Summary
Quantitativamente mapeamento metais no tecido por ablação a laser - indutivamente acoplado plasma - espectrometria de massa (LA-ICP-MS) é uma técnica analítica sensível que pode proporcionar uma nova visão sobre como os metais participar nos processos de função e doenças normais. Aqui, descrevemos um protocolo para imagiologia quantitativamente metais nas seções finas de tecido neurológico mouse.
Abstract
Os metais são encontradas ao longo de um organismo ubiquamente, com o seu papel biológico tanto ditada pela sua reactividade química e abundância dentro de uma região anatómica específicas. Dentro do cérebro, metais têm uma distribuição altamente compartimentada, dependendo da função primária que desempenham no sistema nervoso central. Imagem da distribuição espacial dos metais forneceu visão única da arquitectura bioquímica do cérebro, o que permite uma correlação directa entre as regiões neuroanatomical e a sua função conhecida no que diz respeito a processos dependentes de metais. Além disso, várias doenças neurológicas relacionadas com a idade apresentam perturbado homeostase metal, que é muitas vezes confinados a pequenas regiões do cérebro que são de outra maneira difícil de analisar. Aqui, descrevemos um método abrangente para imagiologia quantitativamente metais no cérebro do rato, usando ablação a laser - plasma indutivamente acoplado - espectrometria de massa (LA-ICP-MS) e processamento de imagem especialmente concebidoProgramas. Concentrando-se em ferro, cobre e zinco, que são três dos metais mais abundantes e doenças relevantes dentro do cérebro, descrevemos os passos essenciais na preparação da amostra, análise, medições quantitativas e processamento de imagem para produzir mapas de distribuição de metal dentro da baixa micrômetro faixa de resolução. Esta técnica, aplicável a qualquer secção de corte de tecido, é capaz de demonstrar a distribuição altamente variável de metais dentro de um órgão ou sistema, e pode ser utilizada para identificar alterações na homeostase de metal e os níveis absolutos no interior de estruturas anatómicas finas.
Introduction
A química redox única de metais facilita uma gama de funções neurológicas, incluindo a transdução do sinal, produção de energia e síntese de neurotransmissores. Em uma série de importantes doenças neurodegenerativas, dyshomeostasis destes metais tem sido implicada tanto na patogênese da doença e identificados como novos alvos potenciais para intervenção terapêutica 1. Para entender melhor como os metais estão envolvidos em doenças como a doença de Alzheimer e de Parkinson (AD e PD, respectivamente), é imperativo para ser capaz de medir a distribuição de metal e os níveis de mudar dentro de regiões afetadas negativamente pelo processo de doença. Estas mudanças são muitas vezes indicativo de mudanças sutis nas reações bioquímicas que podem estar intimamente ligados aos processos que iniciam a morte celular, como o nosso mecanismo proposto recentemente de ferro e dopamina neurotoxicidade na DP 2.
Tradicionalmente, metaníveis l dentro das regiões anatômicas definidas foi conseguida através de excisão cuidado, a digestão e análise usando uma variedade de técnicas analíticas 3. No entanto, uma tal abordagem perde informação espacial, o que pode ser crítico quando estados de doença a ser investigada, envolvem regiões bem definidas pequenas ou tipos de células específicos. Um número de métodos analíticos estão disponíveis para a visualização de metais em sistemas biológicos, a partir de amostras de tecidos intactos para secções e em duas ou três dimensões, usando espectroscopia de emissão, sondas fluorescentes e espectrometria de massa 4. Cada técnica tem vantagens e desvantagens quanto à sensibilidade, selectividade das espécies químicas, e a resolução espacial que pode ser alcançado. Para uma visão abrangente da gama de técnicas disponíveis, consulte a revisão por Hare et al. 5.
Espectrometria de massa (MS) -based métodos são os mais sensíveis destas técnicas, Capaz de medir metais biologicamente mais relevantes a sua concentração nativa 6. A ablação por laser - plasma acoplado indutivamente - espectrometria de massa (LA-ICP-MS) imagiologia emprega um feixe de laser ultravioleta focada variando em tamanho desde 1 a> 100 um de diâmetro (ou largura, quando uma forma do feixe quadrilátero é utilizado), sob a qual o amostra é passada 7. A informação quantitativa pode ser obtida através da ablação representativa de materiais de referência padrão, que podem ser produzidos utilizando uma variedade de diferentes abordagens 8, cada um com diferentes graus de dificuldade técnica analítica e praticidade. A abordagem mais comum utiliza-matriz correspondente, onde um padrão com uma composição química predominante comparável à da amostra é preparada por cravação com o analito-alvo e com precisão para avaliar a homogeneidade e a concentração de metais absoluto por meio de análise independentes 9, 10. A ablação de padrões preparados pode, então, ser utilizado para fins de calibração externa, permitindo que os dados de concentração a partir da imagem resultante da amostra a ser extraído por pixel.
