Summary
Cuantitativamente el mapeo de los metales en el tejido por ablación con láser - plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (LA-ICP-MS) es una técnica analítica sensible que puede proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo los metales participan en los procesos de funcionamiento y las enfermedades normales. A continuación, se describe un protocolo para obtener imágenes de los metales cuantitativamente en las secciones delgadas de tejido neurológico del ratón.
Abstract
Metales se encuentran en todos los apartados un organismo, con su papel biológico dictado por tanto su reactividad química y la abundancia dentro de una región anatómica específica. Dentro del cerebro, los metales tienen una distribución muy compartimentado, dependiendo de la función primaria que juegan dentro del sistema nervioso central. Imágenes de la distribución espacial de los metales ha proporcionado una visión única de la arquitectura bioquímica del cerebro, lo que permite la correlación directa entre regiones neuroanatómicas y su función conocida con respecto a los procesos dependiente de metal. Además, varios trastornos neurológicos relacionados con la edad característica interrumpidos homeostasis metal, que a menudo se limita a pequeñas regiones del cerebro que son difíciles de analizar. A continuación, describimos un método integral para obtener imágenes de forma cuantitativa los metales en el cerebro del ratón, utilizando ablación por láser - plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (LA-ICP-MS) y el procesamiento de imágenes especialmente diseñadosoftware. Centrándose en hierro, cobre y zinc, que son tres de los metales más abundantes y relevantes de la enfermedad en el cerebro, se describen los pasos esenciales en la preparación de muestras, análisis, mediciones cuantitativas y procesamiento de imágenes para producir mapas de distribución de metal dentro de la baja micrómetro gama resolución. Esta técnica, aplicable a cualquier sección de tejido cortado, es capaz de demostrar la muy variable distribución de metales dentro de un órgano o sistema, y se puede utilizar para identificar los cambios en la homeostasis de metal y los niveles absolutos dentro de las estructuras anatómicas finas.
Introduction
La química redox única de metales facilita una gama de funciones neurológicas, incluyendo la transducción de señales, producción de energía y síntesis de neurotransmisores. En una serie de importantes enfermedades neurodegenerativas, dyshomeostasis de estos metales han sido los dos implicados en la patogénesis de la enfermedad e identificados como potenciales nuevas dianas para la intervención terapéutica 1. Para entender mejor cómo los metales están involucrados en condiciones tales como la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson (AD y PD, respectivamente), es imperativo que ser capaz de medir la distribución de metal y los niveles cambian dentro de las regiones afectadas adversamente por el proceso de la enfermedad. Estos cambios suelen ser indicativos de cambios sutiles en las reacciones bioquímicas que pueden estar íntimamente vinculados a los procesos que inician la muerte celular, como nuestra propuesta recientemente mecanismo de hierro y dopamina neurotoxicidad en la EP 2.
Tradicionalmente, metalos niveles de L dentro de las regiones anatómicas definidas se ha logrado a través de la escisión cuidado, la digestión y el análisis utilizando una serie de técnicas analíticas 3. Sin embargo, este enfoque pierde la información espacial, que puede ser crítico cuando los estados de enfermedad siendo investigados involucran regiones pequeñas y bien definidas o tipos celulares específicos. Un número de métodos de análisis están disponibles para la visualización de los metales en los sistemas biológicos, a partir de muestras intactas a las secciones de tejido y en dos y tres dimensiones, utilizando espectroscopia de emisión, sondas fluorescentes y espectrometría de masas 4. Cada técnica tiene ventajas y desventajas con respecto a la sensibilidad, la selectividad de especies químicas, y la resolución espacial que se puede lograr. Para una descripción completa de la gama de técnicas disponibles, véase la revisión de Hare et al. 5.
La espectrometría de masas (MS) a base de métodos son los más sensibles de estas técnicas, Capaz de medir metales biológicamente más relevantes a las concentraciones nativa 6. La ablación con láser - plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (LA-ICP-MS) de formación de imágenes emplea un rayo láser ultravioleta enfocado varían en tamaño de 1 a> 100 micras de diámetro (o anchura, cuando se usa una forma del haz cuadrilátero), en las que el muestra se hace pasar 7. La información cuantitativa se puede lograr a través de la ablación representante de materiales de referencia estándar, que puede ser producida utilizando una variedad de diferentes enfoques 8, cada uno con diversos grados de dificultad técnica y practicidad analítica. El enfoque más común utiliza la matriz de coincidencia, en que una norma con una composición química predominante comparable a la de la muestra se prepara clavar con el analito diana y con precisión para evaluar la homogeneidad y la concentración de metal absoluto por medios analíticos independientes 9, 10. La ablación de los estándares preparados a continuación, se puede utilizar para fines de calibración externos, permitiendo que los datos de concentración de la imagen de la muestra resultante a extraer por píxel.
