação pelo menos 24 h, aumentando a temperatura da placa de + 40 ° C, mantendo a pressão baixa (+ 40 ° C, 10-3 mbar).
    Atenção: Nitrogênio líquido é extremamente frio e pode causar danos graves queimaduras ou olho em cima do contato. Use recipientes superior banco adaptado para transporte e use equipamento de segurança (luvas criogênicas, proteção de olhos e da face).
    Atenção: 2-Methylbutane é extremamente inflamável. Uma contaminação prejudicial do ar pode ser alcançada rapidamente a evaporação desta substância a + 20 ° C. Evitar a inalação, ingestão ou contato com a pele. Use a respiração e óculos de proteção, luvas de protecção. Sempre use uma coifa química funcione correctamente. Pode ser armazenado em + 4 ° C.
    Crítica: Use um termômetro apropriado (-150 º C) para monitorar as temperaturas de 2-Methylbutane durante a sessão de "Mergulho-congelamento". O 2-methylbutane deve ser mantido fresco em uma fase líquida. Transferência cryofixed amostras à atmosfera ambiente pode causar danos celulares, devido ao aumento de temperatura ou o vapor de água de condensação na superfície da amostra. Por conseguinte, a transferência deve ser feita tão rapidamente quanto razoavelmente possível (30 s)
    Pausa ponto: Após cryofixation, as amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante vários dias em condições estéreis e secas (protegidos da poeira e da umidade). Segure as amostras com pinça fina com cuidado e colocá-los em uma placa estéril de 12 selada com parafilme. Dessecante pode ser usado para secar a atmosfera.

6. nuclear microsonda análise

Nota: Nuclear microsonda análise foi realizada na linha de micro-raio de AIFIRA (aplicações Interdisciplinaires des Faisceaux ions en Région Aquitaine) usando as técnicas analíticas de feixe de íon complementares partícula induzida por emissão de raios x (µ- PIXE) e microscopia de íon da transmissão (µ-STIM). A instalação é baseada em um acelerador de partículas do MV 3.5 entrega de feixes de iões luz na faixa de energia MeV. 22 , 23

Pausa ponto: AIFIRA é uma instalação de feixe de iões hospedada pela Universidade de Bordeaux que oferece um acesso a equipas nacionais e internacionais após a avaliação científica do experimento proposto.

  1. Monte os suportes de amostra PEEK em um prato mucous usando fita dupla-face.
  2. Coloque a placa de suporte de amostra em um plano vertical perpendicular à direção do feixe.
  3. Fechar a câmara de análise e de vácuo da câmara de análise.
  4. Microscopia de íon transmissão (µ-STIM)
    Nota: STIM é usado para gravar os mapas de densidade das células após a conversão de perda de energia em massa celular, aproveitando o fato de que a perda de energia é proporcional à densidade da amostra (expressada em µg.cm-2).
    1. Usar um microbeam de hélio (ele é+) 2 MeV como uma sonda com um tamanho no plano focal de cerca de 300 nm de diâmetro e na fluência baixa (2000 ions.s-1). Medida da energia dos íons transmitidos com um detector de silício planar (detector de PIPS, 25 mm2, resolução de energia keV 11 @ 5,4 MeV), colocado atrás da amostra no eixo do feixe.
  5. Partícula induzida por emissão de raios-x (µ-PIXE) e espectrometria de dispersão de Rutherford (µ-RBS).
    Nota: µ-Pixe e µ-RBS análises fornecem a distribuição espacial e quantificação de elementos químicos com uma resolução de sub-micrônicas.
    1. Use um microbeam de próton (H+) 1,5 MeV (pA 50-150), voltada para baixo para um diâmetro de 1 µm e varredura sobre as mesmas células de interesse manchado por STIM de 4 a 8 horas e cerca de 100 x 100 µm2.
    2. Colete induzidos fótons de raio-x, emitidos a partir de átomos presentes na amostra (mais pesada que o at) por um de alta resolução Si(Li) detector Solid-State (resolução de energia 145 eV, @Mn-Kα) posicionados a 45 ° do eixo entrada do feixe. Use a energia do fóton detectado para identificar a natureza dos emissores (por exemplo, Z do elemento) e intensidade de raios-x para determinar a concentração do elemento.
    3. Simultaneamente, coletar prótons espalhados por trás-135 ° com um detector de silício (detector parcialmente empobrecido, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5,4 MeV) para medir o número total de partículas recebidas e para normalizar as intensidades de raios-x.
      Crítica: Uma coleção de padrões de calibração certificadas para quantificação de concentração atômica é usada para calibrar a resposta do detector de raio-x. Materiais de referência são uma coleção de filmes finos de atômicas depositados na 6,3 µm espessura foils de Mylar. Emitidos raios x energias variam de 0.6 (Li, linha K) até 20,2 keV (Rh, linha K).