A resolução da imagem é determinada tanto pelo tamanho do feixe ea velocidade com que a amostra é digitalizada. O quadrupolo-design padrão ICP-MS (que representam mais de 90% de todos os sistemas ICP-MS instalados em todo o mundo 11) é um analisador de massa seqüencial, em que os ciclos de o detector de massa por toda relação massa-carga selecionado (m / z ) em vez de coleta de dados simultaneamente. Assim, o tempo de aquisição para cada ciclo de massas deve ser igual ao tempo necessário para a amostra a percorrer uma largura do feixe de laser para garantir um representante pixel da resolução desejada é adquirido 12. seleção de tamanho de feixe de laser é um parâmetro crucial que tem efeitos significativos sobre a sensibilidade e tempo de análise total. Como physi ablação por lasercamente remove material que é arrastado para o ICP-MS por um gás portador de árgon, a quantidade de matéria que pode ser fisicamente detectados pelo analisador de massa segue a lei inversa da raiz quadrada. Por exemplo, a redução do diâmetro do feixe de laser a partir de 50 - 25 um resulta numa redução de material sujeito a ablação por um factor de quatro. Além disso, como um método de digitalização, diâmetros de feixe menores aumentam o tempo total necessário para fazer a ablação de uma área seleccionada. Portanto, design experimental é essencial para equilibrar a resolução espacial necessária com as necessidades de sensibilidade e limitações de tempo.
Imagiologia por LA-ICP-MS foi aplicado a uma gama de amostras, as matrizes e estados de doença, incluindo modelos animais de desordens neurológicas 13, 14, lesão cerebral traumática 15, a distribuição, a exposição tóxico fármacos anticancerígenos 16 contendo metal na placenta 17 e de metal distribution em dentes como um biomarcador de transições alimentares do início da vida. 18 Neste protocolo, descrevem um método geral para a imagiologia de ferro, cobre e zinco no cérebro do rato WT a uma resolução de 30 um, embora possa ser facilmente adaptado para uma variedade de tipos de amostras e os resultados experimentais, com base nas necessidades do analista.
Protocol
Procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Howard Florey Animal e aderir aos padrões de cuidados com animais Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho.
1. Preparação da amostra para análise
NOTA: Este passo varia dependendo da matriz da amostra a ser analisada.
- preparação de amostras e corte
NOTA: fixação com paraformaldeído a 4% (PFA) e crioprotecção em 30% de sacarose em PBS a 0,1 M irá resultar em quantidades variáveis de lixiviação de metais a partir de tecido. Veja Hare et al 19 para obter detalhes específicos. Assegurar que todas as amostras foram submetidas a etapas de fixação e crioprotecção idênticos.- Transcardially perfundir o animal sacrificados com gelado M PBS, pH 7,4 a 0,1 (veja a seção Métodos em Dodt et al. 20 para mais detalhes) e remover o cérebro.
- Colocar o cérebro em PFA a 4% O / N para fixar o tecido. <li> Cryoprotect o cérebro, colocando-o em 30% de sacarose em PBS a 0,1 M durante 24 h, e, em seguida mudar para fresca de sacarose a 30% durante mais 24 h. 19
- Congelar o cérebro num criostato a -20 ° C durante pelo menos 1 h.
- Monte o cérebro em um mandril usando um meio de montagem adequado.
- Seção do cérebro em um criostato usando uma lâmina descartável isento de metal (por exemplo, politetrafluoretileno [PTFE] -Revestido facas) e monte numa lâmina de microscópio padrão. A espessura óptima para a secção devem ser de aproximadamente 30 um.
NOTA: efeitos precisos de fixação de longo prazo e parafina-incorporação de amostras biológicas não são conhecidos. Conforme descrito em 1.1, certifique-se todas as amostras foram submetidas a procedimentos de preparação de amostras idênticas se a análise comparativa se destina.
- dewax paamostras embebidas em Raffin, mergulhando a lâmina em 3 mudanças de xileno, 1 mudança cada um: 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol e um mínimo de 3 mudanças na norma ISO 3696 ou água purificada equivalente (em seguida, referido como ' água "; ver Hare et al 21 para um método detalhado)..