Resolución de la imagen está determinada tanto por el tamaño del haz y velocidad a la que se escanea la muestra. El cuadrupolo-diseño estándar ICP-MS (que representan más del 90% de todos los sistemas de ICP-MS instalados en todo el mundo 11) es un analizador de masas secuencial, en el que los ciclos del detector de masas a través de toda la relación seleccionada-masa-carga (m / z ) en lugar de la recogida de datos de forma simultánea. Por lo tanto, el tiempo de adquisición para cada ciclo de masas debe equiparar con el tiempo necesario para que la muestra de atravesar una anchura del haz de láser para asegurar un representante de píxeles de la resolución deseada se adquiere 12. Selección del tamaño de rayo láser es un parámetro crucial que tiene efectos significativos en la sensibilidad y el tiempo total de análisis. Como physi ablación con lásercamente elimina el material que se barrió a la ICP-MS por un gas portador de argón, la cantidad de materia que se puede detectar físicamente por el analizador de masas sigue la ley de la inversa del cuadrado. Por ejemplo, reducir el diámetro del haz de láser de 50 - 25 micras como resultado una reducción de material separada por ablación en un factor de cuatro. Adicionalmente, como un método de exploración, diámetros de haz más pequeños aumentan el tiempo total requerido para la ablación de un área seleccionada. Por lo tanto, el diseño experimental es esencial para equilibrar la resolución espacial necesaria con las necesidades de sensibilidad y limitaciones de tiempo.
Imaging por LA-ICP-MS se ha aplicado a una variedad de muestras, matrices y estados de enfermedad, incluyendo modelos animales de trastornos neurológicos 13, 14, lesión cerebral traumática 15, la distribución, exposición tóxica medicamentos contra el cáncer 16 que contiene metal en la placenta 17 y metal distribution en los dientes como un biomarcador de transiciones dietéticas primeros años de vida. 18 En este protocolo se describe un método general para obtener imágenes de hierro, cobre y zinc en el cerebro de ratón WT con una resolución de 30 micras, aunque se puede adaptar fácilmente a una variedad de tipos de muestras y los resultados experimentales, en función de las necesidades de la analista.
Protocol
Los procedimientos descritos en este documento han sido aprobados por el Comité de Ética Animal Howard Florey y adherirse a las normas del Consejo de Investigación Médica y Salud Nacional de cuidado de los animales.
1. Preparación de la muestra para el análisis
NOTA: Este paso varía dependiendo de la matriz de la muestra a analizar.
- Preparación de la muestra y seccionamiento
NOTA: La fijación utilizando 4% de paraformaldehído (PFA) y crioprotección en 30% de sacarosa en 0,1 M PBS dará lugar a cantidades variables de lixiviación de los metales a partir de tejido. Ver Hare et al 19 para obtener detalles específicos. Asegurar que todas las muestras han sido sometidos a idénticas fijación y Crioprotección pasos.- Transcardially perfundir los animales sacrificados con helado de PBS 0,1 M, pH 7,4 (véase la sección Métodos de Dodt et al. 20 para más detalles) y retire el cerebro.
- Coloque el cerebro en el 4% PFA O / N para fijar el tejido. <li> Cryoprotect el cerebro mediante la colocación en 30% de sacarosa en 0,1 M PBS durante 24 h, y luego cambiar a fresco 30% de sacarosa durante otras 24 h. 19
- Congelación del cerebro en un criostato a -20 ° C durante al menos 1 h.
- Montar el cerebro en un mandril utilizando un medio de montaje adecuado.
- Sección del cerebro en un criostato usando una cuchilla desechable libre de metal (por ejemplo, politetrafluoroetileno [PTFE] presenta el revestimiento cuchillos) y montar en un portaobjetos de microscopio estándar. El espesor óptimo de la sección debe ser de aproximadamente 30 micras.
NOTA: No se conocen efectos precisos de fijación a largo plazo y de inclusión en parafina de las muestras biológicas. Como se describe en el apartado 1.1, asegúrese de que todas las muestras se han sometido a procedimientos de preparación de muestras idénticas si se pretende un análisis comparativo.
- desparafinado pamuestras Raffin-incrustado por inmersión de la diapositiva en 3 cambios de xileno, 1 cambio de cada uno de: 100% etanol, 95% etanol, 70% de etanol y un mínimo de 3 cambios en la norma ISO 3696 o agua purificada equivalente (en lo sucesivo, se hace referencia como " agua "; véase Hare et al 21 para un método detallado)..
2. Preparación de Normas matricial
Nota: El siguiente es un protocolo resumido previamente publicado 9. Por favor consulte el documento original para conocer los pasos detallados para la preparación de las normas de tejido matricial.
