Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Imaging Metaller i hjernevev med laser ablasjon - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS)

Published: January 22, 2017 doi: 10.3791/55042
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5,6, 7, 7, 8, 8, 2, 3, 1
1Elemental Bio-imaging Facility, University of Technology Sydney, 2Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne, 3Department of Pathology, The University of Melbourne, 4School of Earth Sciences, The University of Melbourne, 5Research School, Ruhr University, 6Department of Physiology, Monash University, 7ESI Ltd., Bozeman, 8Agilent Technologies, Mulgrave

Summary

Kvantitativt kartlegge metaller i vev av laser ablasjon - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS) er en følsom analytisk teknikk som kan gi ny innsikt i hvordan metaller delta i normale funksjon og sykdomsprosesser. Her beskriver vi en protokoll for kvantitativ avbildning metaller i tynne snitt av mus nevrologisk vev.

Abstract

Metaller finnes overalt gjennom en organisme, med deres biologiske rolle diktert av både deres kjemiske reaktivitet og overflod innenfor et spesifikt anatomisk område. I hjernen, metaller har en meget romoppdelt fordeling, avhengig av den primære funksjon de spiller innenfor det sentrale nervesystemet. Imaging den romlige fordelingen av metaller har gitt unik innsikt i den biokjemiske arkitekturen i hjernen, slik at direkte sammenheng mellom nevroanatomi regioner og deres kjente funksjon med hensyn til metallavhengige prosesser. I tillegg inneholder flere aldersrelaterte nevrologiske lidelser forstyrret metall homeostase, som ofte er begrenset til små områder av hjernen som ellers er vanskelig å analysere. Her beskriver vi en omfattende metode for kvantitativ avbildning metaller i mus hjernen, ved hjelp av laser ablasjon - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS) og spesialdesignet bildebehandlingprogramvare. Med fokus på jern, kobber og sink, som er tre av de mest tallrike og sykdomsrelevante metaller i hjernen, beskriver vi de grunnleggende trinnene i prøveopparbeidelse, analyse, kvantitative målinger og bildebehandling for å produsere kart metall distribusjon i lav mikrometer oppløsning rekkevidde. Denne teknikk, som gjelder for en hvilken som helst snitt vev avsnitt, er i stand til å demonstrere den meget variabel fordeling av metaller innenfor et organ eller system, og kan brukes til å identifisere endringer i metall homeostase og absolutte nivåer innenfor fin anatomiske strukturer.

Introduction

Den unike redoks-kjemien av metaller muliggjør en rekke neurologiske funksjoner, herunder signalomforming, energiproduksjon og neurotransmitter syntese. I et antall større neurodegenerative sykdommer, har dyshomeostasis av disse metaller vært både implisert i patogenesen sykdom og identifisert som potensielle nye mål for terapeutisk intervensjon 1. For bedre å forstå hvordan metaller er involvert i tilstander slik som Alzheimers og Parkinsons sykdom (AD og PD, henholdsvis), er det viktig å være i stand til å måle hvor metallfordeling og nivå endres innenfor områdene negativt påvirket av sykdomsprosessen. Disse endringene er ofte en indikasjon på subtile endringer i biokjemiske reaksjoner som kan være nært knyttet til de prosessene som setter i gang celledød, slik som vår nylig foreslåtte mekanismen av jern og dopamin nevro i PD 2.

Tradisjonelt metal nivåer innenfor definerte anatomiske regioner er oppnådd gjennom forsiktig excision, fordøyelse og analyse ved hjelp av en rekke analytiske teknikker 3. Men en slik tilnærming mister romlig informasjon, noe som kan være avgjørende når sykdomstilstander under etterforskning involverer små, veldefinerte regioner eller spesifikke celletyper. En rekke analysefremgangsmåter er tilgjengelige for å visualisere metaller i biologiske systemer, fra intakte prøvene til vevssnitt og i to og tre dimensjoner, ved hjelp av emisjonsspektroskopi, fluorescerende prober og massespektrometri 4. Hver teknikk har fordeler og ulemper med hensyn følsomhet, selektivitet av kjemiske arter, og romlig oppløsning som kan oppnås. For en omfattende oversikt over omfanget av teknikker tilgjengelig, se anmeldelsen av Hare et al. 5.

Massespektrometri (MS) -baserte metoder er de mest følsomme av disse teknikkene, Som kan måle biologisk mest relevante metaller på sitt eget konsentrasjon seks. Laserablasjon - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS) avbildning benytter en fokusert ultrafiolett laserstråle som varierer i størrelse fra 1 til> 100 pm i diameter (eller bredde, når en firkantet bjelke formen er brukt), under hvilke prøven passert 7. Kvantitativ informasjon kan oppnås gjennom representanten ablasjon av standard referansemateriale, som kan produseres ved hjelp av en rekke ulike tilnærminger 8, hver med varierende grad av tekniske problemer og analytisk funksjonalitet. Den vanligste tilnærmingen benytter matrise-matching, hvor en standard med en dominerende kjemiske sammensetning sammenlignbar med den for prøven fremstilles ved å tilsette med målanalytten og nøyaktig vurdert for homogenitet og absolutt metallkonsentrasjon av uavhengige analyseorganer 9, 10. Ablasjon av preparerte standarder kan deretter brukes for eksterne kalibreringsformål, slik at konsentrasjonsdata fra det resulterende prøvebildet som skal ekstraheres per piksel.

