Summary
定量的にレーザアブレーションによって組織に金属をマッピングする - 誘導結合プラズマ - 質量分析法（LA-ICP-MS）は、金属が正常な機能と疾患過程に関与どのように新たな洞察を提供することができます敏感な分析技術です。ここでは、定量的にマウス神経組織の薄い部分に金属を画像化するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
金属は、特定の解剖学的領域内でそれらの化学的反応性と豊かさの両方によって決定されるそれらの生物学的役割で、生物全体に遍在発見されました。脳内では、金属は、それらは、中枢神経系内で再生主要な機能に応じて、高度に区画分布を有します。金属の空間分布を画像化することは、金属依存性プロセスに関する神経解剖学的領域およびそれらの既知の機能との間の直接的な相関関係をできるように、脳の生化学的なアーキテクチャにユニークな洞察を提供しています。さらに、いくつかの加齢に関連する神経障害は、多くの場合、そうでなければ分析することが困難である脳の小領域に限定された金属恒常性を破壊する機能します。ここでは、レーザアブレーションを使用して、定量的にマウス脳中の金属を画像化するための包括的な方法を説明する - 誘導結合プラズマ - 質量分析法（LA-ICP-MS）および特別に設計された画像処理ソフトウェア。脳内の最も豊富なと疾患関連の金属の3があり、鉄、銅、亜鉛、に焦点を当て、我々は低マイクロメーター内の金属分布のマップを生成するためのサンプル調製、分析、定量的測定および画像処理における基本的な手順を説明し解像度範囲。任意の切断組織切片に適用するこの技術は、臓器またはシステム内の金属の非常に可変分布を示すことが可能であり、微細な解剖学的構造内の金属恒常性と絶対的なレベルの変化を同定することができます。
Introduction
金属の固有の酸化還元化学は、シグナル伝達、エネルギー産生および神経伝達物質の合成を含む神経学的機能の範囲を容易にします。主要な神経変性疾患の数では、これらの金属のdyshomeostasisは、両方の疾患の病因に関与していると治療的介入の1のための潜在的な新規な標的として同定します。優れた金属は、アルツハイマー病やパーキンソン病（ADおよびPD、それぞれ）のような状態に関与しているかを理解するためには、金属分布とレベルに悪影響病気のプロセスによって影響を受ける領域内にどのように変化するかを測定できることが不可欠です。これらの変更は、多くの場合、密接に、このようなPD 2中の鉄及びドーパミン神経毒性の我々の最近提案されたメカニズムとして、細胞死を開始するプロセスにリンクすることができる生化学反応の微妙なシフトを示しています。
伝統的に、メタ定義された解剖学的領域内リットルレベルは、分析技術3の範囲を使用して慎重に切除、消化および分析によって達成されています。しかしながら、このようなアプローチが検討されている疾患状態が小さく、明確に定義された領域または特定の細胞型を含むときに重要であることができる、空間的な情報を失います。分析方法の数は、発光分光法、蛍光プローブ及び質量分析法4を用いて、無傷の試料からの組織切片を二三次元で、生体系中の金属の可視化のために利用可能です。それぞれの技術は、感度、化学種の選択性、および達成することができる空間分解能に関して利点と欠点を有します。利用可能な技術の範囲の包括的な概要については、ノウサギらによるレビューを参照してください。 5。
質量分析（MS）は、方法は、これらの技術の中で最も敏感であるベース母国濃度6で最も生物学的に関連性の高い金属を測定することができます。レーザーアブレーション - 誘導結合プラズマ - （四辺形のビーム形状が使用される場合、または幅）質量分析（LA-ICP-MS）イメージングは1から径>100μmのサイズ範囲の集束紫外線レーザビームを用い、その下サンプルは7を渡されます。定量的情報は、異なる様々な使用して製造することができる標準物質の代表的な切除によって達成することができ、技術的な困難および分析実用性の様々な程度でそれぞれ8に近づきます。最も一般的なアプローチは、サンプルに匹敵する主要な化学構造を持つ標準は、標的分析物でスパイクすることによって調製され、正確に独立した分析手段9により均質性と絶対的な金属濃度のために評価されるマトリックスマッチングを使用しています10。調製された標準の切除は、次いで、得られた試料の画像からの濃度データは、画素ごとに抽出することを可能にする、外部較正の目的のために使用することができます。