- Obtener sesos de cordero comerciales (o similar) y enjuagar en agua, la eliminación de toda la sangre y el tejido conectivo.
- El uso de un bisturí, diseccionar cuidadosamente unos 50 g de tissu corticale y parcialmente homogeneizan usando un homogeneizador de tejidos de mano con una sonda desechable de policarbonato de baja potencia. Divida en alícuotas de 5 g, con el número en función de la escala de patrones y el número de puntos de calibración deseados.
- Preparar soluciones de los metales a la espiga cada estándar mediante la disolución de una sal soluble de cada analito (por ejemplo, FeSO4 · H 2 O) en 1% de ácido nítrico para producir 0,1, 1 y 100 mg de metal ml -1 stocks.
- Añadir un volumen pre-calculada de la solución madre al 5 g de tejido alícuota (por ejemplo, 5 l de 10 mg ml -1 para una concentración final aproximada de 10 mg g -1 tejido húmedo) para conseguir un intervalo de niveles de metal con púas en cada norma.
- Dependiendo de la concentración final deseada de cada estándar, utilizar una combinación de cada solución de metal, para asegurarse de la cantidad mínima de soluciones se añaden a la norma. Añadir un pico final de agua para cada estándar para asegurar equivalentes volúmenes de líquido añadido está presente en cada norma.
- Homogeneizar los estándares de pinchos en baja potencia durante aproximadamente 30 s. Si no se utiliza inmediatamente, mantener congelada a -20 ° C en tubos de polipropileno tapados selladas con Parafilm.
- Determinar la concentración exacta y homogeneidad de cada estándar utilizando cualquiera de los procedimientos siguientes:
- digestión por microondas
- Coloque 6 Pesar exactamente (aproximadamente 50 mg) de alícuotas de un estándar en un recipiente de digestión PTFE lavado y añadir 4 ml de concentrado (65%) de ácido nítrico y 1 ml de peróxido de hidrógeno 30%. Sellar y digerir a 500 W durante 30 minutos.
- Después de enfriar el recipiente de digestión, se abre en una campana de humos y cuantitativamente la solución digerida a un 50 tubo de lavado con ácido ml usando alícuotas de 10 ml de agua. Hacer a aproximadamente 50 ml, y se pesa con precisión la masa de la solución final.
- Repita los pasos 2.5.1.1 - 2.5.1.2 para cada estándar.
- Utilice el siguiente procedimiento si el equipo de digestión por microondas no está disponible:
- Coloque seis (entre 25 - 200 mg) medidos con precisión alícuotas de estándar en lavada con ácido / tubo de polipropileno libre de metal y liofilizar O / N.
- Añadir 40 l de ácido nítrico concentrado y el calor, sin tapar, en un bloque de calentamiento a 70 ° C durante 5 min, y luego añadir 10 l de peróxido de hidrógeno 30%. Calentar de nuevo durante 5 min, y luego hacer con precisión a 1 ml de volumen total usando 950 l de ácido nítrico al 1%.
NOTA: Es recomendable para digerir un material de referencia certificado utilizando el método de elección para asegurar procedimientos de digestión son exactos.
- digestión por microondas
- Determinar la concentración de metal en cada solución de digerir por la solución de nebulización ICP-MS usando un protocolo estándar. Evaluar homogeneidad de cada estándar mediante la determinación de la desviación estándar relativa (% RSD) entre cada alícuota. Asegurar% RSD todas ellas incluidas dentro del 15%. El uso de la masa medida de EAch alícuota, calcular la concentración de metal precisa de cada patrón de tejido homogeneizado.
- Volviendo a la norma tejido homogeneizado, paquete de un molde de plástico desechable histología 5 x 5 mm y congelar en pentano iso enfriado en nitrógeno líquido. Retire el bloque de tejido congelado estándar del molde y la sección en un criostato con el mismo grosor que la muestra.
Nota: Es aconsejable preparar una serie de secciones en diferentes grosores para futuros experimentos. normas secadas al aire se pueden almacenar indefinidamente en un recipiente hermético y libre de polvo.
3. Preparación de LA-ICP-MS para el análisis
- normas y lugar de la muestra en la cámara de ablación, asegurándose de que están dentro de la profundidad de campo de la cámara CCD montado en la unidad de Los Ángeles. Si la sintonización del instrumento es necesario, incluir un material adecuado de referencia (por ejemplo, el NIST 612 Elementos Traza en la Copa). Apretar los dos tornillos de la puerta de la cámara para sellar THcámara de ablación e.
- En el software de ICP-MS, seleccione abrir la válvula de gas argón en el 'mantenimiento' o panel similar y establecer el flujo de gas portador a 1,2 L min-1 en el cuadro de diálogo apropiado.