2. Preparação de Padrões de correspondência Matrix
NOTA: O seguinte é um protocolo resumido publicado anteriormente 9. Por favor, consultar o documento original para obter as etapas detalhadas para a preparação de padrões de tecido combinado de matriz.
- Obter cérebros cordeiro comerciais (ou similar) e enxaguar em água, removendo todo o sangue e do tecido conjuntivo.
- Usando um bisturi, dissecar cuidadosamente cerca de 50 g de tissu corticale e parcialmente homogeneizar utilizando um homogeneizador de tecidos à mão com uma sonda descartável de policarbonato em baixa potência. Divida em alíquotas de 5 g, com o número dependendo da faixa de calibração e número de pontos de calibração desejados.
- Preparar soluções de metais para cravar cada padrão através da dissolução de um sal solúvel de cada analito (por exemplo, FeSO4 · H2O) em 1% de ácido nítrico para produzir 0,1, 1 e 100 mg mL -1 de metal existências.
- Adicionar um volume pré-calculado da solução de estoque a 5 g de tecido a alíquota (por exemplo, 5 mL de 10 mg mL -1 para uma concentração final de aproximadamente 10 ug -1 g de tecido húmido) para atingir uma gama de níveis de metal cravado em cada padrão.
- Dependendo da concentração final desejada de cada padrão, usar uma combinação de cada solução de estoque de metal para garantir a quantidade mínima de soluções são adicionadas ao padrão. Adicionar um ponto final de água para cada padrão para garantir equios volumes de líquido adicionados valência está presente em cada padrão.
- Homogeneizar os padrões cravado em baixa potência durante aproximadamente 30 s. Se não ser utilizada imediatamente, manter congelados a -20 ° C em tubos de polipropileno tapados seladas com parafilme.
- Determinar a concentração exacta e a homogeneidade de cada padrão, utilizando qualquer um dos seguintes procedimentos:
- digestão por microondas
- Coloque 6 (aproximadamente 50 mg) aliquotas pesada com precisão de um padrão num vaso de digestão de PTFE e lavou-se adicionar 4 mL de concentrado (65%) de ácido nítrico e 1 ml de peróxido de hidrogénio a 30%. Selar e digerir a 500 W durante 30 minutos.
- Após arrefecimento do vaso de digestão, aberta numa hotte e transferir quantitativamente a solução para um tubo digerido lavado com ácido 50 mL utilizando 10 mL de alíquotas de água. Adicione cerca de 50 mL, pesam-se exactamente e a massa da solução final.
- Repita os passos 2.5.1.1 - 2.5.1.2 para cada padrão.
- Use o procedimento a seguir se o equipamento de digestão por microondas não está disponível:
- Coloque seis (entre 25-200 mg) medidos com precisão alíquotas de padrão em tubo de ácido-lavado / metal-free polipropileno e liofilizar O / N.
- Adicionar 40 mL de ácido nítrico concentrado e de calor, não nivelado, sobre um bloco de aquecimento a 70 ° C durante 5 min, e em seguida adicionam-se 10 mL de peróxido de hidrogénio a 30%. Aquecer durante mais 5 min, e em seguida, fazer com precisão para um volume total de 950 mL utilizando mL de ácido nítrico a 1%.
NOTA: É aconselhável digerir um material de referência certificado usando o método de escolha para assegurar procedimentos de digestão são precisos.
- digestão por microondas
- Determinar a concentração de metal em cada solução para a análise de uma solução de nebulização ICP-MS utilizando um protocolo padrão. Avaliar a homogeneidade de cada padrão, determinando o desvio padrão relativo (RSD%) entre cada alíquota. Certifique-% RSDs todos caem dentro dos 15%. Usando a massa medida da EAch alíquota, calcular a concentração de metal precisa de cada padrão de tecido homogeneizado.
- Voltando ao padrão de tecido homogeneizado, embalar um 5 x 5 mm plástico descartável molde histologia e congelar em pentano iso resfriado em nitrogênio líquido. Remover o bloco de tecido padrão congelado do molde e a secção em um criostato com a mesma espessura como a amostra.
Nota: É aconselhável preparar um número de seções em diferentes espessuras para experiências futuras. normas secas ao ar podem ser armazenados indefinidamente em um recipiente hermético e livre de poeira.
3. Preparação de LA-ICP-MS para análise
- Coloque padrões e amostras na câmara de ablação, garantindo que se encontram dentro da profundidade de campo da câmara CCD montada na unidade de LA. Se afinação do instrumento é necessário, incluir um material de referência adequados (por exemplo, NIST 612 Trace Elements in Glass). Finger-aperte os dois parafusos na porta da câmara para selar thcâmara de ablação e.