画像解像度は、ビームサイズとサンプルが走査される速度の両方によって決定されます。標準的な四重極設計ICP-MS（11世界中でインストールされているすべてのICP-MSシステムの90％以上を占める）シーケンシャル質量分析器で、質量検出器サイクルという点で、選択したすべての質量電荷比（m / zまで）ではなく、同時にデータを収集するよりも。このように、大衆の各サイクルの取得時間は、所望の解像度のピクセル代表は12を取得されていることを確認するために、レーザビームの1幅を横断するサンプルに要する時間と同等でなければなりません。レーザビームサイズの選択は、感度、総分析時間の両方に有意な効果を有する重要なパラメータです。レーザーアブレーションphysiとして、的にアルゴンキャリアガスによりICP-MSに掃引される材料、物理的に質量分析によって検出することができる物質の量を除去することは、逆二乗則に従います。 4倍にアブレーションされた材料の低減さ25μmの結果 - 例えば、50からのレーザビームの直径を減少させます。また、走査方法として、より小さいビーム径は、選択された領域を除去するのに必要な合計時間を増加させます。そのため、実験計画は、感度のニーズや時間の制約で必要な空間分解能のバランスをとることが不可欠です。
LA-ICP-MSによるイメージングは、神経障害13、14、外傷性脳損傷15、胎盤中の金属含有抗癌剤16、毒物暴露の分布の動物モデルを含む、サンプルマトリックスおよび疾患状態の範囲に適用されています17と金属競合製品早期の生活、食事遷移のバイオマーカーとしての歯でibution。それは簡単のニーズに基づいて、試料の種類および実験結果の範囲に適合させることができるが、我々は、30マイクロメートルの解像度でWTマウス脳中の鉄、銅および亜鉛を画像化するための一般的な方法を説明する。このプロトコルでは18アナリスト。
Protocol
本明細書に記載される手順は、ハワード・フローリー動物倫理委員会によって承認され、動物のケアの国民健康と医学研究審議会の基準に準拠してきました。
分析のための試料の調製
注：このステップは、分析される試料マトリックスに依存して変化します。
- 試料調製及び切片
注：固定は、0.1M PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）、30％スクロース中で凍結保護を使用して組織からの金属の浸出の量を変化させることになります。具体的な詳細については、ノウサギら 19を参照してください。全てのサンプルが同一の固定及び凍結保護の工程を経ていることを確認します。- 経氷冷0.1 M PBS、pH7.4で安楽死させた動物を潅流（Dodt らのメソッドを参照してください。詳細については、20）と脳を削除します。
- 組織を固定するために、4％PFA O / Nで脳を置きます。 <LI> Cryoprotectさらに24時間、新鮮な30％スクロースに変更その後24時間、0.1M PBS中30％スクロース中に置き、そしてによる脳。 19
- 少なくとも1時間、-20℃でクライオスタットで脳を凍結します。
- 適切なマウンティング培地を用いて、チャック上に脳をマウントします。
- メタルフリー替刃（ 例えば、ポリテトラフルオロエチレン〔PTFE]はナイフをコーティングを採用）を使用して、クライオスタットのセクション脳を標準顕微鏡スライド上にマウントします。セクションのための最適な厚さは約30μmであるべきです。
注：長期固定と生物学的サンプルのパラフィン包埋の正確な効果は知られていません。 1.1で説明したように、比較分析が意図されている場合は、全てのサンプルが同一のサンプル調製手順を受けていることを確認します。
- 脱ワックスPAキシレンの3回交換でスライドを浸漬することによりラフィン包埋試料は、1変化各々100％エタノール、95％エタノール、70％エタノール及びISO 3696 3変化の最小値または同等の精製水（以下、 'と呼ばれます水';ノウサギら詳細な方法のための21）を参照してください。
マトリックスマッチ標準の調製
注：以下は、以前に9を公開要約するプロトコルです。マトリックスマッチした組織の標準を調製するための詳細な手順については、元の論文を参照してください。
- 商業子羊の脳（または類似）を入手し、すべての血液や結合組織を除去し、水で洗い流してください。
- メスを使用して、慎重に皮質TISSUの約50グラムを分析e及び部分的には、低電力のポリカーボネート使い捨てプローブと手持ち式組織ホモジナイザーを用いて均質化します。較正範囲と所望の較正点の数に応じて番号を、5gのアリコートに分けます。
- 0.1、1および100mgの金属ミリリットルを生成するために1％硝酸で（H 2 O・例えば、のFeSO 4）の各分析物の可溶性塩を溶解することにより、各標準をスパイクするために金属の溶液を調製-1銘柄。
- でスパイクされた金属レベルの範囲を達成するために（10μgのグラム-1ウェットティッシュのおおよその最終濃度のために例えば、5μLの10mg mLの-1）5グラム等分組織に原液の事前計算されたボリュームを追加します。各標準。
