Protocol
1. Utarbeidelse av dyrkingsmedium og Retter (10 min)
- Tilsett 100 ul av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) til brønnene i en 96-brønners V-bunn plate.
- Ta en pre-porsjonert-hetteglass med ca. 100 mL av semisolid matrise fra 20 ° C fryser og plassere den direkte på is.
MERK: Gjør dette før rygg root ganglion (DRG) avling fordi halvfast matrise tar ca 30 min å nå flytende tilstand på is, noe som er nødvendig for de påfølgende trinn. Unnlatelse av å holde semisolid matrise på isen hele tiden vil resultere i et dårlig kvalitet matrise dråpe. - Etikett glass-bunn kulturer plater med permanent blekk, noe som skaper unike identifikatorer i hvert av de fire hjørnene på undersiden av platen. Plasser platene høyre side opp på is for å kjøle platen overflaten.
MERK: Hver mus gir 32 - 40 DRG, så merke dem fra 1 til 40. Det er ikke nødvendig å forhåndskjøle pipet tips, som kjølte tips vil varme i løpet av å plassere matrisedråper, potensielt innføre forskjeller i matrisen konsistens.
2. Disseksjon av murin DRG (45 min)
- Avlive en atymiske nakne mus i henhold til spesifikke laboratorie protokoller, for eksempel ved bruk av en CO to kammer og en torakotomi.
- Sett opp disseksjon området og mikroskop. Bruk ren, sterilisert, og flat underside av polystyren beholdere for 15- eller 50-ml koniske rør.
NB: I tillegg er de egnet for bruk som dissekere overflate, som de er rimelige, engangs, og gir mulighet for fiksering av ryggraden ved hjelp av tapper eller nåler. Bruk bare steriliserte instrumenter og nåler. - Under naturlige visjon, lag et langsgående snitt langs ryggsøylen fra roten av halen til hodet av musen med et par rette eller buede gode saks.
- Bruk samme saks til tvers skillet under sacral ryggraden. Dissekere begge sider av ryggraden helt opp til skallebasis ved hjelp av saksen. På dette punktet, at nakkesøylen er transected kranialt så langt som mulig med en saks.
- Observer cervical enden av ryggsøylen under operasjonsmikroskop ved lav effekt. Den hvite ryggmarg er synlig i midten av en benete ring, som er omgitt av variable mengder av paraspinal muskler og vev.
- Splitte rygg eller ordnet aspekt av de første 2 - 3 ryggvirvel organer med mikroskopiske våren saks. Ved hjelp av fjærvirkningen av saksen, åpner denne første bony skåret for å sikre at den vertebrale legemet disseksjon skjedde på midtlinjen. Fortsett i små trinn mot den sakrale ryggraden, og deretter halvere ryggraden ved å fullføre de samme kutt på baksiden eller mindreverdig del av ryggvirvel organer.
MERK: Hvis du ikke sikre midtlinjen disseksjon av den benete ryggsøylen vil resultere i en lavere DRG yield. - på this punktet, er ryggsøylen delt i to halvdeler. Plasser en hemi-ryggraden til side, med ryggmargen på plass og vendt ned på et sterilt plate.
MERK: Hvis du lar ryggmargen på plass vil hindre at DRG tørker ut, som DRG er dypt til ryggmargen. - Fest hver ende av den andre hemi-ryggraden med to 18-gauge nåler på polystyren dissekere plattformen. Fra den cervikale ende (som er tydelig fordi ryggraden er smalere, DRG-er nærmere hverandre, og det er ribbe insersjoner), forsiktig skallet tilbake i ryggmargen fra ca 4 ryggvirvelnivåer.
- Observer sensoriske nerver (vanligvis to) forbinder DRG. I området hvor nervene setter til DRG, forsiktig tak rundt konseptet med mikroskopiske tang. Dissekere og trim dette konseptet og andre nervevev med mikroskopiske våren saks for å frigjøre DRG. Lett tilbaketrekking vil bringe DRG ut av sin posisjon i den benete ryggsøylen.