- No software ICP-MS, selecione abrir a válvula de gás argônio no 'Manutenção' ou o painel semelhante e definir o fluxo de gás portador a 1,2 L min -1 na caixa de diálogo apropriada.
NOTA: Neste protocolo de árgon é utilizado como gás de transporte. Vários exemplos usam quer o hélio ou uma mistura de hélio e árgon como gás de transporte. Veja Günther e Heinrich 22 para detalhes técnicos para a utilização de misturas de hélio e argônio como gases de arraste aerossol. - No software LA, clique no botão "purga" para liberar a célula com gás argônio para um mínimo de 30 min.
NOTA: O tempo de purga pode ser alterado, clicando em um "tempo de purga" ou o botão similar. Quando se utiliza um sistema de ablação com uma célula de ablação de dois volumes, mover periodicamente a fase para cada canto diagonalmente e atravessar a célula para garantir o máximo de ar residual é removido a partir da célula quanto possível. Isto pode ser conseguido escolhendo as "fases de origem dos ou equivfunção alent. - Ligue o ICP-MS, clicando em 'plasma on' e deixe aquecer por duas horas, durante as quais os passos 3,5-4,4 pode ser realizada. As definições do aparelho variar entre os fabricantes, embora um exemplo de condições de funcionamento LA-ICP-MS adequados podem ser encontrados em Hare et al. 10.
- ablação de tecidos representativas de padrões
- Selecione a ferramenta de linha e desenhar uma única linha de ablação de aproximadamente 3 mm de comprimento em toda a superfície do tecido.
- Defina os parâmetros da seguinte forma clicando com o botão direito na linha de ablação na lista de experiências e mudar o seguinte: diâmetro do feixe (escolhidas de forma adequada pelo usuário; um feixe quadrado 30 mm é usado aqui), velocidade de digitalização (4 vezes o diâmetro do feixe por segundo; 120 mm s -1) e de fluência de energia (0,3 -0,5 J cm -2 para tecidos moles; otimizar se necessário para matrizes mais difíceis). Em 30 mm espessura do tecido do feixe de laser não penetra no thic completakness deste tecido, eliminando qualquer contaminante potencial do suporte microscópio. Normalizando o carbono 23 pode ser utilizado para corrigir a variação na quantidade de tecido removido. Defina estes parâmetros como padrão para cada linha subseqüente, selecionando o botão de opção 'default'.
- Duplicar esta linha de seis vezes, selecionando a linha inicial, clique com o botão direito e selecionando 'scans' duplicados. Certifique-se de linhas são compensados tanto no x - ou eixo y pelo diâmetro do feixe. Isto dá um total de sete linhas por padrão, espaçados entre si de acordo com o diâmetro do feixe.
- Repita os passos 3.5.1 - 3.5.3 para cada padrão, assegurando a linha de comprimento idêntico.
- Para desenhar área de ablação em relação à amostra, siga um dos dois métodos a seguir:
NOTA: Certifique-se os mesmos parâmetros de digitalização (diâmetro do feixe, velocidade de digitalização, fluência de energia) são utilizados para linhas de amostra.- Se o sistema de LA está equipado com umwide-campo de visão, selecione a ferramenta de linha e desenhar uma linha a partir do canto superior esquerdo da amostra suficiente para cobrir a amostra no seu ponto mais largo usando os mesmos parâmetros do laser descritas em 3,5. Duplicar essa verificação conforme descrito em 3.5.3 com linhas espaçadas de acordo com o diâmetro do feixe tantas vezes quantas as necessárias para assegurar a cobertura completa da amostra.
- Se uma visão ampla campo não está disponível, determinar e registrar as coordenadas x e y (tipicamente mostrado na tela principal como 'posição de estágio "ou similar) correspondente aos cantos de um retângulo cobrindo toda a amostra. Usar estas coordenadas de posição das linhas paralelas de ablação que cobrem a área inteira da amostra, tal como descrito em 3.7.1.
- Desenhar linhas de varrimento para intermitente de padrões, o mais tardar depois de ~ 20 h de digitalizar a amostra através da repetição do processo descrito em 3.5. Dependendo da duração da verificação da amostra esta pode ser necessárias múltiplas vezes. Termine a experiência com um addivarredura cional das normas.
NOTA: Para a determinação das coordenadas x e y enquanto a célula está a ser purgado, a seleção de posições de origem ea calibragem associada do eixo vai mudar o previamente adquiridos específicos para as coordenadas X e y enquanto que a diferença (ou seja, o comprimento da linha) vai será afetada.