- 各標準の所望の最終濃度に応じて、標準的に添加される溶液の最小量を確保するために、それぞれの金属ストック溶液の組み合わせを使用。エクイを確保するために、各標準への水の最終的なスパイクを追加します。価を加えた液体の体積は、それぞれの規格に存在します。
- 約30秒のための低消費電力にスパイクされた基準を均質化します。直ちに使用しない場合は、パラフィルムで密封蓋をポリプロピレンチューブに-20℃で凍結しておきます。
- 次の手順のいずれかを使用して各標準の正確な濃度および均一性を決定します。
- マイクロ波分解
- 洗浄PTFE消化槽内の標準の6正確に秤量した（約50 mg）のアリコートを配置し、濃縮し、4mLの（65％）硝酸および30％過酸化水素の1ミリリットルを加えます。密封し、30分間500 Wで消化。
- 消化槽を冷却した後、ヒュームフードでオープンかつ定量的に水10mLのアリコートを使用して酸洗浄を50mLチューブに消化されたソリューションを転送します。約50 mLに確認し、かつ正確に最終溶液の質量を量ります。
- 各標準のための2.5.1.2 - を繰り返して、2.5.1.1を繰り返します。
- マイクロ波分解装置が使用できない場合は、次の手順を使用します。
- 酸洗浄/メタルフリーポリプロピレンチューブ及び凍結乾燥のO / Nに標準の一定分量 - 6正確に測定（200 mgの25の間）を配置します。
- 5分間70℃に加熱ブロックに、濃硝酸や熱、キャップなしの40μLを追加し、30％過酸化水素の10μLを加えます。さらに5分間加熱し、そしてその後、正確には、1％硝酸の950μLを使用して、1 mLの総容量になります。
注：これは、消化手順が正確であることを確認するために選択の方法を使用して、認証標準物質を消化することをお勧めします。
- マイクロ波分解
- 標準プロトコルを用いて、溶液の噴霧ICP-MSによる各ダイジェスト溶液中の金属濃度を決定します。各アリコート間の相対標準偏差（％RSD）を決定することにより、各標準の均質性を評価します。 ％RSDは15％内のすべての落下を確認してください。 EAの測定された質量を用いて、chのアリコートは、各ホモジナイズした組織の標準の正確な金属濃度を算出します。
- ホモジナイズした組織の標準に戻って、5×5ミリメートルのプラスチックの使い捨て組織学の金型をパックし、 イソペンタンで凍結し、液体窒素で冷却しました。 サンプルと同じ厚さでクライオスタットにカビやセクションから凍結し、標準的な組織ブロックを削除します。
注：将来の実験のために様々な厚さでセクションの数を用意することをお勧めします。空気乾燥基準は気密及び無塵容器内に無期限に保存することができます。
分析のためのLA-ICP-MSの調製
- アブレーションチャンバー内の場所基準および試料は、それらがLA部に取り付けられたCCDカメラの被写界深度内にあることを確実にします。楽器のチューニングが必要な場合には、（ 例えば、ガラスでNIST 612微量元素）適切な基準材料を含みます。目を密閉するチャンバドア上の2本のネジを指で締めEアブレーションチャンバ。
- ICP-MSソフトウェアでは、「メンテナンス」または類似のパネルで開いたアルゴンガスのバルブを選択し、適切なダイアログボックスに分-1 1.2 Lにキャリアガスの流量を設定します。
注：このプロトコルのアルゴンキャリアガスとして使用されます。いくつかの例は、キャリアガスとしてヘリウムまたはヘリウムとアルゴンの混合物のいずれかを使用します。エアゾールキャリアガスとしてヘリウムとアルゴンの混合物を使用するための技術的な詳細については、ギュンターとハインリッヒ22を参照してください。 - LAソフトウェアでは、最低30分間アルゴンガスでセルをフラッシュする「パージ」ボタンをクリックします。
注：パージ時間は、「パージ時間」または類似のボタンをクリックすることで変更することができます。二量アブレーション細胞と焼灼システムを使用する場合、定期的に各コーナーにステージを移動し、斜めにできるだけ残留空気を確実にするために、セルを横断可能な細胞から除去されます。これは、「ホーム・ステージ」または当量を選択することによって達成することができますalent機能。 - '上にプラズマ」をクリックすることで、ICP-MSをオンにして、3.5ステップ、その間に2時間、ウォームアップすることができます - 4.4を行うことができます。適切なLA-ICP-MSの動作条件の例は、うさぎらで見つけることができますが機器の設定は、製造業者の間で変化します。 10。
- 組織の標準の代表的アブレーション
- ラインツールを選択して、組織表面全体に約3mm、長アブレーションの単一線を引きます。