MERK: Økemikroskop kraft på dette trinnet er gunstig. Knus skade på DRG vil vesentlig begrense veksten av neurites. Dette unngås ved aldri å ta tak i DRG direkte, men heller ved å ta tak rundt konseptet. - Kutt perifer nerve (DRG generelt har en perifer nerve, som er dypt forhold til dissekere visning) med mikroskopiske våren saks for å frigjøre DRG.
MERK: Det er lettest å finne ut hvor nerveendene og DRG begynner mens på spenning, så gjør dette kuttet så nært som mulig til DRG på dette punktet er ideell. Når denne ytre gren er kuttet, blir de proksimale grenene trimmet i tillegg. - Trim DRG av noen streif nervefibre eller fascial utstyr sammen med den mikroskopiske våren saks. Etter at tilstrekkelig isolasjon, legger DRG inn i rom-temperatur medium i 96-brønners V-bunn plate.
MERK: Å plassere en mørk bakgrunn under platen gjør visualunder mm hvite DRG enklere. Bare plassere en DRG i EACh godt; på denne måten, kan de gjøres rede for lettere i de etterfølgende trinn. - Gjenta denne fremgangsmåten helt ned en hemi-ryggraden og deretter den andre. Hver side gir 16 - 20 DRG, totalt 32 - 40.
MERK: Hvis det er færre DRG enn dette, disseksjon av ryggraden må gjennomføres ytterligere cephalic og / eller caudally. De DRG blitt stadig mindre vel definert som en forløper kaudalt.
3. Utarbeidelse av harde Matrix Dråper (<1 min per plate)
- Fjern ett glass godt bunnplaten fra is og plassere den på en isblokk under operasjonsmikroskop. Kontroller at delmengde av matrise forblir på is til alle tider.
- Plasser en 1,5-ul dråpe av matrisen i hvert av de fire hjørnene av glassbunnplaten med en 2-ul eller 10-ul micropipetter, og etterlater en avstand minst så stor som den dråpe seg fra kanten av glasset brønnen.
- Plassere spissen av pipetten direkte påglasset i en 45-graders vinkel. Sakte pipettér matrisen. Sakte bevege seg bort fra glassbunn etter at matrisen er i inngrep på plate.
MERK: overflatespenningen mellom matrisen og glass bør lage en perfekt halvkule hver gang. - Stoppe pipettering like før spissen er tom, på grunn utilsiktet injeksjon av luft inn i matriksen dråpe gjør diameteren av matrisen dråpe langt større, og er vanskelig å fjerne.
MERK: Ved hjelp av en annen hånd for å stabilisere pipettering hånd forenkler mer nøyaktig plassering.
- Plassere spissen av pipetten direkte påglasset i en 45-graders vinkel. Sakte pipettér matrisen. Sakte bevege seg bort fra glassbunn etter at matrisen er i inngrep på plate.
4. Innsetting av DRG i harde Matrix Dråper (<2 min per plate)
- La platen med matrise dråpene kort ved romtemperatur (~ 1 min). Dette avstiver litt matrisen, noe som gjør det lettere for den nøyaktige plassering av DRG.
- Scoop (ikke tak) DRG forsiktig med lukkede mikroskopiske tang i venstre hånd. Igjen, en mørk bakgrunn mot små, hviteDRG visualisering. Overfør DRG til spissen av en 21-gauge nål i høyre hånd. Denne overføringen vil forlate restmateriale på tang.
- Forsiktig inn DRG inn i midten av matrisen dråpene ved hjelp av en 21-gauge nål (figur 1). Mesteparten av tiden, vil den DRG lett slipper inn i matriksen, og deretter kan plasseres sentralt med nålen.
- Hvis DRG holder seg til nålen, bruker mikroskopiske tang for å presse DRG ut av nålen og inn i matrisen dråpe. Wick bort overflødig utskriftsmateriale fra mikroskopiske tang med en lab tørke.
MERK: presenterer media til matriksen vil forandre diameteren, volumet, og konsistensen av analysen. En isblokk med farge eller farget gir skriftlig bakgrunn kontrast, noe som letter visualisering av denne delikate prosessen.