Bildeoppløsningen blir bestemt ved både strålen størrelse og hastighet ved hvilken prøven blir skannet. Standarden kvadrupol-designen ICP-MS (som står for over 90% av alle installerte ICP-MS-systemer på verdensbasis 11) er en sekvensiell masse analysator, ved at massen detektor blar gjennom alle valgte masse-til-charge ratio (m / z ) i stedet for å samle inn data samtidig. Således må innsamlingstiden for hver syklus av masser tilsvare den tiden det tar for prøven å traversere en bredde av laserstrålen for å sikre en piksel er representativt for den ønskede oppløsningen er ervervet 12. Laserstråle størrelse valg er en viktig parameter som har betydelige effekter på både sensitivitet og total analyse tid. Som laser ablasjon physitisk fjerner materiale som sveipes av ICP-MS med en argon bæregass, er mengden av materiale som kan være fysisk detektert av analysatoren massen følger den inverse kvadratisk. For eksempel reduserer laserstrålen diameter fra 50 - 25 um resulterer i en reduksjon av ablateres materiale med en faktor på fire. I tillegg, som en skannemetode, mindre diametre bjelke øke den totale tid som kreves for å ablate et valgt område. Derfor er eksperimentell design avgjørende for å balansere den nødvendige romlig oppløsning med sensitivitets behov og tidspress.

Imaging av LA-ICP-MS har vært brukt på en rekke prøver, matriser og sykdomstilstander, inkludert dyremodeller av nevrologiske lidelser 13, 14, traumatisk hjerneskade 15, distribusjon av metallholdig kreft narkotika 16, gifteksponering i morkaken 17 og metall distribution i tennene som en biomarkør for tidlig lige kosttilskudd overganger. 18 I denne protokollen vi beskriver en generell metode for avbilding jern, kobber og sink i den WT musehjerne med en oppløsning på 30 mikrometer, selv om det lett kan tilpasses til en rekke prøvetyper og eksperimentelle resultater, basert på behovene til analytiker.

Protocol

Prosedyrene som er beskrevet har blitt godkjent av Howard Florey dyreetikk komité og holder seg til nasjonal helse- og Medical Research Council standarder for dyr omsorg.

1. Fremstilling av prøve for analyse

MERK: Dette trinnet varierer avhengig av prøvemassen som skal analyseres.

  1. Prøveopparbeidelse og seksjonering
    MERK: Fiksering ved anvendelse av 4% paraformaldehyd (PFA) og kryobeskyttelse i 30% sukrose i 0,1 M PBS vil resultere i varierende mengder av utvasking av metaller fra vev. Se Hare et al 19 for detaljer. Sørg for at alle prøver har gjennomgått identiske feste og kryobeskyttelse trinn.
    1. Tran perfuse den avlivet dyret med iskald 0,1 M PBS, pH 7,4 (se metodedelen i Dodt et al. 20 for detaljer) og ta av hjernen.
    2. Sett hjernen i 4% PFA O / N for å fikse vev.
      3. <li> Cryoprotect hjernen ved å plassere den i 30% sukrose i 0,1 M PBS i 24 timer, og deretter bytte til frisk 30% sukrose i ytterligere 24 timer. 19
    3. Frys hjernen i en kryostat ved -20 ° C i minst 1 time.
    4. Monter hjernen på en chuck med en egnet monteringsmedium.
    5. § hjernen på en cryostat ved hjelp av en metallfritt engangsblad (f.eks polytetrafluoretylen [PTFE] belagte kniver) og montere på en standard objektglass. Den optimale tykkelsen for seksjonen skal være omtrent 30 mikrometer.
  2. Hvis du bruker parafin-embedded prøver, seksjon på ønsket tykkelse, flyte båndet på et varmt vannbad og montere på standard objektglass.
    MERK: Presise effekter av langsiktig fiksering og parafin-embedding av biologiske prøver er ikke kjent. Som beskrevet i 1.1, sikre alle prøver har gjennomgått identiske prøveopparbeidelse prosedyrer hvis komparative analysen er ment.
    1. Dewax paRAFFIN-embedded prøver ved dypping raset i 3 endringer xylen, en endring hver av: 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol og et minimum av 3 endringer i ISO 3696 eller tilsvarende renset vann (heretter referert til som " vann ", se Hare et al 21 for en detaljert metode)..
  3. Tillat prøver lufttørke i ca en time i et støvfritt miljø, for eksempel et lysbilde boks med prøvene plassert vertikalt i stativer og lokket igjen på gløtt.

2. Utarbeidelse av Matrix-matchet Standards

MERK: Følgende er en oppsummering protokoll tidligere utgitt ni. Ta kontakt med den opprinnelige papir for detaljert fremgangsmåte for å forberede matrise matchet vev standarder.