NOTA: En este protocolo se utiliza argón como gas portador. Varios ejemplos utilizan o bien helio o una mezcla de helio y argón como gas portador. Ver Günther y Heinrich 22 para los detalles técnicos para el uso de helio y argón como mezclas de gases portadores de aerosol. - En el software de LA, haga clic en el botón de 'purga' para enjuagar la celda con gas argón durante un mínimo de 30 minutos.
NOTA: El tiempo de purga puede ser alterado haciendo clic en un "tiempo de purga" o botón similar. Cuando se utiliza un sistema de ablación con una célula de ablación de dos volúmenes, mover periódicamente la etapa a cada esquina y en diagonal atravesar la célula para asegurar que se elimina la cantidad de aire residual de la célula como sea posible. Esto se puede lograr mediante la selección de las etapas '' de origen o equivfunción valente. - Encienda el ICP-MS haciendo clic 'en el plasma' y dejar que se caliente durante dos horas, tiempo durante el que las etapas 3.5 a 4.4 se puede llevar a cabo. Ajustes del instrumento varían entre los fabricantes, aunque un ejemplo de las condiciones de funcionamiento LA-ICP-MS apropiados se pueden encontrar en Hare et al. 10.
- ablación Representante de las normas de tejido
- Seleccione la herramienta de línea y dibujar una sola línea de ablación de aproximadamente 3 mm de largo en toda la superficie del tejido.
- Establecer los parámetros de la siguiente haciendo clic derecho en la línea de la ablación en la lista de experimentos y cambiando la siguiente: diámetro del haz (seleccionada como apropiada por el usuario; una viga cuadrada de 30 micras se utiliza aquí), velocidad de exploración (4 veces el diámetro del haz por segundo; 120 m s-1) y la fluencia de energía (-0.5 0.3 J cm -2 para tejido blando; si es necesario optimizar para las matrices más difíciles). A 30 m de espesor de tejido del haz de láser no penetra en el thic completaKness de este tejido, eliminando cualquier contaminante potencial del soporte microscopio. La normalización de carbono 23 puede ser usado para corregir la variación en la cantidad de tejido extirpado. Establecer estos parámetros como el valor predeterminado para cada línea subsiguiente al seleccionar el botón de opción "por defecto".
- Duplicar esta línea de seis veces al seleccionar la línea inicial, haciendo clic derecho y seleccionando '' exploraciones duplicadas. Asegúrese de que las líneas estén compensados en cualquiera de los X - o eje y por el diámetro del haz. Esto da un total de siete líneas por norma, separados entre sí de acuerdo con el diámetro del haz.
- Repita los pasos 3.5.1 - 3.5.3 para cada estándar, asegurando la línea de longitud idéntica.
- Para dibujar la zona de ablación sobre la muestra, siga uno de los dos métodos siguientes:
NOTA: Asegúrese de que los mismos parámetros de exploración (diámetro del haz, velocidad de exploración, fluencia de energía) se utilizan para líneas de muestreo.- Si el sistema de LA está equipado con una-Amplio campo de visión, seleccionar la herramienta de línea y trazar una línea desde la esquina superior izquierda de la muestra lo suficiente para cubrir la muestra en su punto más ancho utilizando los mismos parámetros del láser descritos en 3.5. Duplicar esta exploración como se describe en 3.5.3 con líneas espaciadas de acuerdo con el diámetro del haz tantas veces como sea necesario para asegurar una cobertura completa de la muestra.
- Si el campo visual ámplio no está disponible, determinar y registrar las coordenadas X e Y (por lo general se muestra en la pantalla principal como "posición de fase" o similar) correspondientes a las esquinas de un rectángulo que cubre toda la muestra. Utilice estas coordenadas para posicionar las líneas paralelas de ablación que cubren todo el área de la muestra como se describe en 3.7.1.
- Dibujar líneas de escaneo intermitente de normas a más tardar después de ~ 20 h de la exploración de la muestra, repitiendo el proceso descrito en 3.5. Dependiendo de la duración del análisis de la muestra de esto puede ser necesario varias veces. Terminar el experimento con un adicional de exploración de las normas.
NOTA: Al determinar las coordenadas X e Y mientras que la célula se está purgando, la selección de las posiciones iniciales y la calibración asociada del eje cambiará el previamente adquiridos específicos para la coordenadas X e Y mientras que la diferencia (es decir, la longitud de la línea) se se verá afectado.
4. Configuración de datos Métodos de recopilación de las ICP-MS
- Para la línea estándar de ablación, dividir la longitud de la línea por la velocidad de escaneo láser para determinar el tiempo total de análisis para una sola línea. Repita este procedimiento para la línea de muestreo.