- （、スキャン速度4倍のビーム径を、ビーム（30平方μmビームが、ここで使用されているユーザによって適宜選択）直径：実験リストにアブレーションの行を右クリックし、次のように変更することにより、次のようにパラメータを設定します毎秒; 120ミクロン秒-1）およびエネルギーフルエンス（0.3 -0.5 Jのcm -2の軟組織のために、必要に応じて硬い行列に対して最適化）。 30μmの組織厚さでレーザー光が完全THICを貫通していません顕微鏡のサポートから任意の潜在的な汚染物質を排除し、この組織のネス、。炭素23への正規化は、切除組織の量の変化を補正するために使用することができます。 「デフォルト」のラジオボタンを選択することにより、後続の各ラインのデフォルトとしてこれらのパラメータを設定します。
- 最初の行、右クリックを選択し、「重複スキャン」を選択することで、このラインを6回複製します。ビーム径によってまたはy軸-ラインをxのいずれかにオフセットされていることを確認してください。これは、ビーム径に応じて間隔をあけ標準あたり7行の合計を、提供します。
- 同一の長さのラインを確保し、各規格の3.5.3 - を繰り返して、3.5.1を繰り返します。
- サンプルの上にアブレーション領域を描画するには、2次のいずれかの方法に従います。
注：同一の走査パラメータ（ビーム径、走査速度、エネルギーフルエンス）を確認し、サンプルラインのために使用されます。- LAシステムが装備されている場合ビューの広い視野、ラインツールを選択し、3.5に概説したものと同じレーザパラメータを使用して、その最も広いポイントでの試料をカバーするのに十分な長さのサンプルの左上隅からの線を引きます。サンプルの完全なカバレッジを確保するために必要な回数だけビーム径に応じて間隔をあけラインと3.5.3で概説したように、このスキャンを複製します。
- 広視野ビューが使用できない場合は、サンプル全体をカバーする長方形の角に対応する（一般的に「ステージ位置」または類似のように、メイン画面に表示される）は、xとy座標を決定し、記録します。 3.7.1で説明したようにサンプル全体の領域をカバーする切除の平行線を配置するために、これらの座標を使用してください。
- 3.5で説明したプロセスを繰り返すことによって、試料を走査する〜20時間後遅くとも規格の間欠スキャンの線を描画します。試料のスキャン時間に応じてこれを複数回必要とされ得ます。 addiで実験を終了します標準の的なスキャン。
注：細胞は、パージされている間のx座標とy座標を決定する際、ホームポジションと軸の関連する較正を選択すると、以前に差に対し、xとy座標の詳細を取得した（ すなわち、ラインの長さ）が変更されます影響を受けません。
4. ICP-MSのためのデータ収集方法を設定します
- アブレーションの基準線は、単一の行の合計分析時間を決定するために、レーザスキャン速度によってラインの長さを分割します。サンプルラインのためにこれを繰り返します。
- ICP-MSソフトウェアでは、（「バッチ」としてここに示されている）は、新しいメソッドを作成し、「時間分解分析 'または同等が選択されていることを確認してください。検出されるm / z値を選択し、1サイクルの総積分時間は0.25秒に等しくなるように、それぞれのm / zのための積分時間を調整します。 [保存]をクリックしますバットchのように'と名前に応じて（ 例えば、STD1）。
注：サンプルは4倍のビーム径のレーザビームを横断するように、これは各質量のデータ点は、ビーム径12に相当する記録されている保証します。例えば、100μmのスポットサイズを使用して、400ミクロン秒-1 0.25秒の積分時間での走査速度は、真のピクセルサイズの画像を生成します。積分時間は感度を向上させるように調整することができます。 0.33秒スキャン速度に積分時間を増加させたときに3倍のビーム径に遅くする必要があります。 - 規格については、レーザーのウォームアップおよびウォッシュアウト時間を考慮して適切なボックス内の各ラインスキャンの解析時間に加え、さらに15秒を入力します。標準行の総数として、買収の同じ数（ すなわち 001、002、 など一般的に順次番号付け）でサンプル実行リスト（スキャンが実行されている、すなわち順序）を入力します。
- サンプルについて、代替ファイル名で現在のメソッドまたはバッチを保存することで、規格のために使用される方法を複製し、サンプルを除去します行数と一致するように（追加の15秒を含む）の合計取得時間や買収の合計数を調整。
注：ほとんどのLA-ICP-MSシステムは、一方向のトリガー（LAはICP-MSをトリガー）を使用するように、アブレーションの次の行を開始する前に、ICP-MSソフトウェアは、LAからのトリガを待っていることが不可欠です。 ICP-MS取得ウィンドウは、「開始を待っている」として読み出されます。