  1. Skaff kommersielle lam hjerne (eller lignende) og skyll i vann, fjerne alt blod og bindevev.
  2. Ved hjelp av en skalpell, nøye dissekere ca 50 g av kortikal tissue og delvis homogen ved hjelp av en håndholdt vevshomogenisator med en polykarbonat disponibel sonde på lav effekt. Dele inn 5 g prøver, og antallet avhengig av kalibreringsområdet og antall kalibreringspunkter som ønskes.
  3. Fremstille oppløsninger av metaller for å pigge hver standard ved oppløsning av et oppløselig salt av hver analytt (f.eks FeSO 4 · H 2 O) i 1% salpetersyre for å fremstille 0,1, 1 og 100 mg metall ml -1 aksjer.
  4. Legg til en på forhånd beregnet volum av stamløsningen til 5 g alikvotert vev (for eksempel, 5 ul av 10 mg ml -1 for en tilnærmet sluttkonsentrasjon på 10 ug g -1 vått vev) for å oppnå en rekke tilsatte metallnivåene i hver standard.
    1. Avhengig av den ønskede sluttkonsentrasjon av hver standard, bruke en kombinasjon av hvert metall stamløsning for å sikre den minimale mengden av oppløsninger tilsettes til standarden. Legg en endelig pigg av vann til hver standard for å sikre equivalente volumer av tilsatt væske er til stede i hver standard.
    2. Homogen piggete standarder på lav effekt i ca 30 s. Hvis ikke skal brukes umiddelbart, holde frosset ved -20 ° C i polypropylenrør avkortet forseglet med Parafilm.
  5. Bestem nøyaktig konsentrasjon og homogenitet av hver standard å bruke en av disse fremgangsmåtene:
    1. mikrobølgeovn fordøyelsen
      1. Plasser 6 nøyaktig veiet opp (ca. 50 mg) alikvoter av en standard i en vasket PTFE fordøyelse kar og tilsett 4 ml konsentrert (65%) salpetersyre og 1 ml 30% hydrogenperoksyd. Seal og fordøye på 500 W i 30 min.
      2. Etter avkjøling av fordøyelse fartøyet, åpen i et avtrekksskap og kvantitativt overføres fordøyd løsning på en syrevasket 50 ml rør ved hjelp av 10 ml porsjoner av vann. Gjør til ca. 50 ml, og nøyaktig veie den mengde av den ferdige oppløsning.
      3. Gjenta trinn 2.5.1.1 - 2.5.1.2 for hver standard.
    2. Bruk følgende fremgangsmåte hvis mikrobølgeovn fordøyelsen utstyr ikke er tilgjengelig:
      1. Plasser seks nøyaktig målt (mellom 25-200 mg) prøver av standard i syrevasket / metall-fri polypropylen rør og Lyofiliser O / N.
      2. Legg 40 mL konsentrert salpetersyre og varme, uten lokk, på en varmeblokk til 70 ° C i 5 minutter, og deretter tilsettes 10 ul av 30% hydrogenperoksyd. Varme i ytterligere 5 min, og deretter nøyaktig gjør i 1 ml total volum ved hjelp av 950 ul av 1% salpetersyre.
        MERK: Det anbefales å fordøye et sertifisert referansemateriale ved hjelp av metoden for valg for å sikre fordøyelse prosedyrer er nøyaktige.
  6. Bestem metallkonsentrasjon i hver fordøye oppløsning ved oppløsning forstøvning ICP-MS ved anvendelse av en standard protokoll. Vurdere homogeniteten av hver standard ved å bestemme det relative standard avvik (% RSD) mellom hver tilsetning. Sørg% RSDs alle faller innenfor 15%. Ved å bruke den målte masse av each alikvot, beregne den nøyaktige metall konsentrasjonen av hver homogenisert vev standard.
  7. Retur til homogenisert vev standard, pakke en 5 x 5 mm plast disponibel histologi mugg og fryse i iso pentan avkjølt i flytende nitrogen. Fjern det frosne vev standard blokken fra støpeformen og seksjonen på en kryostat ved den samme tykkelse som prøven.
    Merk: Det anbefales å utarbeide et antall seksjoner med varierende tykkelser for fremtidige eksperimenter. Lufttørket standarder kan lagres på ubestemt tid i en lufttett og støvfritt beholder.