- En el software de ICP-MS, crear un nuevo método (que se muestra aquí como un "lote") y asegúrese de que "el tiempo de análisis resuelto" o se selecciona equivalente. Seleccione los valores de m / z para ser detectados, y luego ajustar el tiempo de integración para cada m / z por lo que el tiempo de integración total para un ciclo es igual a 0,25 s. Haga clic en "Guardar BatComo ch 'y el nombre en consecuencia (por ejemplo, STD1).
NOTA: Como la muestra atravesar el haz de láser en cuatro veces el diámetro del haz, esto asegura un punto de datos para cada masa se registra equivalente al diámetro del haz 12. Por ejemplo, usando un tamaño de 100 micras lugar, una velocidad de barrido de 400 m s-1 con un tiempo de integración de 0,25 s producirá imágenes con verdaderos tamaños de pixel. Tiempo de integración se puede ajustar para mejorar la sensibilidad; al aumentar el tiempo de integración a velocidad de exploración 0,33 s debe ser reducido a tres veces el diámetro del haz. - Para los estándares, introduzca el tiempo de análisis para cada línea de exploración en la casilla correspondiente, más un adicional de 15 s para dar cuenta de láser calentamiento y tiempos de lavado. Introduzca una lista de ejemplos de ejecución (es decir, el orden en que se realizan las exploraciones) con el mismo número de adquisiciones (por lo general numeradas secuencialmente, es decir, 001, 002, etc.) como el número total de líneas estándar.
- Para la muestra, Duplicar el método utilizado para los estándares guardando el método actual o por lotes con un nombre de archivo alternativo, y ajustar el tiempo total de adquisición (incluidos los 15 s adicionales) y el número total de adquisiciones para que coincida con el número de líneas que la ablación de la muestra .
NOTA: Como la mayoría de los sistemas de LA-ICP-MS utilizan un disparador de una sola vía (LA desencadena ICP-MS), es esencial que el software ICP-MS está a la espera del gatillo de la LA antes de la línea posterior de la ablación comienza. La ventana de adquisición ICP-MS leerá 'espera para el inicio'.
5. Ejecución del experimento
- Iniciar la cola de ICP-MS añadiendo el primer método o por lotes a la cola y asegurar que el software está esperando el gatillo del sistema de Los Ángeles.
- En el software de LA, permitirá el suministro de energía del láser haciendo clic en "emisión", haga clic en "Ejecutar" y establecer el tiempo de calentamiento láser para 10 s y el tiempo de lavado de 20 s en los cuadros correspondientes.
Nota: Este rebasamientoasegurar la ICP-MS está listo para comenzar a adquirir nuevos datos cuando el láser del comienzo de cada línea subsiguiente de la ablación. - Iniciar la secuencia de láser haciendo clic en "inicio". Si se utiliza una celda de dos volúmenes, garantizar la copa de muestra está en posición.
6. Cálculo de patrones de cuantificación
NOTA: Existen múltiples variaciones para convertir los datos de ICP-MS en imágenes. Estos incluyen el uso de herramientas de software de fabricación casera escritos en lenguajes de código abierto 17, 24, 25, 26 macros comerciales y datos de software de análisis. 7 A continuación, utilice el software plug-in desarrollado recientemente (descrito en Paul et al. 27), basada en un LA-ICP-MS paquete de análisis de datos especializada 28.
- Transferir todas las carpetas que contengan lotes de los datos de ejecución (001.d, 002.d, etc.) A unaordenador separado con el software de análisis instalado. Extraer los archivos de datos * .csv para cada línea del lote en una carpeta separada.
NOTA: El uso de una secuencia de comandos para transferir automáticamente los archivos * .csv en una nueva carpeta es muy recomendable. Ver código Python adjunto para más detalles. Este guión ha sido escrito para que se adapte bien un Agilent 7700 o 8800 Series ICP-MS, pero puede ser editado para satisfacer el archivo de salida de otros fabricantes. - Abra la plataforma de software y seguir la secuencialmente pestañas para importar y analizar las normas para producir imágenes cuantitativos como se describe a continuación.
- Para importar los datos desde el primer lote estándar, seleccione 'Agilent .csv "para" Tipo de archivo "," carpeta completa "para" Tipo de importación' y comprobar que el 'Formato de fecha' es idéntico al formato de computadora. Haga clic en "Importar", seleccione la carpeta que contiene los archivos .csv-para el primer conjunto de normas, y pasar a la pestaña "líneas de base".
- Basesustracción
- Utilice la pestaña 'Selección Automática' (comando 2) en el menú principal de la aplicación desplegable de la barra de herramientas, seleccione "Información de importación 'y haga clic en" Continuar ".
- Haga clic en "Seleccionar todo" y seleccione "Baseline_1 'para la integración.