4. Configurando métodos de aquisição de dados para o ICP-MS
- Para a linha de padrão de ablação, dividir o comprimento da linha com a velocidade de leitura laser para determinar o tempo total de análise de uma única linha. Repita este procedimento para a linha de amostra.
- No software ICP-MS, criar um novo método (mostrado aqui como um 'lote') e garantir que 'resolvida no tempo de análise »ou equivalente é seleccionado. Selecione os valores m / z para ser detectado, e em seguida, ajuste o tempo de integração para cada m / z de modo que o tempo de integração total para um ciclo é igual a 0,25 s. Clique em "Salvar Batch Como 'e o nome em conformidade (por exemplo, Std1).
NOTA: Como a amostra irá atravessar o feixe laser a quatro vezes o diâmetro do feixe, o que garante um ponto de dados para cada massa é gravado equivalente ao diâmetro do feixe 12. Por exemplo, usando um tamanho de 100 mm local, uma velocidade de digitalização de 400 mm s -1 com um tempo de integração de 0,25 s irá produzir imagens com tamanhos verdadeiros pixels. O tempo de integração pode ser modificada para melhorar a sensibilidade; quando se aumenta o tempo de integração para 0,33 s velocidade de varrimento deve ser retardado de três vezes o diâmetro do feixe. - Para os padrões, digite o tempo de análise para cada varredura de linha na caixa apropriada, mais um adicional de 15 s para explicar a laser warm-up e os tempos de washout. Digite uma lista de exemplos de execução (ou seja, a ordem em que as varreduras são executados) com o mesmo número de aquisições (normalmente numeradas sequencialmente, ou seja, 001, 002, etc.) como o número total de linhas padrão.
- Para a amostra, Duplicar o método utilizado para os padrões salvando o método atual ou lote com um nome de arquivo alternativo, e ajustar o tempo total de aquisição (incluindo os adicionais 15 s) e número total de aquisições para coincidir com o número de linhas que irão ablação da amostra .
NOTA: Como a maioria dos sistemas de LA-ICP-MS usar um gatilho de uma via (LA desencadeia ICP-MS), é essencial que o software ICP-MS está aguardando o gatilho do LA antes da linha de ablação subsequente começa. A janela de aquisição ICP-MS vai ler 'à espera de start'.
5. A execução do Experimento
- Inicie a fila de ICP-MS, adicionando o primeiro método, ou em lotes para a fila e garantir que o software está aguardando o gatilho do sistema de LA.
- No software LA, permitir o fornecimento de energia do laser, clicando em "Emissão", clique em "Executar" e definir o tempo de aquecimento a laser para 10 s e o tempo de lavagem para 20 s nas caixas apropriadas.
Nota: Tal superação seriagarantir a ICP-MS está pronto para começar a aquisição de novos dados quando o laser começa cada linha subseqüente de ablação. - Iniciar a sequência de laser, clicando em 'start'. Se estiver usando uma célula de dois volumes, garantir a copo de amostra está na posição.
6. Cálculo de quantificação Standards
NOTA: Existem várias variações para converter dados ICP-MS em imagens. Estes incluem o uso de ferramentas de software de fabricação caseira escritos em linguagens de código aberto 17, 24, 25, macros comerciais 26 e dados software de análise. 7 Aqui, utilizar o plug-in recentemente desenvolvido um software (descrito em Paul et al., 27), com base em um especializado LA-ICP-MS conjunto de análise de dados 28.
- Transferir todas as pastas em lotes contendo os dados de execução (001.d, 002.d, etc.) Para umcomputador separado com o software de análise de instalado. Extraia os arquivos de dados * .csv para cada linha do lote em uma pasta separada.
NOTA: Usando um script para transferir automaticamente os arquivos * .csv para uma nova pasta é altamente recomendado. Ver código Python em anexo para obter mais detalhes. Este script foi escrito para atender tanto um Agilent 7700 ou 8800 Series ICP-MS, mas pode ser editado de acordo com o arquivo de outros fabricantes de saída. - Abra a plataforma de software e seguir o sequencialmente guias para importar e analisar os padrões para produzir imagens quantitativos conforme descrito abaixo.
- Para importar os dados do primeiro lote padrão, selecione 'Agilent .csv "para" Tipo de Arquivo "," pasta inteira' para 'tipo de importação' e verifique se o 'Formato da data' é idêntico ao formato de computador. Clique em 'Importar', selecione a pasta que contém o arquivo .csv-arquivos para o primeiro conjunto de normas, e mover-se para o separador 'linhas de base'.