3. Utarbeidelse av LA-ICP-MS for analyse

  1. Plasser standardene og prøven i ablasjon kammeret, slik at de ligger innenfor dybdeskarpheten av CCD-kamera montert på LA enhet. Hvis tuning av instrumentet er nødvendig, er egnet referansemateriale (for eksempel NIST 612 Trace Elements i Glass). Stram de to skruene på kammeret døren for å forsegle the ablasjon kammeret.
  2. I ICP-MS programvaren, velger åpne argon gassventilen i "vedlikehold" eller lignende panel og sette bære gasstrømmen til 1.2 L min -1 i den aktuelle dialogboksen.
    Merk: I denne protokollen argon brukes som bæregass. Flere eksempler bruke enten helium eller en blanding av helium og argon som bæregass. Se Günther og Heinrich 22 for tekniske detaljer for bruk av helium og argonblandinger da aerosol bæregasser.
  3. I LA programvaren, klikker du på purge-knappen for å skylle cellen med argon gass i minst 30 min.
    MERK: Purge tid kan endres ved å klikke på en utrenskning tid "eller lignende knapp. Ved bruk av en ablasjon system med en to-volum ablasjon celle, periodisk bevege fasen til hvert hjørne og på skrå traversere cellen for å sikre så mye gjenværende luft blir fjernet fra cellen som mulig. Dette kan oppnås ved å velge 'hjem stadier eller ekvkova-lente funksjon.
  4. Slå på ICP-MS ved å klikke "plasma på" og la den varmes opp i to timer, og i løpet skritt 03.05 til 04.04 kan utføres. Instrumentinnstillinger varierer fra produsent til produsent, men et eksempel på egnede LA-ICP-MS driftsforholdene kan bli funnet i Hare et al. 10.
  5. Representant ablasjon av vev standarder
    1. Velg linjen verktøyet og tegne en eneste linje med ablasjon ca 3 mm lang over vev overflaten.
    2. Still inn parameterne som følger ved å høyreklikke på linje med ablasjon i forsøket listen og endre følgende: strålediameteren (valgt som hensiktsmessig av brukeren, en 30 mikrometer firkantet bjelke er brukt her), skannehastighet (4 ganger strålediameteren per sekund, 120 nm s -1) og energi innflytelse (0,3 -0,5 J cm -2 for bløtvev, optimalisere om nødvendig for hardere matriser). Ved 30 mikrometer vevstykkelsen laserstrålen ikke trenger full thickness av dette vev, eliminere enhver potensiell forurensning fra mikroskopet støtte. Normalisering til karbon 23 kan brukes til å korrigere for variasjoner i mengden av vev ablateres. Sett disse parametrene som standard for hver etterfølgende linje ved å velge «standard» -knappen.
    3. Kopiere denne linjen seks ganger ved å velge den første linjen, høyreklikke og velge 'like skanninger'. Sørg for at linjene er forskjøvet i enten x - eller y-aksen av strålen diameter. Dette gir et totalt syv linjer pr standard, i avstand fra hverandre i henhold til den strålediameteren.
    4. Gjenta trinn 3.5.1 - 3.5.3 for hver standard, sikre linjen av samme lengde.
  6. Å trekke ablasjon området over prøven, følge en av de to følgende metoder:
    MERK: Pass på de samme skanneparametrene (strålen diameter, skanning hastighet, energi Fluence) brukes for eksempel linjer.
    1. Hvis LA systemet er utstyrt med enbredt synsfelt, velg linjen verktøyet og trekke en linje fra øverste venstre hjørne av prøven lenge nok til å dekke prøven på sitt bredeste punkt ved hjelp av de samme laser parametrene er beskrevet i 3.5. Kopiere denne skanning som beskrevet i 3.5.3 med linjer adskilt i henhold til den strålediameteren så mange ganger som nødvendig for å sikre fullstendig dekning av prøven.
    2. Hvis et bredt synsfelt ikke er tilgjengelig, bestemme og registrere x og y koordinater (vanligvis vises på hovedskjermen som "scene posisjon" eller lignende) tilsvarer hjørnene av et rektangel som dekker hele prøven. Bruk disse koordinatene til å posisjonere parallelle linjer med ablasjon dekker hele prøven området som beskrevet i 3.7.1.
    3. Tegn linjer for periodisk scanning av standarder senest etter ~ 20 timer med skanning prøven ved å gjenta prosessen beskrevet i 3.5. Avhengig av varigheten til skanningen av prøven dette kan være nødvendig flere ganger. Eksperimentet avsluttes med en Addielle skanning av standardene.
      MERK: Når bestemmelse av x og y koordinater mens cellen blir spylt, velge utgangsstillingen og den tilhørende kalibrering av aksen endrer den tidligere fangede spesifikk for x- og y-koordinater, mens forskjellen (dvs. lengden av linjen) vil være upåvirket.

4. Sette opp Datainnsamling Metoder for ICP-MS

  1. For den standard linje av ablasjon, dele lengden av linjen ved laserskannehastighet for å bestemme den totale analysetiden for en enkelt linje. Gjenta dette for prøveledningen.
  2. I ICP-MS programvare, opprette en ny metode (her vist som en "batch") og sørge for at "tid løst analyse" eller tilsvarende er valgt. Velg m / z-verdier for å bli oppdaget, og deretter justere integreringstiden for hver m / z slik at den totale integrasjonstiden for en syklus tilsvarer 0,25 s. Klikk Lagre Batch As 'og navn tilsvarende (f.eks Std1).
    MERK: Som prøve vil gå gjennom laserstrålen mot fire ganger strålediameteren, sikrer dette et datapunkt for hver masse er registrert som tilsvarer strålediameteren 12. For eksempel ved hjelp av en 100 mikrometer spot størrelse, en skannehastighet på 400 mikrometer s -1 med en integrering tid på 0,25 s vil produsere bilder med ekte pixel størrelser. Integrasjonstiden kan justeres for å forbedre følsomheten; når økende integrasjon tid til 0,33 s skannehastighet bør bli redusert til tre ganger strålen diameter.
  3. For standarder, angir analysetiden for hver linje skanning i den aktuelle boksen, pluss ytterligere 15 s å gjøre rede for laser oppvarming og utvasking ganger. Angi en prøve kjørelisten (dvs. i hvilken rekkefølge skanninger blir drevet) med det samme antallet kjøp (vanligvis nummerert fortløpende, dvs. 001, 002, etc.) som det totale antall standard linjer.
  4. For prøven, Kopiere metoden som brukes for standarder ved å lagre gjeldende metode eller batch med en alternativ filnavn, og justere den totale oppkjøpet tid (inkludert de ekstra 15 s) og totalt antall oppkjøp for å samsvare med antall linjer som vil ablate prøven .
    MERK: Som de fleste LA-ICP-MS-systemer bruker en enveis-trigger (utløser LA ICP-MS), er det viktig at den ICP-MS programvare avventer avtrekkeren fra LA før den påfølgende linje av ablasjon starter. Oppkjøpet vindu ICP-MS vil lese 'venter på start ".

5. Kjøre Experiment

  1. Start ICP-MS køen ved å tilsette den første metode eller batch til køen og sikre at programvaren avventer avtrekkeren fra LA-systemet.
  2. I LA programvaren, aktiverer laser strømforsyningen ved å klikke "utslipp", klikk "Kjør" og sette laseren warmup tiden til 10 s og utvaskningstiden 20 s i de aktuelle boksene.
    Merk: Denne Overskridelsesikre ICP-MS er klar til å begynne å anskaffe nye data når laseren settes i hver etterfølgende linje for ablasjon.
  3. Start laser sekvens ved å klikke på "Start". Hvis du bruker en to-volum celle, sikre prøvekoppen er på plass.