- Para seleccionar los primeros 10 s de cada línea de exploración (que corresponde al láser tiempo de calentamiento), recortar los datos entrando en el segundo valores '0' y '(duración de la línea - 10 s)' y haga clic en "Añadir integraciones '(por ejemplo, , para una línea de exploración 35 s, introduzca los valores '0' y '25').
- Para seleccionar los datos de la muestra, utilice la ficha 'Selección Automática' como se describe en 6.4, pero elige 'OUTPUT_1' como la integración. Datos sobre cultivos desde el principio y final de cada línea estándar para excluir la señal de fondo (por ejemplo, para una línea de exploración 35 s, introduzca los valores '13' y '4').
- Para excluir gotas en la señal causada por la posibles agujeros en las normas, en la pestaña '' Muestras, haga clic en "canales" en la parte superior izquierda del área del gráfico para seleccionar un canal con una alta relación señal a ruido (por ejemplo, C13 o P31). Anote cualquier fuertes caídas en la señal y seleccionar un valor suficientemente bajo CPS es decir por debajo de la variación normal dentro de las muestras, pero lo suficientemente alto como para seleccionar las fuertes caídas en la señal.
- Haga clic en la pestaña 'DRS' y seleccione 'Baseline_Subtract "para el" Plan de Reducción de Datos actuales'. Elija el canal desde el 6,6 por 'Channel Index' y el valor de CPS para "Umbral para utilizar cuando enmascarar las señales de baja '. Introduzca un valor <0,5 s de 'segundos para recortar antes / después de las señales de baja' para tener en cuenta el retraso en la transferencia de la señal del láser a la ICP-MS.
- Para confirmar el enmascaramiento adecuado de las zonas bajas de la señal, haga clic de nuevo a la pestaña 'muestras' y seleccione una traza del canal procesado (por ejemplo., Fe56_CPS). Repetir y perfeccionar el CPS y & #39 segundos; para recortar antes / después de los bajos valores de señales 'como en 6,7 si es necesario.
- Haga clic en la pestaña "Resultados" y elige "Exportar datos" en el menú principal de la aplicación desplegable. Introduzca un nombre de archivo para generar un archivo de datos de hojas de cálculo de los resultados (por ejemplo, cálculos STD1, STD2 ...).
- Abra el archivo de datos en una hoja de cálculo adecuado y calcular los valores de CPS para cada canal individual a cuantificarse. Usar las concentraciones de metal predeterminada de la solución de nebulización ICP-MS para calcular el factor de conversión de valores de CPS a ppm (mg g -1) para cada elemento cuantificable.
- Repita los pasos 06.03 a 06.10 para todos los conjuntos de normas en la carrera.
7. La construcción de imágenes cuantitativas
- Escribe 'Biolite ()' en el símbolo del sistema para abrir el software.
- Importar los datos de la muestra haciendo clic en "Cargar imágenes" y seleccionar la carpeta que contiene los archivos .csv-for la imagen de muestra.
- corrección de fondo
- Haga clic en la pestaña "líneas de base" para aplicar la corrección de fondo para la muestra. En la imagen de fósforo (P31) se le indique en la pantalla, seleccione las áreas del fondo utilizando la herramienta rectángulo sorteo. Seleccionando tantas regiones como sea posible crea un mapa de toda la imagen de la deriva / plasma señal para asegurar una compensación adecuada de estos factores de confusión.
- Para hacer la señal de fondo más visible, seleccione la herramienta de edición gráfica (parte superior izquierda de la imagen se visualiza) y haga clic derecho en la imagen. Seleccione 'Modificar apariencia de la imagen' y cambiar el 'Primer informe de color en Z =' a un valor negativo grande (por ejemplo, -100.000). Proceder haciendo clic en 'Hecho'.
- Haga clic en la pestaña 'Normas' para abrir una tabla de factores de corrección CPS / ppm. Introducir los valores calculados a partir de los estándares en el paso 6,10 para cada uno de los elementos. Este paso le ayudará a corregir la deriva de la sensibilidad en el ICP-MS. Haga clic en "Go!
- Abrir 'explorador de datos "en la pestaña" Datos ", el cual tiene las imágenes para cada elemento y cada paso.
- Para finalizar una imagen para la exportación, seleccione la imagen deseada en la carpeta '' StdCorrImages, haga clic en el nombre de la imagen (* _ppm) y haga clic en 'NewImage'. Haga clic en la imagen para abrir 'Modificar apariencia de la imagen' para elegir una escala tabla de colores y el color deseado. Añadir una escala de colores de la imagen haciendo clic derecho en la imagen y seleccionar "Añadir Anotación". Seleccione 'ColorScale' en el menú desplegable de la parte superior izquierda y el uso de las fichas para modificar la escala de colores deseada.