- Hvis DRG holder seg til nålen, bruker mikroskopiske tang for å presse DRG ut av nålen og inn i matrisen dråpe. Wick bort overflødig utskriftsmateriale fra mikroskopiske tang med en lab tørke.
- Etter at platen har alle fire DRG, utføre en avsluttende inspeksjon for å sikre at DRG er i sentrum av matrisen dråpe. Foreta justeringersom nødvendig med 21-gauge nål.
- Overfør den ferdige plate til en 37 ° C inkubator. Dette vil størkne semisolid matrise og fikse DRG i posisjon.
- Gjenta denne prosessen for alle DRG. Plassere tomme matrise dråper uten en DRG som den negative kontroll.
- Tilsett 4 ml DMEM med 10% FBS media til hvert glass-bunnplaten etter at alle platene, og utsette dem for en 37 ° C inkubator i minst 3 min. Sett platen på skrå og sakte legge til medium, slik at det etter hvert kommer i kontakt med matrise-DRG-enheter.
MERK: Hvis mediet er lagt for fort eller kraftig, matrisen og / eller DRG kan komme ut av stilling. - Oppbevar analyser i 37 ° C inkubator i de neste 48-72 timer.
MERK: Periodisk undersøkelse av analysene viser rundtgående utvekst av neuritter mot matrisekanten (figur 2). Når neuritter større enn tre fjerdedeler av veien til matriksen, dener passende til plate cellene.
5. Utarbeidelse av hode og nakke kreft celler
MERK: annet enn hode og nakke plateepitelkarsinom celler Cellelinjer kan brukes i denne eksperimentelle design.
- Oppretthold plateepitelkarsinom cellelinjer i DMEM med 10% FBS i foretrukne flasker eller kultur retter i en 37 ° C inkubator. For å fremstille celler for eksperimentering, suging alt mediet fra kulturflaske eller fatet og vasker den to ganger med PBS. Suspendere cellene ved å tilsette en passende mengde av 0,025% trypsin i 5 min, etterfulgt av DMEM med 10% FBS. Pipetter 4 ml av cellen og mediet blandingen i 6 ml kulturskåler.
MERK: En 6-ml dyrkingsplate gir mer enn nok celler, selv om mindre enn 50% sammenflytende. - Utsett HNSCC cellelinjer til ulike forhold 24 timer før farging og plating på DRG-analysen. Re-dose tilstanden når cellene blir sådd ut for å opprettholde en konsistent environment.
MERK: Legg antistoffer, vekstfaktorer, cytokiner eller andre molekyler til cellekulturskåler 1 - 2 dager etter mus disseksjon og implantasjon av DRG inn i matriksen. - Legg fluorescerende celle flekker en time før plating cellene (2 - 3 dager etter DRG høsting og implantering i matrisen).
MERK: De spesielle flekker som brukes her passere fritt gjennom cellemembranen; imidlertid, etter å ha reagert med intracellulære tiolgrupper, forblir flekken inne i cellen og føres videre til datterceller. Flekker blir enklere visualisering innenfor analyser. Disse midlertidige flekker er ideell for disse analysene fordi fluorescens er til stede for 2 - 3 dager, som er tidsrammen for disse eksperimentene. Det tillater også for bruk av mange forskjellige farger, og unngår behovet for å skape fluorescerende protein-transfekterte cellelinjer.- Forbered 10 uM av fargestoff oppløsning ved å blande 2 pl av 10 mM lagercelle flekker i 2 ml serumfritt DMEMfor hver celle tilstand. Varm dette til 37 ° C før du legger det til cellene.
- Fjerne kulturmediet i løpet av den seks-mL plate, slik at den adherente HNSCC cellene på plate. Tilsett 2 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) og fjerne 2 ml av 10 uM celle flekk / serumfritt DMEM tilsatt til hver plate
- Returnere 6-ml dyrkingsplate med celle flekken til 37 ° C inkubator i 40 min.
- Etter 40 min, aspirere mediet. Tilsett 2 ml PBS og deretter suge den. Tilsett 1 ml av 0,025% trypsin i hver plate, og erstatte dem i 37 ° C inkubator.