7. análise de dados

  1. Reconstrua a químicos elementares mapas usando o plugin do IBA-J para ImageJ. 24
    Nota: Software dedicado, sob a forma de um plugin para o ImageJ foi desenvolvido para processar dados de análise crua microsonda nuclear. Dados brutos correspondem a uma lista de eventos resultantes da interação do feixe de partículas com células que são registrados juntamente com a posição do feixe como uma sequência cronológica.
    1. Usar o plugin de IBA-J para classificar eventos de acordo com seu tipo: transmissão de energia do íon (STIM), retroespalhados energia do íon (RBS) ou energia de fóton de raio-x (PIXE). Em seguida, processe separadamente cada tipo de dados.
    2. Calcular o mapa de densidade de área STIM
    3. Calcular a médios espectros de energia de fóton de raio-x e definir para cada elemento químico, de interesse de uma janela de energia, a fim de recuperar a distribuição espacial do elemento.
    4. Definir as regiões de interesse (ROI) (por exemplo, células individuais, estrutura densa, agregados, etc.) e calcular os espectros de raios x correspondente.
  2. Analise os espectros RBS correspondentes a fim de calcular o número total de partículas incidentes25.
  3. Espectros de raios-x usando o software de Gupix26 a fim de determinar a concentração do elemento para cada ROI de caber.
    Nota: Típico limite de detecção (LOD) para o método é o intervalo de µg.g de 1 a 10-1 de massa seca, dependendo o número atômico do elementos (LOD está diminuindo com Z).

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Representative Results

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Cultura celular e a imagem latente de fluorescência do TiO fluorescente etiquetada 2 NPs

Nós projetamos um porta-amostras adaptado para cultura de células, manipulação de células, bem como a análise multimodal. Especificamente, era importante que o titular permitida rotina microscopia óptica como bem como nuclear microsonda análise e geração de imagens. Este suporte de amostra é baseado em uma folha de policarbonato espessura 2 µm depositada em um frame PEEK. Células são cultivadas diretamente em policarbonato, em condições de cultura estéril por vários dias e então usadas para configurações experimentais diferentes, tais como a exposição de NPs.

A modificação química de superfície com fluorophores (TRITC) permitiu a detecção de TiO2 PN, bem como sua localização in situ e in vitro em vida ou em paraformaldeído fixada de células usando microscopia de fluorescência. O núcleo da célula e as mitocôndrias foram coradas usando o vital-corante Hoechst33342 (azul para o núcleo) e o transfectadas Matrix-roGFP (verde para mitocôndrias), respectivamente. Esta coloração múltiplos permitiu a localização intracelular do NPs2 TRITC-TiO (por seu vermelho emitindo fluorescência) 20 h após a exposição. O NPs só foram encontrado no citoplasma das células expostas com nenhuma detecção no núcleo. NPs foram aleatoriamente localizado na região perinuclear do citoplasma e totalmente excluído as mitocôndrias (sem sobreposição entre TRITC e GFP sinais).

Apesar de microscopia de fluorescência é muito útil para localizar o NPs no interior das células expostas, não é capaz de avaliar o número exato de NPs por célula. A principal dificuldade da microscopia de fluorescência, sobre a quantificação do NPs está ligada à incerteza que pesa sobre (i) o número de fluorophores anexado a um determinado NP e a estabilidade branqueamento do fluoróforo escolhido durante a observação e (ii) a Estado de agregação do NPs no interior da célula.