5.実験を実行します
- キューへの第一の方法またはバッチを追加することで、ICP-MSキューを起動して、ソフトウェアがLAシステムからのトリガを待っていることを確認します。
- LAソフトウェアでは、「放射」をクリックすることにより、レーザ電源を有効に、「実行」をクリックし、該当するボックスに20秒に10秒とウォッシュアウト時間にレーザーウォームアップ時間を設定します。
注：このオーバーランがしますICP-MSは、レーザーアブレーションの後続の各ラインを開始するときに、新しいデータの取得を開始する準備ができていることを確認します。 - 「スタート」をクリックすることで、レーザー・シーケンスを開始します。 2容積セルを使用している場合、サンプルカップが所定の位置にあることを確認してください。
6.定量基準の計算
注：画像にICP-MSデータを変換するための複数のバリエーションがあります。これらは、オープンソース言語17、24、25、商業マクロ26及びデータ解析ソフトウェアで記述された自家製のソフトウェアツールの使用を含みます。 7ここでは、特殊なLA-ICP-MSデータ分析スイート28に基づき、（ポールら 27に記載されている）、最近開発されたソフトウェアのプラグインを使用しています。
- ランデータを含むすべてのバッチフォルダに転送（001.d、002.d、 など 。）へのインストール分析ソフトウェアと別のコンピュータ。別のフォルダにバッチの各ラインのための*の.csvデータファイルを抽出します。
注：自動的に新しいフォルダに*の.csvファイルを転送するスクリプトを使用することを強くお勧めします。詳細については、添付のPythonコードを参照してください。このスクリプトは、いずれかのAgilent 7700または8800シリーズICP-MSに適合するように書かれているが、他のメーカーからの出力ファイルに合わせて編集することができます。 - ソフトウェアプラットフォームを開いて、以下に説明するように、定量的画像を生成するために基準をインポートし、分析するために、タブの順番に従ってください。
- 最初の標準バッチからデータをインポートするには、「インポート・タイプ」のため「ファイルの種類」の「アジレントの.csv '、'全体のフォルダ」を選択し、「日付形式は「コンピュータのフォーマットと同一であることを確認してください。 「インポート」をクリックして、標準の最初のセットのための.csv-ファイルを含むフォルダを選択し、「ベースライン」タブに移動します。
- ベースライン引き算
- 、ツールバーのメインアプリケーション]ドロップダウンメニューから「自動選択」タブ（コマンド2）を使用して「インポートからの情報」を選択し、[続行]をクリックします。
- 「すべて選択」と統合するための「Baseline_1」を選択しクリックしてください。
- 、（レーザーウォームアップ時間に相当する）は、各走査線の最初の10秒を選択する第二の値が'0'と'（行の継続時間- 10秒）'を入力することにより、データをトリミングするにはおよび「統合の追加」をクリックします（ たとえば、 、35秒の走査線のために、値が「0」と「25」を入力してください）。
- サンプルデータを選択するには、6.4で説明したように「自動選択」タブを使用しますが、統合として「Output_1]を選択します。バックグラウンド信号を除外するために開始し、各基準線の端からトリミングデータ（ 例えば 35秒間の走査線、値「13」と「4」を入力してください）。
- possiによる信号の低下を排除するために、基準のBLE穴は、「サンプル」タブでは、信号対雑音比（ 例えば、C13またはP31）高い信号を有するチャネルを選択するために、グラフ領域の左上にある「チャンネル」をクリックします。信号内の任意の急落をメモし、それがサンプル内の通常の変動の下で十分に低いCPS値を選択するが、信号の急激な降下を選ぶのに十分に高いです。
- 「DRS]タブをクリックし、「現在のデータ削減計画」のための「Baseline_Subtract」を選択します。 「インデックスチャンネル」と「低信号をマスクするときに使用するしきい値」のCPS値に対して6.6からチャンネルを選択してください。 ICP-MSへのレーザからの信号伝達の遅延を考慮するために、「低信号は、前/後にトリミングする秒数」の値<0.5秒を挿入します。
- 低信号領域の適切なマスキングを確認するには、「サンプル」タブに戻ってクリックして処理（ 例えば 、Fe56_CPS）チャネルのトレースを選択します。 CPSと＆＃を繰り返し、洗練39;秒は、必要に応じて6.7のように低信号 '値前/後にトリミングします。