- linha de basesubtração
- Use a guia "Seleções automáticas '(comando 2) a partir do menu principal do aplicativo na barra de ferramentas, selecione' Informações de importação 'e clique em" Continuar ".
- Clique em "Selecionar Tudo" e selecione "Baseline_1 'para a integração.
- Para selecionar os primeiros 10 segundos de cada linha de varredura (correspondente ao laser tempo de aquecimento), cortar os dados entrando segunda valores '0' e '(duração da linha - 10 s) "e clique em" Adicionar integrações' (por exemplo, , para um 35 s linha de digitalização, digite '0' e '25' valores).
- Para selecionar os dados de exemplo, utilize o separador 'Seleções automáticas' como descrito em 6.4, mas escolher "OUTPUT_1 'como a integração. Informação de safra desde o início e fim de cada linha padrão para excluir o sinal de fundo (por exemplo, a 35 s linha de digitalização, digite os valores '13' e '4').
- Para excluir gotas no sinal causada por possifuros ble das normas, no separador 'Amostras', clique em "canais" no canto superior esquerdo da área do gráfico para seleccionar um canal com um sinal de alta-ruído (por exemplo, C13 ou P31). Tome nota de quaisquer quedas acentuadas no sinal e selecione um valor CPS baixo o suficiente para que esteja abaixo da variação normal dentro das amostras, mas alto o suficiente para escolher as quedas acentuadas no sinal.
- Clique na guia 'DRS' e selecione 'Baseline_Subtract »para o« Plano de Redução de dados atual ". Escolha o canal de 6,6 por 'Channel Index' eo valor CPS para "Threshold para usar quando mascarar sinais de baixa '. Insira um valor <0,5 s para "Segundos para aparar antes / depois baixos sinais" para explicar o atraso na transferência de sinal do laser para o ICP-MS.
- Para confirmar máscara adequada das áreas de sinal fraco, clique novamente para o separador 'Amostras' e selecione um traço de canal processados (por exemplo., Fe56_CPS). Repetir e refinar a CPS e & #39; Segundos para aparar antes / depois baixos valores de "sinais como em 6,7 se necessário.
- Clique na guia "resultados" e escolha "Exportar dados" no menu suspenso aplicação principal. Digite um nome de arquivo para gerar um arquivo de dados de folha de cálculo dos resultados (por exemplo, cálculos Std1, STD2 ...).
- Abra o arquivo de dados em um programa de planilha adequada e calcular os valores do CPS para cada canal individual a ser quantificado. Use as concentrações de metal pré-determinados a partir da solução de nebulização ICP-MS para calcular o factor de conversão a partir do CPS valores em ppm (mg g -1) para cada elemento quantificável.
- Repita os passos 6,3-6,10 para todos os conjuntos de normas no prazo.
7. Construção de Imagens Quantitativos
- Escrever 'BioLite ()' no prompt de comando para abrir o software.
- Importe os dados de exemplo clicando em "Carregar Imagens 'e selecionando a pasta que contém o arquivo .csv-arquivos for a imagem da amostra.
- correcção de fundo
- Clique na guia 'As linhas de base' para aplicar uma correcção de fundo para a amostra. No fósforo imagem (P31) solicitado na tela, selecione as áreas do fundo usando a ferramenta retângulo empate. Selecionando tantas regiões possível cria um mapa de toda a imagem do sinal de desvio / plasma para assegurar uma compensação adequada desses fatores de confusão.
- Para fazer com que o sinal de fundo mais visível, selecione a ferramenta de gráfico de edição (canto superior esquerdo da imagem exibida) e clique o botão direito na imagem. Seleccione 'Modificar Aparência Imagem' e mudar o 'First cores em Z =' a um grande valor negativo (por exemplo, -100.000). Continuar clicando em "Done".
- Clique na guia 'Standards' para abrir uma mesa para fatores de correção CPS / ppm. Entre os valores calculados a partir dos padrões no passo 6.10 para cada um dos elementos. Este passo irá ajudar a corrigir o desvio de sensibilidade no ICP-MS. Clique 'Go! '
- Abrir 'Browser de Dados ", na guia" Dados ", que contém as imagens para cada elemento e cada passo.
- Para finalizar uma imagem para exportação, selecione a imagem desejada na pasta 'StdCorrImages', clique com o botão direito no nome da imagem (* _ppm) e clique em 'newImage'. Botão direito do mouse na imagem para abrir 'Modificar a aparência da imagem' para escolher uma escala tabela de cores e cor desejada. Adicionar uma escala de cores à imagem clicando com o botão direito na imagem e seleccionando 'Adicionar Anotação'. Selecione 'ColorScale' a partir do menu superior esquerdo e use as guias para modificar a escala de cor desejada.