6. Beregning kvantiteringsstandarder

MERK: Det er flere varianter for å konvertere ICP-MS-data til bilder. Disse inkluderer bruk av hjemme-laget programvareverktøy som er skrevet i åpen kildekode språk 17, 24, 25, kommersielle makroer 26 og dataanalyse programvare. 7 Her bruker den nylig utviklede programvaren plugin (beskrevet i Paul et al. 27), basert på en spesialisert LA-ICP-MS dataanalyse suite 28.

  1. Overfør alle sats mappene som inneholder kjøre data (001.d, 002.d, osv.) På enseparat datamaskin med analysen programvare installert. Pakk ut * .csv datafiler for hver linje i batch i en egen mappe.
    MERK: Ved hjelp av et skript for automatisk å overføre * .csv filer til en ny mappe er sterkt anbefalt. Se vedlagte Python-kode for flere detaljer. Dette skriptet er skrevet for å passe enten en Agilent 7700 eller 8800-serien ICP-MS, men kan redigeres for å passe utdatafilen fra andre produsenter.
  2. Åpne programvaren plattformen og følge tappene sekvensielt å importere og analysere standarder for å fremstille kvantitative bilder som beskrevet nedenfor.
  3. Hvis du vil importere data fra den første standarden batch, velg "Agilent CSV" for "File Type", "hel mappe" for "Import type 'og sjekk at den" Date format' er identisk med datamaskinen format. Klikk 'Import', velg mappen som inneholder CSV-filer for det første settet av standarder, og flytte til den "grunnlinjene 'kategorien.
  4. baselinesubtraksjon
    1. Bruk kategorien «Automatiske Selections '(kommando 2) fra hovedprogramrullegardinmenyen i verktøylinjen, velg" Informasjon fra import "og klikk" Fortsett ".
    2. Klikk "Select All" og velg "Baseline_1 'for integrering.
    3. For å velge de første 10 s med hver skanning linje (tilsvarende laser oppvarmingstid), beskjære data ved å andre verdier '0' og '(varighet over streken - 10 s) "og klikk" Legg til integrasjoner "(f.eks for en 35 s skanning linje, angi verdier '0' og '25').
  5. Slik velger du eksempeldataene, bruke 'Automatiske Selections fanen som beskrevet i 6.4, men velg' OUTPUT_1 'som integrering. Beskjær data fra begynnelsen og slutten av hver standard linje for å utelukke bakgrunnssignalet (f.eks for en 35 s scan feltet skriver verdier "13" og "4").
  6. For å utelukke dråper i signalet forårsaket av imidlebare hull i standarder, i "Samples" fanen, klikk 'Channels' øverst til venstre for diagramområdet for å velge en kanal med et høyt signal til støyforhold (f.eks C13 eller P31). Noter eventuelle skarpe dråper i signalet, og velg en CPS verdien lavt nok som er under den normale variasjonen i prøvene, men høy nok til å plukke ut de skarpe dråper i signalet.
  7. Klikk på fanen "DRS" og velg "Baseline_Subtract 'for' Current datareduksjon Scheme". Velg kanal fra 6,6 for 'Index Channel "og CPS verdi for' Threshold å bruke når maske lave signaler". Sett inn en verdi <0,5 s for 'Seconds å trimme før / etter lave signaler "til å gjøre rede for forsinkelsen i signaloverføringen fra laseren til ICP-MS.
  8. For å bekrefte tilstrekkelig maskering av de lave signal områder, klikker tilbake til "Samples" -kategorien og velg en bearbeidet (f.eks., Fe56_CPS) kanal spor. Gjenta og avgrense CPS og & #39, Sekunder å trimme før / etter lave signaler verdier som i 6.7 om nødvendig.
  9. Klikk på "Resultater" -fanen og velg "Eksporter data" fra hovedprogram nedtrekksmenyen. Skriv inn et filnavn for å generere et regneark datafil av resultatene (f.eks, Std1 beregninger, Std2 ...).
  10. Åpne datafilen i en passende regnearkprogram og beregne CPS-verdier for hver enkelt kanal som skal kvantifiseres. Bruk forutbestemte metallkonsentrasjoner fra oppløsningen forstøvning ICP-MS for å beregne konverteringsfaktoren fra CPS-verdier til ppm (ig g-1) for hvert element kvantifiserbare.
  11. Gjenta trinn 06.03 til 06.10 for alle sett av standarder i løp.