- Tilsett 2 ml DMEM med 10% FBS etter fratrekk av 3 - 5 minutter og overføre de suspenderte cellene til en 15 ml konisk rør. Spinn-celler og resuspendert dem opp i 1 ml DMEM med 10% FBS.
- Telle celler med en hemocytometer eller automatisert celleteller, og deretter legge DMEM med 10% FBS å skape en endelig cellekonsentrasjon på 300.000 celler per ml.
6. Plating Head and Neck kreftceller
- Fjern glassbunn plater med matrise-DRG essay fra inkubatoren.
MERK: Igjen, er de hensiktsmessig når neuritter er minst 75% av veien til kanten av grunnmassen, noe som vanligvis skjer etter 2 - 3 dager. Dette fremgår best ved hjelp av i det minste et 10X objektiv. - Aspirer medium i glassbunnplaten. Aspirer mediet i glasset godt uten å fjerne matrise-DRG-enheter.
- Tegn opp 200 mL av 300.000 celler / ml medium ved hjelp av en 200-mL pipette. Plassere to dråper av cellene over hver matrise-DRG-analyse. Utfør dette trinnet for hver matrise dråpe, skaper fire ganger i hver celle tilstand på en plate.
NB: Den hemisfæriske formen av matrisen gjør det mulig for cellene å slå seg ned i en ring langs periferien av analysen (figur 3a, figur 3b). Finne en pipette med en jevn trigger gjør plassering av uniform faller langt enklere. - Bekreft lignende celle tall og distribution av de forskjellige celle forholdene under 4X mikroskopi.
- Plasser glassbunn platene inn i 37 ° C inkubator for ca 60 min. MERK: Selv om det bare er et lite volum av celler og media (~ 150 ul), må analysene ikke tørke ut før flere timer inkubator tid har forløpt.
- Etter 60 minutter, tilsett 4 ml DMEM med 10% FBS langs sideveggen av glassbunnplaten.
NB: I løpet av en periode av tid, cellene delvis holder seg til platen bunn, og fremgangsmåten for tilsetning av mediet ikke forstyrrer cellene. Ulike celletyper kan ta mer eller mindre tid til å begynne å følge den glassbunnplaten. - Erstatte eventuelle eksogene medikamenter eller vekstfaktorer på denne tiden for å opprettholde de tidligere konsentrasjonsnivåer.
- Returner assayene til 37 ° C inkubator, bortsett fra når de blir undersøkt mikroskopisk. Kvantifisere resultatene av denne analyse ved mikroskopisk avbildning. Kort, telle tråder av perinevral invasjon medi fire kvadranter bruker en 4X mikroskopisk bilde.
MERK: En mikroskop med en 4x objektive og fluorescens evner er tilstrekkelig for foto-dokumentere analyser. Størrelsen av analysene passer fint innenfor en 4x objektiv, som er detaljert nok til å fange opp de enkelte områder av perinevral invasjon. Perinevral invasjon blir tydelig i løpet av 24 timer, men lenger enn 48 timer, integriteten av analysene begynner å svekke, som tumorcellene deler langs periferien av matrisen og invadere. Lenger enn 48 timer, er det også vesentlig utstrømning av fibroblaster fra DRG, som tilslører visualisering ved hjelp av lysfelt-mikroskopi. Derfor er det tilrådelig å foto-dokument resultatene med 4X mikros minst to ganger i løpet av dette vinduet (som ved 24 og 48 timer etter utplating tumorcellene). Vær oppmerksom på at disse er tre-dimensjonale analyser, og det er vanskelig å fullstendig bilde av hele analysen. Mest perinevral invasjon forekommer i et plan fra undersiden av platen, hvor than cellene er innleiret i matriksen litt over bunnen av platen. Fordi dette plan er nær horisontal, er det store flertallet av neuritter med tumorceller er fanget i et enkelttrinns bilde ved 4X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter disseksjon av DRG og plassering i matrisen dråpe, bør utseendet av analysen ligner figur 1. Merk at DRG-er ikke er helt rund, men den er sentrert inne i matriksen dråpen. Dette gjør det mulig for den utvekst av neuritter i 360 grader, som er vist delvis i figur 2. Vær oppmerksom på at enkelte deler av DRG sende ut neurites raskere og i større antall enn andre, vanligvis tilsvarer hvor efferent og afferente nervegrener angitt og avsluttet DRG, henholdsvis. Vi står for dette og for størrelsesforskjeller mellom DRG ved tilfeldig plating på DRG i grupper på fire og deretter tilfeldig tildeling av en gitt plate til hver celle tilstand.