- [結果]タブをクリックし、メインアプリケーションのドロップダウンメニューから「データのエクスポート]を選択します。結果のスプレッドシートデータファイル生成するファイル名を入力します（ 例えば、STD1の計算、STD2を...）。
- 適切なスプレッドシートプログラム内のデータファイルを開き、各チャンネルを定量するためのCPS値を計算します。各定量化できる要素に対してppmのCPS値から換算係数（μgのグラムを-1）を計算するために溶液の噴霧ICP-MSから所定の金属濃度を使用してください。
- 実行中のすべての標準セットに対して6.10 - を繰り返して、6.3を繰り返します。
7.定量的イメージの構築
- ソフトウェアを開くには、コマンドプロンプトで「Bioliteを（） 'と書きます。
- 「ロードイメージ」をクリックし、foは.csvファイル、ファイルを含むフォルダを選択することにより、サンプルデータをインポートサンプル画像Rを
- バックグラウンド補正
- サンプルのためのバックグラウンド補正を適用するには、「ベースライン」タブをクリックします。リン（P31）の画像は矩形描画ツールを使用して、画面上の背景の選択領域を促しました。できるだけ多くの領域を選択すると、これらの交絡因子の適切な補償を保証するために、信号/プラズマドリフトの画像全体のマップを作成します。
- 背景信号をより見やすくするために、グラフ編集ツールを選択（上、表示された画像の左）と右の画像をクリックしてください。 「イメージの外観を変更します」と大きな負の値（例えば -100000）に'= Zで最初の色」に変更]を選択します。 [完了]をクリックして進んでください。
- CPS / ppmの補正係数のテーブルを表示するために「標準」タブをクリックします。各元素のステップ6.10で標準から計算した値を入力します。このステップは、ICP-MSで感度ドリフトを補正するのに役立ちます。 「Go]をクリックします！」
- 各要素と各ステップの画像を保持している「データ」タブから開く「データ・ブラウザ」。
- 輸出用の画像を完成させるために、「StdCorrImages」フォルダ内の所望の画像を選択し、イメージ名（* _ppm）を右クリックして、「NEWIMAGE」をクリックします。所望の色のテーブルとカラースケールを選択するには、「イメージの外観を変更する」開くには画像を右クリックします。画像を右クリックし、「注釈を追加」を選択することで、画像にカラースケールを追加します。左上のドロップダウンメニューから「ColorScaleの 'を選択し、希望のカラースケールを変更するには、タブを使用します。
- 画像をエクスポートするには、問題の画像が選択されていることを確認し、「ファイル」タブに移動し、クリックして「グラフィックスを保存...」。希望の形式を選択して、画像を保存します。また、選択した画像は、コピー＆ペーストツールを使用して転送することができます。
- 繰り返しは、関心のあるすべての画像のための7.6と7.7を繰り返します。
- Quantif瑛別個の領域
- ROIツールを有効にするには、「分析」タブ、「パッケージ」に移動して、「画像処理」を選択します。
- 所望の画像を選択し、「イメージ」タブに移動し、クリックして「ROIを...」。 「スタートROIドロー」をクリックして、試料中の関心領域を選択するために、描画ツールを使用します。描画を終了するには、[完了ROI」をクリックします。
- 選択されたROIの統計情報を取得するには、「イメージ」タブに移動し、クリックして「統計を...」。
- 別々のスプレッドシートに結果をコピーして貼り付けます。すべての地域と関心の要素を繰り返しROIの選択（7.9.2）。
Representative Results
このLA-ICP-MSイメージングアプローチの能力を実証するために、WT C57BL / 6マウス脳の単一セクションを使用して簡単な実験、脳梁で二分し、冠状面で切片は、提示されています。分析部（ 図2）に金属分布の代表的な画像を提供するため、ならびに、セクション6および7に記載したようにBiolite（ 図1）を用いてデータを分析するためのワークフローは、また、記載されています。
図から分かるように、マウス脳における金属分布は解剖学的領域に応じて可変です。これは、可変ロール金属に起因することができ、より具体的には、それらが結合しているタンパク質は、各脳領域27で再生します。例えば、鉄、亜鉛は、コルチで最も豊富であるのに対し、中脳及び歯状回に沿ってより高い濃度を有する傾向にありますCALエリア。一般的に使用される内部標準8である炭素は、均一に分布しています。金属の共局在化に関する情報は、特定の金属結合タンパク質の発現は、脳内の金属の作用への洞察を提供することができ、既存の解剖学的および機能的基準アトラス29に関連して使用される場合、元素マップ（ 図2）は 、特に有用であり得ます地域、または識別された疾患関連生体分子に沿った金属レベルの変化。検体の広い範囲のために最適化されて記載されたアプローチを用いて、例えば、マンガンなどの低存在量要素の感度を排除し、及び方法は、他の測定質量を犠牲にして、滞留時間を増加させることにより、この検体に主に焦点を合わせるように構成することができます。