Figure 1
Figura 1 : in vitro e in situ fluorescência da imagem latente de U20S células transgênicas expressando Matrix-RoGFP e exposto a TRITC-TiO 2 NPs. As células U2OS (em cima) marcadas com Hoechst33342 (azul), Matrix-roGFP (verde) estão expostas a 4 µg.cm-2 TiO TRITC-etiquetada2 nanopartículas (vermelho) para 20 h. observações indicam que TiO2 NPs agregado nas células em um região perinuclear. Barra de escala: 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para superar estas deficiências, microsonda nuclear análise techniquesprovide uma abordagem complementar para a microscopia óptica convencional, devido a sua sensibilidade para o NPs que impede o uso de qualquer sinal intermediário como fluorescência de um transplantado corante. Além disso, eles também são totalmente quantitativos, fornecendo dados sobre (i) o conteúdo de bioquímico sub celular que é de outra maneira desconhecido e (ii) a quantidade intracelular de NPs no nível da célula única.

Cryofixation de células após a imagem ao vivo.

A maior restrição na realização de análise microsonda nuclear é trabalhar sob condições de vácuo. Nós desenvolvemos um protocolo de fixação de células permitindo a preservação da ultraestrutura biológica e bioquímica integridade do espécime biológico. Fixação química é conhecida para modificar a composição do elemento de traço de células, porque requer a substituição de seu celular médio por um polímero usado para preservar a ultraestrutura celular. Além disso, a remoção de água também libera íons livres e outras espécies, que modifica o geral composição da amostra. Portanto, torna-se obrigatória a dar prioridade a um método de fixação física, nomeadamente métodos criogênicos. Estes procedimentos criogênicos induzem uma rápida cessação da atividade celular e isto, a escala de tempo de milissegundos.

Microscopia de análise microsonda nuclear e quantificação de NPs em escala celular.

Microscopia de íon transmissão (µ-STIM) e análise de raios-x induzida por partículas de emissão (µ-PIXE) foram realizadas em amostras após cryofixation e desidratação para obter dados quantitativos precisos na sua composição química elementar.

µ-STIM imagens revelou as diferenças locais em densidade e permite a detecção de estruturas celulares como o núcleo e o citoplasma. Embora a resolução lateral do feixe permite a observação de densas estruturas tão estreita quanto como de largura, 300 nm fina agregados visíveis aqui no citoplasma, os métodos STIM não podem discriminar entre agregados NP e outras estruturas celulares densas. Isso ocorre porque, como para microscopia eletrônica de transmissão (TEM), o processo físico, levando a variação na energia transmitida é a interação do íon entrante com a nuvem de elétrons atômicos. Ao contrário da análise TEM, no entanto, porque o volume de toda a célula é analisado, variações de espessura local evitar discriminação entre estruturas de alta-Z e um aumento local da densidade celular.

Figure 2
Figura 2 : Imagens de densidade e distribuição elementar obtém por STIM µ e µ-PIXE na cryo-fixo U2OS células. Células de controle U2OS (acima) em relação ao exposto cryo-U2OS em células fixadas (expostos a 4 µg.cm-2 TiO2 NPs, para baixo) e observadas usando microscopia/análise de microsonda nuclear. Microscopia STIM (à esquerda, mapas de escala de cinza) revelou densas intra ou extra cellular estruturas (núcleo, sal agregados, nanopartículas). A resolução espacial (300 nm) é comparável à microscopia de fluorescência e mostra estruturas tais como NP agregados na região perinuclear. Identificação de estruturas com base apenas em sua densidade, no entanto, pode ser ambígua. Os mapas de µ-PIXE elementar de Ti (escala de cores térmica), P e K são complementares aos mapas de µ-STIM. Eles podem ser usados para assegurar a presença de NPs em células. Cada célula pode ser analisada individualmente em termos de concentração do elemento (ver Figura 3). Barras de escala: 10 µm. escalas de cor variam de mínimo (azul), a intensidade máxima (cinza). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Conforme ilustrado na Figura 2, o processamento de µ-STIM permite o reconhecimento de células individuais dentro de uma população tanto também compartimentos sub intracelulares, tais como o núcleo e nucléolo. Infelizmente e como mencionado anteriormente, o NPs não podia sempre ser detectado usando reconstrução µ-STIM.