Som beskrevet ovenfor, plate vi HSNCC cellelinjene når neuritter er forlenget i det minste ¾ av veien til kanten av grunnmassen, noe som er typisk i størrelsesdag 3. De tilsatte cellene danner en rundtgående ring rundt hele matriksen (Figur 3a). Vi deretter fotografere analyser på dag 4 (figur 3b) og dag 5 (figur 3c). Cellelinjen vises her (Fadu) demonstrerer en over gjennomsnittet muligheten til å spore langs neurites. Den SQCCY1 cellelinje som vist i figur 4, men viser liten eller ingen tilbøyelighet til å invadere analysene.
Når du bruker en ny cellelinje, er det importere å utnytte flere negative kontroller for å undersøke hvordan den aktuelle cellelinjen oppfører seg rundt analysen. Først plate cellene rundt en "blank" analysen består av matrise alene (figur 5). Alle cellelinjer som vårt laboratorium har undersøkt aktivt deler seg rundt grunnmassen, men ikke inn i eller strekker seg over toppen av matrisen. Når overdreven celler blir igjen på toppen av matrisen, kan det være en betydelig vekst matrisen. Dette understreker behovet for å sende eONTROLLER at så mange celler falle til periferien av matrisen som mulig, i stedet for å være igjen for å hvile og dele på toppen av matrisen. Dette kan gjøres ved å banke på platene før cellene holder seg eller ved å pipettere små mengder media direkte på toppen av matrisen dråpe når cellene har begynt å følge glassplaten.
En andre negativ kontroll, karakterisert ved at cellene blir sådd ut på den samme dag som den DRG er plassert inne i matriksen, kan kjøres. Målet med denne tilnærmingen er å vise at det ikke er en neurotropisk tiltrekning som driver cellene til DRG, men snarere at nærværet av neuritter er obligatorisk. Videre, når tumorcellene har oppholdt seg langs periferien av matrisen til mer enn 2 dager, blir matrisen kant utydelig. Matrisen deretter begynner å løfte av av glassbunn og kan bli funnet frittflytende i media kort tid etterpå. Av denne grunn, denne protocol beskriver plating de HNSCC cellene en gang de neuritter har utvidet 75% av avstanden til kanten av grunnmassen.
Det finnes utallige muligheter for å kvantifisere resultatene av det er visuelt veldig tydelige forskjeller mellom analyser. I en slik fremgangsmåte blir bilder av analysene delt i fire kvadranter med en vertikal og en horisontal linje (figur 6). Ett punkt er tildelt for hver kvadrant som har minst én rad av PNI. Dersom PNI strekker seg utover 50% av veien fra kanten av matrisen til DRG, blir deretter 2 poeng tilordnet stedet. På denne måten en score på 0 - kan åtte poeng tildeles. Den store fordel med dette systemet er at analysene som har for mange PNI enheter for å telle hurtig kan vurderes. En ulempe er at den ikke tilstrekkelig uttrykke graden av PNI (dvs. en kvadrant med en neurite med invasjon 100% av avstanden til den DRG mottar den samme stillingen (2) som en quadrant med 10 tilsvar-invaderte neurites). Sammenligning av lysfelt og fluorescerende bilder gjør dette systemet veldig enkelt, selv med betydelig fibroblast utstrømming.