LA-ICP-MSによるイメージングを使用する際の主な利点は、金属concentrにおける相対的な差を観察していますエーションと実験群との間に分布。我々は以前にPD 2,10、およびヒトアルツハイマー病の組織21における皮質鉄レベルの変化を模倣する神経損傷後に増加し、鉄を実証するために、このような技術を使用しています。ここに記載されるように、そのようなプロトコルは、容易に記載されている方法に最小限の修正と他の組織タイプに適合させることができます。
図1： 画像処理のワークフロー。マウス脳における金属分布の定量的な画像にICP-MSからの未処理時間分解データの変換を示すセクション6及び7に相補的なワークフロー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図2： マウス脳内Biometalsの典型的な元素分布。 LA-ICP-MSを用いて分析し、単一のマウス脳半球の厚さ30μmの冠状断面の代表的な要素マップ。 （一番上の行）;炭素13（C13）、マグネシウム-24（MG24）とリン-31（P31）のための画像は、ゴールドカラースケール（CPSカウント毎秒）で表示されています。マンガン-55（MN55）、銅-63（Cu63）、鉄-56（Fe56）および亜鉛-66（Zn66）のための定量的画像（下段）は、対応するBlueHotのカラースケール（μgのグラム-1）で表示されます。脳切片の総分析時間は約5時間でした。スケールバー= 2ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
神経組織におけるイメージング金属が、このプロトコルは、任意の生物学的マトリックス中の金属の分布および量に関する有用な情報を提供する方法のほんの一例です。標準物質の調製が困難であってもよいが、それは一度実行し、後で使用するためにアーカイブすることができます実験です。
LA-ICP-MSは、主に、アクセシビリティ及び感度の観点から、このようなシンクロトロン系蛍光X線顕微鏡などの代替方法を超えるいくつかの利点を有します。しかし、LA-ICP-MSを用いた実験を準備する際に考慮すべきいくつかの欠点があり、そのようなものとして、それは、多くの場合、代替的金属分析技術、並びに比較組織化学5を含む化学的イメージングのために有用な補完的な技術です。
マウス脳の既知の解剖学的特徴との位置合わせが可能な機能relatiに関する有用な情報を提供することができます金属レベルと空間分布の間onship。以前、我々は、金属依存性酵素発現14と神経解剖学27の両方の空間的相関を調べるために、C57BL / 6マウスの脳の両方の解剖学的および遺伝子発現データのオープンアクセスリポジトリであるアレン脳アトラスオンラインリソース、29を使用しています30。このような齧歯類の脳ワークベンチ31のような他のリソースは、また多くの場合、小さな解剖学的領域における金属分布の正確な同定を支援するために登録し、金属画像の位置合わせを支援するために利用可能です。
この技術の応用は、通常のライフイベント（ 例えば、老化）の両方の全体および疾患状態でマイクロスケールでどのように金属レベルと分布の変化を評価するのに有用です。同様に、私を標的とするように設計された金属含有化合物および薬物の両方の効果を研究しますタル代謝。空間的に金属分布を評価するためのイメージング技術としてLA-ICP-MSの現在の主な制限は、スループットと感度です。分析の速度及び空間分解能5、12の間のトレードオフは、より高い解像度の画像は、長い分析時間を必要とすると、があります。マンガン、コバルト、セレンなどの要素が原因で、正常組織および/または従来のICP-MSによるそれらの検出の限界での少量に制限されていても技術は、高濃度では生物学的要素に適しています。このようなトリプル四重極質量分析器の導入などICP-MS技術の新たな進歩は、より高い感度33でセレン32のような困難な分析物の標的と検出を可能にします。技術主導の手順としては、増加し、進化し続けるこのイメージング技術が表示され、レーザーおよび質量分析設計の両方に進みます分析および感度34の速度。
Acknowledgments