Análise de emissão (µ-PIXE) de raios-x induzida por partículas fornece não só a composição química da amostra, mas também seu mapeamento elementar (Figura 2). Durante a interação com o feixe de emocionante, os elementos químicos passam por processos de excitação-de-excitação atômicos que acabará por levam à emissão de um fóton que apresenta a energia característica do número atômico do elemento animado. Um espectro de pico característico é construído a partir da soma de todos os eventos do fóton emitido e é considerado uma assinatura química da amostra.

Configurações padrão experimentais e detectores utilizados para experimentos de µ-PIXE permitem a quantificação simultânea de todos os elementos mais pesados que o at com um limite de deteção de massa seca do µg.g de 1 a 10− 1 . Precisão na medição de concentrações elementais é normalmente limitada a cerca de 20% devido à eficiência de coleta e detector de carga.

Neste estudo, a distribuição de elementos como potássio e fósforo e quantificar a quantidade intracelular de TiO2 NPs com mapeamento de titânio é observada por análise microsonda nuclear. Elemento químico mapas são calculados após os fótons são classificados de acordo com a posição do feixe no momento da gravação e a seleção de uma janela de energia, centralizada em torno de um elemento específico. Mapas são representativas do número de eventos detectados na posição do feixe e quantitativos. Tanto barulho e fundo são numericamente simuladas e filtrados. Além disso, mapeamento químico pode ser usado para extrair o espectro PIXE local necessário para quantificação.

Conforme ilustrado na Figura 2, fósforo homogênea é distribuído na cela com, como esperado, uma concentração muito maior na área nuclear. Potássio é distribuído homogeneamente no volume celular. Titânio situa-se na região perinuclear citoplasmático na forma de agregados, como previamente observado usando microscopia de fluorescência (Figura 1). O NPs exibido mesmo perinuclear localização seja qual for seu estado de superfície: funcionalizados (Figura 1) ou nativo (Figura 2). Entretanto, nenhum vestígio de titânio foi detectado em células de controle, confirmando que a distribuição de titânio, observada por µ-PIXE deve ser atribuída ao TiO2 NPs, de acordo com nossas análises anteriores por microscopia de fluorescência.

Além disso, conforme ilustrado na Figura 2, é possível extrair a distribuição intracelular de NPs e concentrações de NPs quantitativas de regiões específicas de interesse. Com base nos mapas STIM e em correlação com as distribuições de fósforo/potássio, análise única célula é possível.

Figure 3
Figura 3 : Análise quantitativa única célula, usando µ-PIXE. Espectros de raios-x individuais calculados para células mostradas na Figura 2 podem ser equipados para determinar a concentração do elemento no nível celular. Esse recurso é particularmente interessante para a análise de NP onde concentrações celulares geralmente mostram fortes variações dentro da mesma população. Por exemplo, para o mesmo significa exposição, o intervalo de concentrações de Ti de 0,2 até 1,8 µg.cm-2. Controles correspondem às populações de células não tratadas. Dose de exposição: 4 µg.cm-2. Boxplots representam a distribuição das concentrações celulares individuais com valor mediano (linha horizontal) e bares, estendendo-se em direção a mais baixos e mais altos medidos valores. Células de controle: N = 14; Expostas as células: N = 16.

Nesse sentido, temos não só quantificar o teor médio de titânio em uma população celular mas também mostra a distribuição de titânio por célula em uma população em uma determinada condição experimental. O teor médio de titânio medido aqui é bastante baixa (500 ng.cm-2) em comparação com a 4 µg.cm-2 dose de exposição da população celular (Figura 3) e a variação entre as células é grande (Ti concentrações variam de 0,2 até 1.8 µg.cm -2 de acordo com as células analisadas). Também notamos um aumento de íons intracelulares, tais como potássio e cálcio em amostras expostas, sugerindo uma homeostase de alteração celular induzida pela presença do TiO2 NPs, como descrito anteriormente por diversos autores. 21 , 27