Eksempel scoring er vist i figur 6. Ved hjelp av denne fire-kvadranten scoring system for figur 3, 0 poeng, 2 poeng, og 7 poeng ble tildelt for paneler figur 3a, figur 3a og figur 3c, hhv. Figur 4 fikk en score på 2 poeng og 2 poeng i paneler Figur 4a og 4b, henholdsvis. Dataene i Tabell 1 viser resultatene av flere eksperimenter ved hjelp av cellelinjer Fadu og SQCCY1. Merk at selv med et begrenset karakterskala som dette, er statistisk signifikante forskjeller i gjennomsnittsfirekvadrant score lett innhentet ved hjelp av uavhengige utvalg t-test.
Figur 1. DRG-matrise analysen. Korrekt plassering av dorsale ganglion i matrisen dråpe, vist med lysfelt mikroskopi på 4X. Scale bar representerer 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. utvekst av neurites. Neuritter er fraværende på dag 0 umiddelbart etter plassering av DRG i matrisen dråpe (A). Etter dag 1 (B), er neurittutvekst tydelig på 10X på lysfelt mikroskopi. Neurite vekst fortsetter på dag 2 (C) og dag 3 (D); Vær imidlertid oppmerksom på utstrømningen av fibroblaster. Scale bar representerer 0,1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. DRG-matrise analysen med Fadu. Hode og hals plateepitelkarsinom linjen Fadu lagt perifert rundt en analyse på dag 3 (A), som vises i grønt fluoriserende og lysfelt mikroskopi på 4X Progressive nevrale invasjon blir sett på dag 4 (B) og dag 5 (C). Scale bar representerer 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. DRG- matrise analysen med SQCCY1. Hode og hals plateepitelkarsinom linje SQCCY1 lagt på dag 4 (A), vist i lysfelt og grønt fluorescerende mikroskopi på 4X. Merk at denne cellelinjen er ikke så dyktig på perinevral invasjon som Fadu, selv etter dag 5 (B). Scale bar representerer 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Matrix-analyse med Fadu. Hode og hals squamous cell carcinoma cellelinje Fadu lagt rundt en matrise dråpe uten en DRG på dag 3. lysfelt og grønne fluorescerende mikroskopi (4X) som vises på dag 4 (A). Legg merke til at kreftceller ikke angir matrisen eller vokse over toppen av det, selv etter dag 5 (B). Scale bar representerer 1 mm.TTP: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Fire-kvadranten Metode for analyse Kvantifisering. Ett punkt er tildelt for hver kvadrant med en PNI mindre enn 50% av avstanden fra kanten av matrisen til DRG. 2 poeng tildeles når PNI strekker seg utover 50%. Det første eksempelet (A) vil få en score på 5 (1 poeng for hver kvadrant for en PNI mindre enn 50%, bortsett fra nederst til høyre, som har en PNI strekker seg utover 50%, hvor 2 poeng er scoret). Det andre eksemplet (B) er scoret som et 8 (en PNI utover 50% i alle fire kvadranter). Scale bar representerer 1 mm. Klikk her for å vIEW en større versjon av dette tallet.
| cellelinje | n | dag 4 | SD | P-verdi | dag 5 | SD | P-verdi |
| Fadu | 24 | 2,88 | 1,42 | Ref | 6,04 | 0,35 | Ref |
| SQCCY1 | 20 | 0,60 | 0,60 | <0,001 | 1.05 | 0,17 | <0,001 |
Tabell 1. Sammenligning av PNI Mellom Fadu og SQCCY1. Bety fire-kvadrant Stillingen som er vist i figur 6 mellom cellelinjer Fadu og SQCCY1 ved 24 timer (dag 4) og 48 timer (dag 5) etter at cellene ble platet rundt DRG-matrisebestemmelses. Sammenligninger er gjort ved hjelp av uavhengige samPLE t-test og presentert med standardavvik (SD) og P-verdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
De viktigste trinnene i denne protokollen er nøyaktig disseksjon og utvinning av ryggmargen. Riktig tran av ryggsøylen og et midtlinje-langsgående inndeling i to hemi-pigger er avgjørende for å oppnå et stort antall DRG. Under disseksjon av enkelte DRG, bør ganglion aldri bli håndtert direkte, men heller de omkringliggende fascia bør gripes med mikroskopiske tang. Unnlatelse av å gjøre dette vil resultere i en klemskade av DRG, noe som sannsynligvis den viktigste årsaken til fiasko for neurittutvekst. Det er langt bedre å under-trimme de omkringliggende nevrale vev under disseksjon enn å risikere over håndtering av DRG og skaffe ingen neurite vekst i analysen.