- Para exportar una imagen, asegúrese de que se selecciona la imagen en cuestión y vaya a la pestaña "Archivo" y haga clic en "Guardar gráficos ... '. Seleccione el formato deseado y guardar la imagen. Como alternativa, la imagen seleccionada se pueden transferir mediante las herramientas de copiar y pegar.
- Repita los pasos 7.6 y 7.7 para todas las imágenes de interés.
- Quantifregiones discretas ying
- Para activar las herramientas de ROI, vaya a la pestaña, 'paquetes' 'Análisis' y seleccione 'Procesamiento de Imágenes'.
- Seleccione la imagen deseada y vaya a la pestaña "Imagen" y haga clic en "retorno de la inversión ...". Haga clic en "Inicio ROI sorteo 'y utilizar una herramienta de dibujo para seleccionar una región de interés en la muestra. Para completar el dibujo, haga clic en "Finalizar retorno de la inversión".
- Para adquirir las estadísticas de la ROI seleccionada, vaya a la pestaña "Imagen" y haga clic en "Estadísticas ... '.
- Copiar y pegar los resultados en una hoja de cálculo separada. Repita la selección del retorno de la inversión (7.9.2) para todas las regiones y los elementos de interés.
Representative Results
Para demostrar las capacidades de este enfoque de formación de imágenes LA-ICP-MS, un sencillo experimento utilizando una única sección de un WT C57BL / 6 de cerebro de ratón, dividido en dos partes en el cuerpo calloso y seccionada en el plano coronal, se presenta. También se describe un flujo de trabajo para el análisis de datos utilizando Biolite (Figura 1), como se describe en las Secciones 6 y 7, así como para proporcionar una imagen representativa de la distribución del metal en la sección analizada (Figura 2).
Como se puede observar, la distribución de metal en el cerebro de ratón es variable de acuerdo con la región anatómica. Esto se puede atribuir a las funciones metales variables, y más específicamente las proteínas a las que están unidos, jugar en cada región del cerebro 27. Por ejemplo, el hierro tiende a tener concentraciones más altas en el cerebro medio y a lo largo del giro dentado, mientras que el zinc es más abundante en el cortiáreas de la LAC. Carbono, que es un patrón interno utilizado comúnmente 8, se distribuye homogéneamente. Mapas elementales (Figura 2) puede ser particularmente útil cuando se utiliza junto con los atlas de referencia anatómicos y funcionales existentes 29, donde la información sobre la colocalización de metales puede la expresión de proteínas específicas de unión a metal puede dar una idea de la función de los metales dentro de un cerebro región, o cambios en los niveles de metales en línea con una biomolécula relacionada con la enfermedad identificada. Utilizando el enfoque descrito, que está optimizado para una gama más amplia de analitos, se opone a la sensibilidad para los elementos de baja abundancia como el manganeso, y los métodos se pueden adaptar a concentrarse principalmente en este analito mediante el aumento de tiempos de permanencia a expensas de otras masas medidas.
La principal ventaja en el uso de imágenes por LA-ICP-MS es la observación de diferencias relativas en concentr metalesación y la distribución entre los grupos experimentales. Hemos utilizado anteriormente tal técnica para demostrar el aumento de hierro después de un insulto neurotoxina imitando PD 2, 10, y los cambios en los niveles de hierro en el tejido cortical de la enfermedad de Alzheimer humana 21. un protocolo tal como se describe aquí se puede adaptar fácilmente a cualquier otro tipo de tejido con modificaciones mínimas a los métodos enumerados.
Figura 1: Flujo de trabajo para procesamiento de imágenes. Flujo de trabajo complementaria a las secciones 6 y 7, que representan la conversión de los datos en bruto vez resueltos de la ICP-MS de imágenes cuantitativas de distribución de metal en el cerebro del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 2: Distribución típica elemental del Biometals dentro de un cerebro de ratón. Los mapas de elementos representativos de una sección coronal de 30 micras de espesor de un solo hemisferio cerebral de ratón analizadas con LA-ICP-MS. Imágenes en el carbono 13 (C13), magnesio-24 (MG24) y el fósforo-31 (P31) que se muestran en las escalas de oro de color (cuentas por segundo; CPS) (fila superior). Imágenes cuantitativas (fila inferior) para el manganeso-55 (MN55), el cobre-63 (Cu63), hierro-56 (Fe56) y zinc-66 (Zn66) muestran con sus correspondientes escalas de color BlueHot (mg g-1). El tiempo total de análisis para la sección de cerebro fue de aproximadamente 5 h. Barra de escala = 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
metales de imagen en tejido neurológico es sólo un ejemplo de cómo este protocolo puede proporcionar información útil sobre la distribución y las cantidades de los metales en cualquier matriz biológica. Aunque la preparación de materiales de referencia estándar puede ser arduo, es un experimento que se puede realizar de una vez archivada para su uso posterior.