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Discussion

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Nós descrevemos um método de fornecer informações úteis, além do que é possível com outras técnicas de imagem, especialmente a nível subcelular. Além de sua capacidade de geração de imagens, análise de microsonda nuclear também oferece possibilidades de quantificação dos elementos químicos que entram na composição de uma amostra biológica. No presente trabalho, estudamos as populações de células humanas e voltada para a análise de uma região escolhida de interesse com base em uma única célula exposta ao TiO2 NPs. Sua combinação com outras técnicas fornece tanto morfológica celular imagens e dados quantitativos precisos sobre a composição química elementar.

Para aplicar com sucesso análise microsonda nuclear, é obrigatório respeitar os seguintes pontos para evitar possíveis armadilhas. Em primeiro lugar, é imperativo usar um protocolo criogênico para a fixação da pilha a fim de manter sua ultra-estrutura e sua integridade bioquímica. Em segundo lugar, também é obrigatório para realizar a análise de amostras finas com espessura inferior a 20 µm. Se necessário, corte de amostras cryofixed pôde ser executada. Amostras devem absolutamente ser mantidas congeladas. Em terceiro lugar, também é importante ter em mente que o nuclear microsonda análise revela uma representação bidimensional de amostras biológicas. Assim, a distribuição do elemento químico obtida é uma projeção bidimensional que possivelmente poderia apresentar interpretações errôneas. Essa limitação será contorneada no futuro pelo uso de aquisição tomográfica.

Análise da microsonda nuclear também tem limitações. Deve sublinhar-se que sua principal restrição é a necessidade de realizar a análise sob vácuo. Consequentemente, é imperativo usar protocolos de fixação de célula que preserva a integridade bioquímica e ultraestrutura de células. Portanto, é necessário testar a resistência das amostras biológicas para o procedimento de criogenia (sem adição de resina química). Isto pode limitar o uso de análise microsonda nuclear.

Outra limitação é a acessibilidade às instalações para a realização de análise microsonda nuclear. Os tempos de feixe atribuído limitam-se, portanto, às vezes, e isto é uma restrição adicional para este tipo de experiência demorada. Várias horas são muitas vezes necessários para uma aquisição.

Esta técnica é diferente de outros métodos analíticos, incluindo microscopia, plasma de espectrometria de massa (MS), indutivamente acoplada MS (ICP-MS), cromatografia líquida (LC - MS), de MS e o isótopo radioativo. O último fato é utilizado para estimar a dose celular de elementos químicos, mas eles só são capazes de fornecer informações em um macroscópica escala ou seja, uma quantidade macroscópica de uma amostra. Nenhum deles pode dar acesso, como análise de microsonda nuclear, para uma detecção precisa e mapeamento de uma dose subcellular de elementos químicos específicos (íons do metal ou metal óxido NPs). Estes dados ajudam a acessar para um estudo mais sistemático de avaliação de dose-resposta.

A estimativa precisa da dose quando estudar a internalização de NPs em células é crucial tanto quantitativa NP toxicologia e farmacologia pontos de vista. Como sugerido pela grande discrepância no conteúdo do NP observado, que mostra uma diferença de 10 vezes entre o mínimo e máximo observado concentrações (Figura 3), a concentração média de celular pode não ser um parâmetro relevante para descrever a fenômeno da exposição de partícula. Isto é particularmente verdade quando um efeito limiar deve para ocorrer porque a dose não-homogênea exposição pode levar a observações contraditórias. Desde que a natureza fraccionada de nanopartículas aparece claramente a nível celular, este estudo, portanto, novamente coloca a questão da relevância dos métodos baseados na análise de variáveis globais em perguntas abordando o comportamento das células expostas ao doses não homogênea de contaminantes.

Como ilustrado no caso estudado aqui, observação e quantificação de NPs dentro de células individuais nos permitem compreender melhor a bioacumulação de elementos endógenos/exógenos como óxido de metal NPs. Esta é uma tarefa crítica para outras aplicações de NPs em biomedicina, onde uma compreensão pobre da subjacente distribuição NP nas células pode levar a resultados mal interpretados.