DJHとPADはBKの寄与はドイツのエクセレンス・イニシアチブ[DFG GSC 3分の98]によって資金を供給され、ルール大学研究科PLUSによってサポートされていましたアジレント・テクノロジーおよびESI社とオーストラリアの研究評議会の連携プロジェクト（LP120200081）によってサポートされています。 DJHは、部分的にRamaciotti財団によってサポートされていました。 KKはシグリッドJuselius財団によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soda glass microscope slides | n/a | n/a | Typical slides are suitable for all experiments |
| PTFE-coated microtome blades | C.L. Stuckey | DT315R50 | Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering. |
| Parafomaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | Any supplier suitable |
| Sucrose | n/a | n/a | Commercial grade white sugar is suitable |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5368 | Premixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 247624 | Any supplier suitable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Any supplier suitable |
| Lamb brain | n/a | n/a | Available from most local butchers |
| Metal salts | n/a | n/a | Use water soluble metal salts containing desired analytes |
| Omni TH Tissue Homogeniser | Omni Inc | THP115 | Alternative homogenizers are suitable |
| Polycarbonate homgenizer probes | Omni Inc | TH115-PCRH | |
| Microwave digestion unit | n/a | n/a | Optional. See Section 2 |
| 1.5 mL microfuge tubes | TechnoPlas | P4010 | Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable |
| 65% nitric acid | Merk Millipore | 100441 | Trace analysis grade |
| 30% hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 95321 | Trace analysis grade |
| 10 x 10 mm disposable cryomolds | Ted Pella | 27181 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 76871 | |
| Liquid nitrogen | n/a | n/a | Use local supplier |
| NWR213 Laser Ablation system | ESI Ltd | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Agilent 8800 Series ICP-MS | Agilent Technologies | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Iolite | Iolite Software | n/a | Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol |
| Excel | Microsoft | n/a | |
| IGOR Pro | Wave Metrics | n/a | Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm |
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