Modifikasjoner og feilsøking
Den eksperimentelle protokollen som er beskrevet ovenfor, gjenspeiler den optimale oppfylthodology etablert fra et stort antall prosedyre justeringer som er gjort over flere år. Oppført direkte under tilsvarende trinn i protokollen delen er en rekke notater og fallgruver som resulterte fra erfaringer fra forfatterne når du bruker denne metoden. Gitt antall skritt involvert, det er faktisk mange modifikasjoner som kan gjøres til denne protokollen ved fremtidige etterforskere. Som erfaring med disse endringene vokser, er det forventet at ytterligere hjelp av feilsøking vil bli utviklet i henhold til preferansene til den undersøkende team.
Begrensninger av teknikken
Det er tre store begrensninger i denne teknikken. Den første er at meget fine neuritter benyttes som et surrogat for stor nevrale invasjon, som er det patologer observere i tumorprøver. Det er ikke kjent hva rolle neuritter, i motsetning til neuroner, er in vivo, fordi identifisere perineuriteinvasjon er utover egenskapene til en rutinemessig histopatologisk eksamen. For det andre er perinevral invasjon en form av bløtvevet invasjon som kanskje ikke bare innebære tumorceller og en tilstøtende neuron, som er simulert i denne analysen. Som sådan, eksogene faktorer innfødt til in vitro svulst miljøet mangler i denne analysen. Til slutt blir den tidsperioden i løpet av hvilken PNI kan studeres begrenses til ca 48 timer på grunn av en kombinasjon av fibroblast effluks og tap av integritet matrise. På denne måten vil cellelinjer som er effektive på nevrale invasjon, men er treg dele og / eller invaderende bli savnet, og antas å ikke være dyktigere på PNI.
Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder
Så vidt vi vet, er dette den eneste in vitro modell for tiden tilgjengelig for å undersøke PNI i HNSCC. Gitt hvor ofte PNI oppstår i HNSCC og begrenset kunnskap om mekanismer somfor tiden eksisterer, denne fremgangsmåte er fordelaktig av flere grunner. Først, den har en svært høy suksessrate og utmerket reproduserbarhet. Den totale tid eksperimentet er også forholdsvis kort sammenlignet med lignende protokoller 12,17-19. Til slutt, med det store antallet av analyser som kan genereres fra en enkelt mus, mange forhold kan testes med vitenskapelig passende replikater. Kombinasjonen av disse faktorene gjør det mulig å hurtig vurdering av mange forskjellige forhold med konsistente resultater.
På samme tid vil den høye kvaliteten av analysen gir en mer detaljert undersøkelse av interaksjonen mellom tumorceller og de neuritter. Bruk av levende celle bildebehandling sørger for styrkingen av neurittutvekst prosessen og HSNCC celle invasjon i time-lapse video form. Tilsetning av fluorescently-farget celler skaper veldig klar differensiering mellom kreftceller og bakgrunnsmateriale, slik som fibroblaster og tett neurite outgrowth (som auto-fluorescerer rødt). Enten følger denne protokoll eller de som er beskrevet av andre, er denne generelle eksperimentell design i sin relative barndom, og det er langt fra en gullstandard for in vitro studie av PNI. Av disse grunner, desto mer nærmer seg til denne analysen som er beskrevet i detalj, jo større er muligheten for den samarbeidende utvikling av en ideell metode.
Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken
Akkurat som det er flere ulike tilnærminger til å sette opp analyser, er det flere måter å måle resultatene. I teksten ovenfor, ble en enkel metode for hurtig å kvantifisere graden av perinevral invasjon i hver analyse presentert. Dette er ideelt for screening effekten av mange ulike veier på PNI, særlig gitt at man kan isolere 32 - 40 DRG per mus. Det finnes en rekke avanserte bildeteknikker for å vurdere PNI,herunder mengden av fluorescens innenfor et gitt område, avstand og hastighet på celle invasjon, og den rå antall av celler i analysen. Når den dynamiske delen av eksperimentet er ferdig, kan cellene i analysen og / eller supernatanten også oppsamles for videre molekylær analyse.