- Para exportar uma imagem, certifique-se de que a imagem em questão é selecionada e navegue até a guia "Arquivo" e clique em "Salvar gráficos ... '. Selecione o formato desejado e guardar a imagem. Alternativamente, a imagem selecionada pode ser transferido usando as ferramentas de copiar e colar.
- Repita os passos 7,6 e 7,7 para todas as imagens de interesse.
- QuantifYing regiões discretas
- Para ativar as ferramentas de ROI, navegue até 'Análise' guia, "pacotes" e selecione "Processamento de Imagem".
- Selecione a imagem desejada e navegue para o separador 'Imagem' e clicar 'ROI ...'. Clique em "Iniciar ROI empate 'e usar uma ferramenta de desenho para selecionar uma região de interesse na amostra. Para finalizar o desenho, clique em "Concluir ROI".
- Para adquirir as estatísticas para o ROI selecionada, navegue até separador 'Imagem' e clicar em 'Stats ...'.
- Copiar e colar os resultados para uma planilha separada. selecção Repita ROI (7.9.2) para todas as regiões e elementos de interesse.
Representative Results
Para demonstrar as capacidades desta abordagem de imagem LA-ICP-MS, um experimento simples com uma única seção de um / 6 cérebro do rato WT C57BL, dividido em corpo caloso e seccionados no plano coronal, é apresentado. Um fluxo de trabalho para a análise de dados usando BioLite (Figura 1), tal como descrito nas Secções 6 e 7, bem como para fornecer uma imagem representativa da distribuição do metal na secção de analisado (Figura 2) é também descrita.
Como pode ser visto, a distribuição de metal no cérebro do rato é variável de acordo com a região anatómica. Isto pode ser atribuído aos metais papéis variáveis, e mais especificamente as proteínas a que ambos se ligam, desempenham em cada região do cérebro 27. Por exemplo, ferro tende a ter concentrações mais elevadas no mesencéfalo e ao longo do giro dentado, enquanto que o zinco é o mais abundante no Cortiáreas cal. Carbono, que é um padrão interno utilizada 8, está distribuída de forma homogénea. Mapas elementar (Figura 2) pode ser particularmente útil quando usado em conjunto com o atlas anatómicos e funcionais existentes de Referência 29, em que a informação sobre a co-localização de metais pode a expressão de proteínas específicas de ligação a metais pode fornecer informações sobre a função de metais dentro de um cérebro região ou mudanças nos níveis de metal em linha com uma biomolécula relacionada com a doença identificada. Utilizando a abordagem descrita, que é optimizado para uma gama mais ampla de analitos, se opõe a sensibilidade para os elementos de baixa abundância, tais como o manganês, e métodos podem ser adaptados a centrar-se essencialmente sobre este analito, aumentando os tempos de retenção em detrimento de outras massas medidas.
A principal vantagem na utilização de imagens por LA-ICP-MS está observando diferenças relativas de concentr de metalção e distribuição entre os grupos experimentais. Temos anteriormente utilizada uma tal técnica a demonstrar o aumento de ferro na sequência de um insulto neurotoxina imitando PD 2, 10, e as alterações dos níveis de ferro no tecido cortical da doença de Alzheimer humana 21. um protocolo tal como descrito aqui pode ser facilmente adaptado a qualquer outro tipo de tecido com alterações mínimas para os métodos listados.
Figura 1: Fluxo de trabalho para processamento de imagens. Fluxo de trabalho complementar com as Secções 6 e 7, que descrevem a conversão de dados em tempo-prima resolvidos a partir do ICP-MS para imagens quantitativas de distribuição de metal no cérebro do rato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 2: Distribuição elementar típica de Biometals dentro de um mouse cérebro. mapas de elementos representativos de uma secção coronal 30 mm de espessura de um único hemisfério cerebral do rato analisados com LA-ICP-MS. Imagens para carbono-13 (C13), magnésio-24 (MG24) e fósforo-31 (P31) exibidos em escalas de ouro de cor (contagens por segundo; CPS) (linha superior). Imagens quantitativos (linha inferior) para o manganês-55 (Mn55), cobre-63 (Cu63), ferro-56 (Fe56) e zinco-66 (Zn66) exibido com correspondentes escalas de cores BlueHot (mg g -1). O tempo total de análise para a secção de cérebro foi de aproximadamente 5 horas. Barra de escala = 2 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
metais de imagem em tecido neurológico é apenas um exemplo de como este protocolo pode fornecer informações úteis sobre a distribuição e quantidades de metais em qualquer matriz biológica. Embora a preparação dos materiais de referência padrão pode ser árdua, que é uma experiência que pode ser realizada uma vez e arquivadas para uso posterior.