7. Konstruere Kvantitative Images

  1. Skriv 'BioLite () "i ledeteksten for å åpne opp programvaren.
  2. Importer eksempeldataene ved å klikke på 'Last inn bilder' og velge mappen som inneholder CSV-filer for eksempelbilde.
  3. bakgrunnskorreksjon
    1. Klikk på fanen grunnlinjene "for å søke bakgrunnskorreksjon for prøven. På fosfor (P31) image bedt på skjermen, velger områder av bakgrunnen ved hjelp av rektangelet uavgjort verktøyet. Velge så mange områder som mulig skaper et bilde dekkende kart over signal / plasma drift for å sikre tilstrekkelig kompensasjon fra disse konfunderende faktorer.
    2. For å gjøre bakgrunnssignalet mer synlig, velger grafen redigeringsverktøyet (øverst til venstre på bildet som vises) og høyreklikk på bildet. Velg "Endre bilde Utseende" og endre "Første farge på Z = 'til en stor negativ verdi (for eksempel -100 000). Fortsett ved å klikke "Done".
  4. Klikk kategorien "Standards" for å få opp en tabell for CPS / ppm korreksjonsfaktorer. Angi verdier beregnet fra standarder i trinn 6,10 for hvert av elementene. Dette vil hjelpe til å korrigere for følsomheten drift i ICP-MS. Klikk "Go! '
  5. Åpne 'Data Browser "fra kategorien' Data ', som holder bildene for hvert element, og hvert trinn.
  6. For å sluttføre et bilde for eksport, velger du ønsket bilde i 'StdCorrImages mappen, høyreklikker du på bildenavnet (* _ppm) og klikk "NewImage'. Høyreklikk på bildet for å åpne 'Endre Bilde Utseende "for å velge ønsket farge bord og fargeskala. Legg en fargeskala på bildet ved å høyreklikke på bildet og velge "Legg til Kommentar '. Velg "ColorScale" fra øverst til venstre rullegardinmenyen og bruke fanene for å endre den ønskede fargeskala.
  7. Hvis du vil eksportere et bilde, sørg for at det aktuelle bildet er valgt, og naviger til "Fil" -fanen og klikk på "Lagre grafikk ... '. Velg ønsket format og lagre bildet. Alternativt kan det valgte bildet overføres ved hjelp av kopier og lim verktøy.
  8. Gjenta trinn 7,6 og 7,7 for alle bildene av interesse.
  9. Quantifying adskilte områder
    1. For å aktivere ROI verktøy, går du til fanen Analysis "," pakker "og velg" Bildebehandling ".
    2. Velg ønsket bilde og naviger til "Bilde" fanen, og klikk "ROI ... '. Klikk "Start ROI draw" og bruke et tegneverktøy for å velge et område av interesse i prøven. For å avslutte tegningen, klikk "Finish ROI '.
    3. Å tilegne statistikken for den valgte ROI, naviger til "Bilde" fanen, og klikk "Stats ...".
    4. Kopier og lim inn resultatene til et eget regneark. Gjenta ROI utvalg (7.9.2) for alle regioner og elementer av interesse.

Representative Results

For å vise mulighetene denne LA-ICP-MS bildebehandling tilnærming, et enkelt eksperiment ved hjelp av en enkelt del av en WT C57BL / 6 mus hjernen, delt i to på corpus callosum og seksjonert i den koronale flyet, blir presentert. En arbeidsflyt for analysen av data ved hjelp av BioLite (figur 1), slik det er beskrevet i avsnitt 6 og 7, så vel som for å tilveiebringe et representativt bilde av metall fordeling i seksjonen analyseres (figur 2) er også beskrevet.

Som det kan ses av metall fordelingen i musehjerne er variabel i henhold til anatomisk område. Dette kan tilbakeføres til de variable roller metaller, og mer spesielt proteinene til hvilket de er bundet, spille i hvert hjerne region 27. For eksempel, har en tendens til jern for å ha høyere konsentrasjoner i midthjernen og langs dentate gyrus, mens sink er mest rikelig i Cortical områder. Karbon, som er et vanlig brukt intern standard 8, er homogent fordelt. Elementærkart (figur 2) kan være spesielt nyttig når den brukes sammen med eksisterende anatomiske og funksjonelle referanse atlas 29, hvor informasjon om colocalization av metaller kan ekspresjonen av spesifikke metall-bindende proteiner kan gi innsikt i funksjon av metaller i en hjerne region, eller endringer i metallnivåene i tråd med en identifisert sykdomsrelatert biomolekyl. Ved hjelp av den beskrevne metode, som er optimalisert for et bredere spekter av analytter, utelukker følsomhet for lav overflod elementer som mangan, og fremgangsmåter kan tilpasses for å fokusere primært på denne analytten ved å øke oppholdstider på bekostning av andre målte masser.

Den store fordelen med å bruke bildebehandling med LA-ICP-MS er å observere relative forskjeller i metall konsentrasjonerasjon og distribusjon mellom eksperimentelle grupper. Vi har tidligere benyttet en slik teknikk for å demonstrere økt jern etter en neurotoxin fornærmelse ligne PD 2, 10, og endringer i kortikale jern i human Alzheimers sykdom vev 21. En slik protokoll som er beskrevet her kan enkelt tilpasses til en annen vevstype med minimale endringer i de nevnte metoder.

Figur 1
Figur 1: Arbeidsflyt for bildebehandling. Arbeidsflyt som er komplementær til avsnitt 6 og 7, som viser omdannelsen av rå tid oppløste data fra ICP-MS til kvantitative bilder av metallfordeling i musehjerne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2
Figur 2: Typisk Elemental Fordeling av Biometals innenfor en mus hjernen. Representative element kart fra 30 mikrometer tykk koronale delen av et enkelt muse hjerne halvkule analysert med LA-ICP-MS. Bilder til karbon-13 (C13), magnesium-24 (MG24) og fosfor-31 (P31) vises i gull fargeskalaer (tellinger per sekund; CPS) (øverste rad). Kvantitative bilder (nederste rad) for mangan-55 (Mn55), kobber-63 (Cu63), jern-56 (Fe56) og sink-66 (Zn66) vises med tilsvarende BlueHot fargeskalaer (mikrogram g -1). Total analysetid for hjernen seksjonen var omtrent 5 timer. Scale bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Imaging metaller i nevrologisk vev er bare ett eksempel på hvordan denne protokollen kan gi nyttig informasjon om utbredelse og mengder av metaller i enhver biologisk matrise. Selv om fremstillingen av standard referansemateriale kan være anstrengende, er det et eksperiment som kan utføres en gang, og arkiveres for senere bruk.