Este protocolo destaca a adequação do uso nuclear microsonda análise com outras técnicas para futuras avaliações de interações NP com espécimes biológicos. A abordagem quantitativa fornece informações sobre o impacto de tal NPs em termos de detecção, identificação, localização e quantificação do nível de uma única célula.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos Serge Borderes direção e edição do vídeo. A agência francesa de investigação nacional apoia o programa de pesquisa TITÂNIOS (ANR CES 2010, n ° CESA 01 009). O CNRS e a Comunidade Europeia como uma atividade de integração desde o "apoio de público e Industrial pesquisa usando íon feixe tecnologia (espírito)" sob o contrato CE n ° 227012. Este trabalho foi apoiado por acções Marie Curie - redes de formação inicial (ITN) como um "integrando atividade apoio pós-graduação com estágios na indústria e treinamento excelência em pesquisa" (SPRITE, D1.3) sob contrato CE n. º 317169. O C'NANO Grand Sud Ouest e a região Aquitânia apoiar o programa de pesquisa TOX-NANO (n ° 20111201003) e o programa de pesquisa POPRA (n ° 14006636-034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
U2OS ATCC, LGC STANDARDS ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine Dominique DUTSCHER L0211-500
FBS 500 mL Dominique DUTSCHER 500105U
Penicillin/Streptomycin  ThermoFisher Scientific 11548876
 L-Glutamine 200 mM, 100 mL  Invitrogen 25030024
Geneticin,  20 mL ThermoFisher Scientific 10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL ThermoFisher Scientific 11570626
Viromer Red Lipocalyx VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid AddGene #49437
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H3570 Handle with care
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) SIGMA-ALDRICH T3163 Surface modification of NPs
Sample preparation
Polycarbonate foil Goodfellow CT301020
Polyether Ether Ketone support (PEEK) Matechplast A-239-4047
Ethanol, ACS absolute SIGMA-ALDRICH 02860-6x1L
Chlorform, Anhydrous, 99% SIGMA-ALDRICH 372978-1L  Caution toxic
Formvar 100 g Agar Scientific AGR1201 Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform
NaOH SIGMA-ALDRICH S5881-500G
Sample fixation
Powder, 95% Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500G Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS
PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) ThermoFisher Scientific 11503387
Prolong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific P36934
Triton X-100 SIGMA-ALDRICH 93443 Harmful
Sample cryofixation
Liquid nitrogen air liquids sante Harmful
Methylbutane >=99% SIGMA-ALDRICH  M32631-1L Caution toxic
Aluminium transfer plate Home-made
Distilled and deionized water Home-made Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system
Parafilm VWR 52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure ThermoFisher Scientific 50129870
Biosafety bench, class II ThermoFisher Scientific MSC-Advantage
TC20 automated cell counter Biorad 145-0102SP
Counting slides 2 wells Biorad 1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV Canberra  PD25-12-100AM
High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED)  Orsay Physics 1-SED
XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl Micromatter 34381
XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 Micromatter 34382
XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal Micromatter 34383
XRF Calibration Standard Silicon as SiO Micromatter 34384
XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx Micromatter 34385
XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 Micromatter 34387
XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal Micromatter 34388
XRF Calibration Standard Iron as Fe metal Micromatter 34389
Sonicator 750W Sonics Materials 11743619
3MM microprobe Bioblock scientific 220-05
Lyophilizer in vacuum Elexience EK3147
Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 431006-9901
Motorized stage xy Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420781-9910
Zeiss filterset 02 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 488002-9901
Zeiss filterset 38HE Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 489038-9901
Zeiss filterset 31 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 000000-1031-350
Chemical fume hood Erlab Captair SD321
Particle accelerator HVEE singletron
Software
ImageJ software National Institutes of health, USA ImageJ 1.51
SimNRA software Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany SIMNRA 6.06
Gupix software Guelph university, Canada GUPIXWIN 2.2.4

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<em>In Situ</em> Deteção e única célula quantificação de nanopartículas de óxido de Metal usando análise de microsonda Nuclear
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Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).More

Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).

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