LA-ICP-MS tem certas vantagens sobre os métodos alternativos, como a microscopia de fluorescência de raios-X com base em síncrotron, principalmente em termos de acessibilidade e sensibilidade. No entanto, existem algumas desvantagens que devem ser considerados na preparação de um experimento usando LA-ICP-MS, e como tal, é muitas vezes uma técnica útil para complementar imagem química que inclui técnicas de análise de metais alternativos, bem como histoquímica comparativo 5.
Alinhamento com características anatômicas conhecidas do cérebro do rato pode fornecer informações úteis sobre a possível relati funcionalonship entre os níveis de metal e distribuição espacial. Anteriormente, temos usado o recurso online Allen Brain Atlas, 29, que é um repositório de acesso aberto de ambos os dados de expressão anatómicas e genéticas no cérebro do rato C57BL / 6 para examinar a correlação espacial de ambos dependentes de metais expressão da enzima 14 e neuroanatomia 27, 30. Outros recursos, como o WorkBench Rodent Cérebro 31 também estão disponíveis para ajudar com o registo e alinhamento de imagens de metal para ajudar na identificação correta de distribuição de metal em muitas vezes pequenas regiões anatômicas.
Aplicações desta técnica são úteis para avaliar os níveis de metal e como a mudança de distribuição em microescala longo de ambos os eventos de vida normais (por exemplo, envelhecimento) e em estados de doença; assim como o estudo dos efeitos de ambos os compostos e medicamentos contendo metal destinadas a me alvometabolismo tal. Os atuais principais limitações da LA-ICP-MS como uma técnica de imagem para avaliar espacialmente a distribuição de metal são rendimento e sensibilidade. Há uma troca entre a velocidade de análise e resolução espacial 5, 12, com imagens de resolução mais alta que exigem tempos de análise mais longos. A técnica é bem adequado para elementos biológicos em concentrações mais elevadas, apesar de elementos, tais como manganês, cobalto e selénio são restritas devido à sua baixa abundância em tecidos normais e / ou limitações na detecção por ICP-MS convencional. Os novos avanços na tecnologia de ICP-MS, tal como a introdução de analisadores de massa triplo quadrupolo-, para permitir a detecção de analitos alvo de difíceis, tais como o selênio 32 com sensibilidades superiores 33. Como procedimento impulsionada pela tecnologia, os avanços em ambos laser e design de espectrometria de massa vai ver isso imaging técnica continuam a evoluir, aumentandoa velocidade de análise e sensibilidade 34.
Acknowledgments
DJH e PAD são suportados por um projeto Australian Research Council Linkage (LP120200081) com a Agilent Technologies e ESI Ltd. A contribuição de BK foi apoiado pela Research Escola PLUS Universidade Ruhr, financiado pela Iniciativa de Excelência da Alemanha [DFG GSC 98/3]. DJH foi parcialmente financiado pela Fundação Ramaciotti. KK é suportado pelo Juselius Fundação Sigrid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soda glass microscope slides | n/a | n/a | Typical slides are suitable for all experiments |
| PTFE-coated microtome blades | C.L. Stuckey | DT315R50 | Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering. |
| Parafomaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | Any supplier suitable |
| Sucrose | n/a | n/a | Commercial grade white sugar is suitable |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5368 | Premixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 247624 | Any supplier suitable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Any supplier suitable |
| Lamb brain | n/a | n/a | Available from most local butchers |
| Metal salts | n/a | n/a | Use water soluble metal salts containing desired analytes |
| Omni TH Tissue Homogeniser | Omni Inc | THP115 | Alternative homogenizers are suitable |
| Polycarbonate homgenizer probes | Omni Inc | TH115-PCRH | |
| Microwave digestion unit | n/a | n/a | Optional. See Section 2 |
| 1.5 mL microfuge tubes | TechnoPlas | P4010 | Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable |
| 65% nitric acid | Merk Millipore | 100441 | Trace analysis grade |
| 30% hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 95321 | Trace analysis grade |
| 10 x 10 mm disposable cryomolds | Ted Pella | 27181 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 76871 | |
| Liquid nitrogen | n/a | n/a | Use local supplier |
| NWR213 Laser Ablation system | ESI Ltd | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Agilent 8800 Series ICP-MS | Agilent Technologies | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Iolite | Iolite Software | n/a | Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol |
| Excel | Microsoft | n/a | |
| IGOR Pro | Wave Metrics | n/a | Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm |
References
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