LA-ICP-MS har visse fordeler fremfor alternative metoder, som synkrotron-baserte X-ray fluorescens mikroskopi, for det meste i form av tilgjengelighet og sensitivitet. Men det er visse ulemper som bør vurderes ved utarbeidelse av et eksperiment ved hjelp av LA-ICP-MS, og som sådan er det ofte en nyttig komplementær teknikk for kjemisk bildebehandling som inkluderer alternative metall analyseteknikker, samt komparativ histokjemi 5.

Justering med kjente anatomiske trekk av mus hjernen kan gi nyttig informasjon om mulig funksjonell forholdonship mellom metallnivåer og romlig fordeling. Tidligere har vi brukt Allen Brain Atlas elektronisk ressurs, 29 som er en åpen-tilgang oppbevaringssted for både anatomiske og genuttrykk data i C57BL / 6 mus hjernen til å undersøke romlige korrelasjon av både metall-avhengig enzym uttrykk 14 og nevroanatomi 27, 30. Andre ressurser, for eksempel gnagere Brain WorkBench 31 er også tilgjengelig for å bistå med registrering og justering av metallbilder for å bistå i riktig identifikasjon av metall distribusjon i ofte små anatomiske regioner.

Anvendelser av denne teknikken er nyttig for å vurdere hvordan metallnivåer og distribusjon endring på mikro gjennom både normale livshendelser (for eksempel aldring) og i sykdomstilstander; så vel som å studere effekten av både metallholdige forbindelser og medikamenter utformet for å målrette megtal metabolisme. Dagens store begrensninger i LA-ICP-MS som en avbildningsteknikk for romlig vurdere metall distribusjon er gjennomstrømming og følsomhet. Det er et kompromiss mellom hastighet på analyse og romlig oppløsning 5, 12, med høyere oppløsning som krever lengre analysetider. Teknikken er godt egnet for biologiske elementer ved høyere konsentrasjoner, selv om elementer som mangan, kobolt og selen er begrenset på grunn av deres lave mengder i normalt vev og / eller begrensninger i deres deteksjon ved konvensjonell ICP-MS. Nye fremskritt i ICP-MS teknologi, for eksempel innføring av trippel-kvadrupol masse analysatorer, gir mulighet for målrettet påvisning av vanskelige analytter, så som selen 32 ved høy følsomhet 33. Som et teknologidrevet prosedyre, fremskritt innen både laser og massespektrometri design vil se denne avbildningsteknikk fortsette å utvikle seg, økerhastigheten på analyse og følsomhet 34.