LA-ICP-MS tiene ciertas ventajas sobre los métodos alternativos, como la microscopía de fluorescencia de rayos X basada en sincrotrón, sobre todo en términos de accesibilidad y sensibilidad. Sin embargo, hay ciertas desventajas que deben ser considerados al preparar un experimento utilizando LA-ICP-MS, y como tal, a menudo es una técnica complementaria útil para formación de imágenes químico que incluye técnicas de análisis de metales alternativos, así como histoquímica comparativo 5.
La alineación con las características anatómicas conocidas del cerebro del ratón puede proporcionar información útil sobre la posible relati funcionalonship entre los niveles de metal y distribución espacial. Anteriormente, hemos utilizado el recurso en línea Allen Atlas del Cerebro, 29, que es un repositorio de acceso abierto de los dos datos de expresión anatómicas y genéticas en los C57BL / 6 cerebro de ratón para examinar la correlación espacial de ambos expresión de la enzima dependiente de metal 14 y neuroanatomía 27, 30. Otros recursos, como el banco de trabajo del cerebro del roedor 31 también están disponibles para ayudar con el registro y alineación de las imágenes de metal para ayudar en la identificación correcta de distribución de metal en frecuencia pequeñas regiones anatómicas.
Las aplicaciones de esta técnica son útiles en la evaluación de los niveles de la forma de metal y el cambio de distribución a la microescala a lo largo de ambos eventos normales de la vida (por ejemplo, envejecimiento) y en estados de enfermedad; así como el estudio de los efectos de ambos compuestos que contienen metal y fármacos diseñados para me objetivoTal metabolismo. Las corrientes principales limitaciones de LA-ICP-MS como una técnica de imagen para evaluar espacialmente distribución de metal son el rendimiento y la sensibilidad. Hay un compromiso entre la velocidad de análisis y resolución espacial 5, 12, con imágenes de mayor resolución requieren tiempos de análisis más prolongados. La técnica se adapta bien a elementos biológicos a concentraciones más altas, aunque elementos tales como manganeso, cobalto y selenio están restringidos debido a su baja abundancia en el tejido y / o limitaciones normal en su detección por convencional ICP-MS. Los nuevos avances en la tecnología ICP-MS, tales como la introducción de analizadores de masas de triple cuadrupolo, permiten la detección selectiva de analitos difíciles, como el selenio 32 a sensibilidades más altas 33. Como un procedimiento basado en la tecnología, los avances en el diseño tanto de láser y espectrometría de masas verá esta técnica de formación de imágenes siguen evolucionando, aumentandola velocidad de análisis y la sensibilidad 34.
Acknowledgments
DJH y PAD son apoyados por un proyecto de Consejo de Investigación Australiano Enlace (LP120200081) con Agilent Technologies Ltd. y ESI La contribución de BK fue apoyada por la Escuela de Investigación PLUS Universidad del Ruhr, financiado por la Iniciativa de Excelencia de Alemania [DFG GSC 98/3]. DJH fue parcialmente apoyado por la Fundación Ramaciotti. KK es apoyado por la Fundación Sigrid Juselius.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soda glass microscope slides | n/a | n/a | Typical slides are suitable for all experiments |
| PTFE-coated microtome blades | C.L. Stuckey | DT315R50 | Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering. |
| Parafomaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | Any supplier suitable |
| Sucrose | n/a | n/a | Commercial grade white sugar is suitable |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5368 | Premixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 247624 | Any supplier suitable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Any supplier suitable |
| Lamb brain | n/a | n/a | Available from most local butchers |
| Metal salts | n/a | n/a | Use water soluble metal salts containing desired analytes |
| Omni TH Tissue Homogeniser | Omni Inc | THP115 | Alternative homogenizers are suitable |
| Polycarbonate homgenizer probes | Omni Inc | TH115-PCRH | |
| Microwave digestion unit | n/a | n/a | Optional. See Section 2 |
| 1.5 mL microfuge tubes | TechnoPlas | P4010 | Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable |
| 65% nitric acid | Merk Millipore | 100441 | Trace analysis grade |
| 30% hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 95321 | Trace analysis grade |
| 10 x 10 mm disposable cryomolds | Ted Pella | 27181 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 76871 | |
| Liquid nitrogen | n/a | n/a | Use local supplier |
| NWR213 Laser Ablation system | ESI Ltd | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Agilent 8800 Series ICP-MS | Agilent Technologies | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Iolite | Iolite Software | n/a | Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol |
| Excel | Microsoft | n/a | |
| IGOR Pro | Wave Metrics | n/a | Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm |
References
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