Dette eksperimentell metode gir mulighet til å belyse mekanismene som er involvert i PNI av HNSCC og andre kreftformer. Denne kunnskapen kan drive utvikling av legemiddel å målrette de samme veiene som PNI, som på det nåværende tidspunkt, er mangel på HNSCC. Spesifikk målretting av PNI er identifisert som en bivirkning patologisk funksjonen kan potensielt eliminere behovet for uspesifikke adjuvant behandling, for eksempel strålebehandling og kjemoterapi, som i dag benyttes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES | Corning Cellgro | 10-090-CV | Manassas, VA |
| Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11150 | Flowery Branch, GA |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies Corporation | 25200056 | Grand Island, NY |
| Phosphate buffered Saline 1x | Corning | 21-040-CM | Manassas, VA |
| Matrigel hESC-Qualif Mouse | Corning Incorporated | 354277 | Bedford, MA |
| Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Ashland, MA |
| SteREO Discovery.V8 Operating Microscope | Carl Zeiss Microimaging | 495015-0021-000 | Thornwood, NY |
| Schott ACE I light source | Schott | A20500 | Germany |
| CellTracker | Life Technologies Corporation | C2925 | Carlsbad, CA |
| BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G | BD | 305195 | Franklin Lakes, NJ |
| Premium Microdissecting Tweezer | Harvard Apparatus | 60-3851 | Holliston, MA |
| Premium Fine Operating Standard Scissors | Harvard Apparatus | 52-2789 | Holliston, MA |
| Premium Spring Scissors | Harvard Apparatus | 60-3923 | Holliston, MA |
| Dressing Forceps | Harvard Apparatus | 72-8949 | Holliston, MA |
| Athymic nude mice (002019) | Jackson Laboratory | 002019 | Bar Harbor, ME |
References
- Jemal, A., et al.
- Hinerman, R. W., et al. Postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity: 35-year experience. Head Neck. 26 (11), 984-994 (2004).
- Rahima, B., Shingaki, S., Nagata, M., Saito, C. Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 97 (4), 423-431 (2004).
- Woolgar, J. A., Scott, J. Prediction of cervical lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue/floor of mouth. Head Neck. 17 (6), 463-472 (1995).
- Tai, S. K., et al. Treatment for T1-2 oral squamous cell carcinoma with or without perineural invasion: neck dissection and postoperative adjuvant therapy. Ann Surg Oncol. 19 (6), 1995-2002 (2012).
- George, D. L., et al. Nosocomial sinusitis in patients in the medical intensive care unit: a prospective epidemiological study. Clin Infect Dis. 27 (3), 463-470 (1998).
- Fagan, J. J., et al. Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (6), 637-640 (1998).
- Soo, K. C., et al. Prognostic implications of perineural spread in squamous carcinomas of the head and neck. Laryngoscope. 96 (10), 1145-1148 (1986).
- Parsons, J. T., Mendenhall, W. M., Stringer, S. P., Cassisi, N. J., Million, R. R. An analysis of factors influencing the outcome of postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 39 (1), 137-148 (1997).
- Liao, C. T., et al. Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in pT1-3N0 oral cavity cancer with tumor-free margins and perineural invasion. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 71 (2), 371-376 (2008).
- Fan, K. H., et al. Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher recurrence rates. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 77 (4), 1024-1029 (2010).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach. Hum Pathol. 38 (2), 299-307 (2007).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer: a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374 (3), 442-447 (2008).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
- He, S., et al. GFRalpha1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (19), 2008-2017 (2014).
- He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
- Bakst, R. L., et al. Radiation impairs perineural invasion by modulating the nerve microenvironment. PLoS One. 7 (6), 39925 (2012).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion. J Vis Exp. (110), (2016).