Acknowledgments

DJH og PAD er støttet av en australsk Forskningsrådet Heis Project (LP120200081) med Agilent Technologies og ESI Ltd. Bidraget fra BK ble støttet av Ruhr-universitetet forskerskolen PLUS, finansiert av Tysklands Excellence Initiative [DFG GSC 98/3]. DJH ble delvis støttet av Ramaciotti Foundation. KK er støttet av Sigrid Juselius Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soda glass microscope slides n/a n/a Typical slides are suitable for all experiments
PTFE-coated microtome blades C.L. Stuckey DT315R50 Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering.
Parafomaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 16005 Any supplier suitable
Sucrose n/a n/a Commercial grade white sugar is suitable
Phosphate-buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P5368 Premixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols
Xylene Sigma-Aldrich 247624 Any supplier suitable
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Any supplier suitable
Lamb brain n/a n/a Available from most local butchers
Metal salts n/a n/a Use water soluble metal salts containing desired analytes
Omni TH Tissue Homogeniser Omni Inc THP115 Alternative homogenizers are suitable
Polycarbonate homgenizer probes Omni Inc TH115-PCRH
Microwave digestion unit n/a n/a Optional. See Section 2
1.5 mL microfuge tubes TechnoPlas P4010 Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable
65% nitric acid Merk Millipore 100441 Trace analysis grade
30% hydrogen peroxide Sigma-Aldrich 95321 Trace analysis grade
10 x 10 mm disposable cryomolds Ted Pella 27181
Isopentane Sigma-Aldrich 76871
Liquid nitrogen n/a n/a Use local supplier
NWR213 Laser Ablation system ESI Ltd n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Agilent 8800 Series ICP-MS Agilent Technologies n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Iolite Iolite Software n/a Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol
Excel Microsoft n/a
IGOR Pro Wave Metrics n/a Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barnham, K. J., Bush, A. I. Biological metals and metal-targeting compounds in major neurodegenerative diseases. Chem Soc Rev. 43 (19), 6727-6749 (2014).
  2. Hare, D. J., Double, K. L. Iron and dopamine: a toxic couple. Brain. 139 (4), 1026-1035 (2016).
  3. Savory, J., Herman, M. M. Advances in instrumental methods for the measurement and speciation of trace metals. Ann Clin Lab Sci. 29 (2), 118-126 (1999).
  4. New, E. J. Tools to study distinct metal pools in biology. Dalton Trans. 42 (9), 3210-3219 (2013).
  5. Hare, D. J., New, E. J., de Jonge, M. D., McColl, G. Imaging metals in biology: balancing sensitivity, selectivity and spatial resolution. Chem Soc Rev. 44 (17), 5941-5958 (2015).
  6. Pozebon, D., Scheffler, G. L., Dressler, V. L., Nunes, M. A. G. Review of the applications of laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) to the analysis of biological samples. J Anal At Spectrom. 29 (12), 2204-2228 (2014).
  7. Becker, J. S., Zoriy, M. V., Dehnhardt, M., Pickhardt, C., Zilles, K. Copper, zinc, phosphorus and sulfur distribution in thin section of rat brain tissues measured by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: possibility for small-size tumor analysis. J Anal At Spectrom. 20 (9), 912 (2005).
  8. Hare, D. J., Austin, C., Doble, P. Quantification strategies for elemental imaging of biological samples using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. The Analyst. 137 (7), 1527-1537 (2012).
  9. Hare, D. J., Lear, J., Bishop, D., Beavis, A., Doble, P. A. Protocol for production of matrix-matched brain tissue standards for imaging by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Anal Meth. 5 (8), 1915-1921 (2013).
  10. Hare, D. J., et al. Quantitative elemental bio-imaging of Mn, Fe, Cu and Zn in 6-hydroxydopamine induced Parkinsonism mouse models. Metallomics. 1 (1), 53 (2009).
  11. Potter, D. A commercial perspective on the growth and development of the quadrupole ICP-MS market. J Anal At Spectrom. 23 (5), 690 (2008).
  12. Lear, J., Hare, D. J., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 27 (1), 159 (2012).
  13. Matusch, A., et al. Cerebral bioimaging of Cu, Fe, Zn, and Mn in the MPTP mouse model of Parkinson's disease using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). J Am Soc MAss Spectrom. 21 (1), 161-171 (2010).
  14. Hare, D. J., et al. An iron-dopamine index predicts risk of parkinsonian neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta. Chem Sci. 5 (6), 2160-2169 (2014).
  15. Portbury, S. D., Hare, D. J., Sgambelloni, C., Finkelstein, D. I., Adlard, P. A. A time-course analysis of changes in cerebral metal levels following a controlled cortical impact. Metallomics. 8 (2), 193-200 (2016).
  16. Theiner, S., et al. LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids - a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs. Metallomics. 8, 398-402 (2016).
  17. Niedzwiecki, M. M., et al. A multimodal imaging workflow to visualize metal mixtures in the human placenta and explore colocalization with biological response markers. Metallomics. 8, 444-452 (2016).
  18. Austin, C., et al. Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates. Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).
  19. Hare, D. J., et al. The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue. J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).
  20. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).
  21. Hare, D. J., et al. Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer's disease frontal cortex. NeuroImage. 137, 124-131 (2016).
  22. Günther, D., Heinrich, C. Enhanced sensitivity in laser ablation-ICP mass spectrometry using helium-argon mixtures as aerosol carrier. J Anal At Spectrom. 14 (9), 1363-1368 (1999).
  23. Austin, C. A., et al. Factors affecting internal standard selection for quantitative elemental bio-imaging of soft tissues by LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 26 (7), 1494-1501 (2011).
  24. Hare, D. J., et al. Three-dimensional elemental bio-imaging of Fe, Zn, Cu, Mn and P in a 6-hydroxydopamine lesioned mouse brain. Metallomics. 2 (11), 745-753 (2010).
  25. Osterholt, T., Salber, D., Matusch, A., Becker, J. S., Palm, C. IMAGENA: Image Generation and Analysis - An interactive software tool handling LA-ICP-MS data. Int J Mass Spectrom. 307 (1-3), 232-239 (2011).
  26. Uerlings, R., Matusch, A., Weiskirchen, R. Reconstruction of Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Spatial Distribution Images in Microsoft Excel 2007. Int J Mass Spectrom. 395, 27-35 (2015).
  27. Paul, B., et al. Visualising mouse neuroanatomy and function by metal distribution using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging. Chem Sci. 6 (10), 5383-5393 (2015).
  28. Paton, C., Hellstrom, J., Paul, B., Woodhead, J., Hergt, J. Iolite: Freeware for the visualisation and processing of mass spectrometric data. J Anal At Spectrom. 26 (12), 2508 (2011).
  29. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  30. Hare, D. J., et al. Three-dimensional atlas of iron, copper, and zinc in the mouse cerebrum and brainstem. Anal Chem. 84 (9), 3990-3997 (2012).
  31. Hjornevik, T., et al. Three-dimensional atlas system for mouse and rat brain imaging data. Frontiers Neuroinform. 1, 4 (2007).
  32. Bishop, D. P., et al. Elemental bio-imaging using laser ablation-triple quadrupole-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 31 (1), 197-202 (2016).
  33. Balcaen, L., Bolea-Fernandez, E., Resano, M., Vanhaecke, F. Inductively coupled plasma - tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS): a powerful and universal tool for the interference-free determination of (ultra)trace elements - a tutorial review. Analytica Chimica Acta. 894, 7-19 (2015).
  34. Van Malderen, S. J. M., Managh, A. J., Sharp, B. L., Vanhaecke, F. Recent developments in the design of rapid response cells for laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry and their impact on bioimaging applications. J Anal At Spectrom. 31, 423-439 (2016).

Tags

Medisin bildebehandling laser ablasjon induktivt koplet plasma-massespektrometri metaller metallomics nevrovitenskap
Imaging Metaller i hjernevev med laser ablasjon - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hare, D. J., Kysenius, K., Paul, B., … More

Hare, D. J., Kysenius, K., Paul, B., Knauer, B., Hutchinson, R. W., O'Connor, C., Fryer, F., Hennessey, T. P., Bush, A. I., Crouch, P. J., Doble, P. A. Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (119), e55042, doi:10.3791/55042 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter