Protocol
1. Beredning av odlingsmedium och rätter (10 min)
- Tillsätt 100 mikroliter av Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) till brunnarna i en 96-brunnars V-bottenplatta.
- Ta en pre-alikvoteras-injektionsflaska med cirka 100 mikroliter av halvfast matris från 20 ° C frys och placera den direkt på is.
OBS: Gör detta före dorsala ganglion (DRG) skörd eftersom den halvfasta matrisen tar ungefär 30 minuter att nå flytande tillstånd på is, vilket är nödvändigt för efterföljande steg. Misslyckande med att hålla halvfast matris på is hela tiden kommer att leda till en dålig kvalitet matrisdroppe. - Etikettglasbotten kulturer plattor med permanent bläck, skapar unika identifierare i varje av de fyra hörnen på undersidan av plattan. Placera plattorna högra sidan uppåt på is för att kyla plattans yta.
OBS: Varje mus utbytena 32-40 DRG, så märka dem från ett till 40. Det är inte nödvändigt att i förväg chill pisällskapsdjur tips, som kylda tips kommer att värma under loppet av placera matris droppar, potentiellt införa skillnader i matris konsistens.
2. Dissekering av murin DRG (45 min)
- Avliva en atymiska nakna mus enligt specifika laboratorieprotokoll, till exempel genom användning av en CO 2 kammare och en torakotomi.
- Ställ in dissektion området och mikroskop. Använd ren, steriliserad och platt undersida behållare polystyren för 15- eller 50-ml koniska rör.
OBS: Dessutom är de lämpliga för användning som dissekera ytan, eftersom de är billiga, engångs, och möjliggöra fixering av ryggraden med användning av stift eller nålar. Använd endast steriliserade instrument och nålar. - Under naturliga vision, göra en längsgående snitt längs ryggraden från svansroten till huvudet av musen med ett par raka eller krökta fina saxar.
- Använd samma sax för att transversellt dela nedanför sacral ryggraden. Dissekera båda sidor av ryggraden ända upp till skallbasen med hjälp av sax. Vid denna punkt, se till att halskotpelaren är transected cranially så långt som möjligt med sax.
- Observera den cervikala änden av ryggraden under operationsmikroskop vid låg effekt. Den vita ryggmärgen framgår i mitten av en benig ring, som är omgiven av variabla mängder av paraspinala muskler och mjuk vävnad.
- Split rygg eller överlägsen aspekt av de första 2 - 3 kotkroppar med mikroskopiska våren sax. Med hjälp av fjäderverkan hos saxen, öppna denna initiala beniga skärs för att säkerställa att kotkroppen dissektion inträffade vid mittlinjen. Fortsätt i små steg mot sakrala ryggraden, och sedan bisect ryggraden genom att fylla de identiska nedskärningar på den ventrala eller sämre aspekt av kotkropparna.
OBS: Om du inte se mittlinjen dissektion av beniga ryggraden kommer att resultera i en lägre DRG avkastning. - vid this punkt, är ryggraden uppdelad i två halvor. Placera en hemi-ryggen åt sidan, med ryggmärgen på plats och nedåt på en steril platta.
OBS: Lämnar ryggmärgen på plats kommer att förhindra de DRG från att torka ut, eftersom DRG är djupa till ryggmärgen. - Fäst ena änden av den andra hemi-ryggrad med två 18-gauge nålar på polystyren dissekera plattformen. Börjar på halsänden (som är uppenbart eftersom ryggraden är smalare, DRG är närmare varandra, och det finns revben inser), försiktigt dra tillbaka ryggmärgen från cirka 4 vertebrala nivåer.
- Beakta sensoriska nerver (vanligtvis två) som förbinder DRG. I området där nerverna sätta till DRG, försiktigt tag i den omgivande fascia med mikroskopiska pincett. Dissekera och trimma denna fascia och andra nervvävnad med mikroskopiska våren sax för att frigöra DRG. Gentle indragning kommer att föra DRG ur sin position inom beniga ryggraden.
OBS: Ökamikroskop effekt vid detta steg är fördelaktigt. Krossa skada DRG kommer att avsevärt begränsa ökningen av neuriter. Detta undviks genom att aldrig ta tag i DRG direkt, utan snarare genom att greppa de omgivande fascia. - Skär perifer nerv (DRG har i allmänhet en perifer nerv, som är djupt i förhållande till dissekera vy) med mikroskopiska våren sax för att frigöra DRG.
OBS: Det är lättast att ta reda på var nervändarna och DRG börjar samtidigt på spänning, så att denna minskning så nära som möjligt till DRG på denna punkt är perfekt. När detta distala grenen skärs, är de proximala grenar trimmas också. - Trimma DRG några enstaka nervtrådar eller fascian bilagor med mikroskopiska våren sax. Efter adekvat isolering, placera DRG in i rummet-temperaturmediet i 96-brunnars V-bottenplatta.
OBS: Placera en mörk bakgrund under plattan gör visualisera under mm vita DRG lättare. Bara placera en DRG i EACh väl; detta sätt, kan de stod för lättare i de efterföljande stegen. - Upprepa denna process hela vägen ner en hemi-ryggraden och sedan den andra. Varje sida ger 16 - 20 DRG, totalt 32-40.
OBS: Om det finns färre DRG än detta behöver dissektion av ryggraden som skall genomföras ytterligare kraniella och / eller kaudalt. DRG blivit allt mindre väl definierad som en fortskrider kaudalt.
3. Framställning av halvfast matris droppar (<1 min per platta)
- Ta ett glas väl bottenplatta från is och placera den på ett isblock under operationsmikroskop. Se till att alikvot av matrisen förblir på is vid alla tidpunkter.
- Placera en 1,5-mikroliter droppe av matris i vart och ett av de fyra hörnen av den glasbottenplattan med en 2-mikroliter eller 10-mikroliter micropipetter, vilket lämnar ett avstånd åtminstone lika stor som den lilla droppen sig från kanten av glaset väl.
- Placera pipettspetsen direkt påglaset på en 45-graders vinkel. Långsamt pipettera matrisen. Sakta bort från glaset botten efter matrisen är engagerad på plattan.
OBS! Ytspänningen mellan matrisen och glas bör skapa en perfekt halvklotet varje gång. - Sluta pipettering strax innan spetsen är tomma, eftersom oavsiktlig insprutning av luft in i matrisen dropp gör diametern av matrisen dropp mycket större och är svårt att avlägsna.
OBS: Med hjälp av en andra hand för att stabilisera pipettering handen underlättar mer exakt placering.
- Placera pipettspetsen direkt påglaset på en 45-graders vinkel. Långsamt pipettera matrisen. Sakta bort från glaset botten efter matrisen är engagerad på plattan.
4. Införande av DRG i halvfast matris Droppar (<2 min per platta)
- Låt plattan med matris droppar kort vid rumstemperatur (~ 1 min). Detta förstyvar något matrisen, vilket gör det lättare för den exakta placeringen av DRG.
- Scoop (inte förstå) DRG försiktigt med slutna mikroskopiska pincett i vänster hand. Återigen, en mörk bakgrund mot de små, vitaDRG underlättar visualisering. Överföra DRG till spetsen av en 21-gauge nål i höger hand. Denna överföring kommer att lämna resterande media på tången.
- Försiktigt in DRG i mitten av matrisen droppen med hjälp av 21-gauge nål (Figur 1). Merparten av tiden kommer DRG lätt släpper in i matrisen och sedan kan placeras centralt med nålen.
- Om DRG fastnar på nålen, använd de mikroskopiska pincett för att driva DRG bort av nålen och in i matrisen droppen. Wick bort överflödigt material från de mikroskopiska pincett med ett labb torka.
OBS: Presentation media till matrisen kommer att ändra diameter, volym och konsistens av analysen. Ett isblock med färg eller färgad skrift ger bakgrunds kontrast, vilket underlättar visualisering av denna känsliga process.
- Om DRG fastnar på nålen, använd de mikroskopiska pincett för att driva DRG bort av nålen och in i matrisen droppen. Wick bort överflödigt material från de mikroskopiska pincett med ett labb torka.
- Efter plattan har alla fyra DRG, gör en slutlig inspektion för att säkerställa att DRG är i mitten av matrisen droppen. gör justeringarvid behov med 21-gauge nål.
- Överföra den färdiga plattan till en 37 ° C inkubator. Detta kommer att stelna halvfast matris och fixera DRG på plats.
- Upprepa denna process för alla DRG. Placera tomma matris droppar utan DRG som den negativa kontrollen.
- Lägg 4 ml DMEM med 10% FBS-medium till varje glas-bottenplatta efter att alla plattor och utsätta dem för 37 ° C inkubator under minst 3 min. Placera plattan i en liten vinkel och tillsätt långsamt mediet, så att det gradvis kommer i kontakt med de matris DRG-enheter.
OBS: Om mediet tillsätts alltför snabbt eller kraftigt matrisen och / eller DRG kan lossna. - Lagra de analyser i 37 ° C inkubator för nästa 48-72 h.
OBS: Regelbunden undersökning av analyserna visar periferi utväxt av neuriter mot matris kant (Figur 2). När de neuriter är större än tre fjärdedelar av vägen till matrisen, detär lämpligt att plattan cellerna.
5. Beredning av huvud- och halscancerceller
OBS: andra än huvud- och hals skivepitelcancer celler Cellinjer kan användas i denna experimentella designen.
- Bibehålla skivepitelcancer cellinjer i DMEM med 10% FBS i föredragna flaskor eller odlingsskålar i en 37 ° C inkubator. För att bereda celler för experiment, sug hela mediet från odlingskolven eller skålen och tvätta det två gånger med PBS. Suspendera cellerna genom tillsats av en lämplig mängd av 0,025% trypsin under 5 min, följt av DMEM med 10% FBS. Pipettera 4 ml av cellen och media blandningen i 6 ml-odlingsskålar.
OBS: En 6-ml odlingsplatta erbjuder mer än tillräckligt celler, även när mindre än 50% konfluenta. - Exponera HNSCC cellinjerna till olika förhållanden 24 timmar före färgning och plätering på DRG-analysen. Åter dosera tillståndet när cellerna stryks ut för att bibehålla en konsekvent environmennt.
OBS: Lägg antikroppar, tillväxtfaktorer, cytokiner, eller andra molekyler till de cellodlingsskålar 1 - 2 dagar efter mus dissekering och implantation av DRG in i matrisen. - Lägg fluorescerande cellfläckar 1 timme innan plätering cellerna (2 - 3 dagar efter DRG skörd och implantation i matrisen).
OBS: De speciella fläckar som används här passera fritt genom cellmembranet; emellertid, efter reaktion med intracellulära tiolgrupper, förblir fläcken inom cellen och förs vidare till dottercellerna. Färgningen underlättar i hög grad visualisering inom analyserna. Dessa tillfälliga fläckar är idealiska för dessa analyser eftersom fluorescens är närvarande för 2 - 3 dagar, vilket är den tidsramen för dessa experiment. Det möjliggör också för användning av många olika färger och undanröjer behovet av att skapa fluorescerande protein-transfekterade cellinjer.- Förbereda 10 ^ M av färgämneslösningen genom att blanda 2 | il av 10 mM förrådscell fläckar i 2 ml serumfritt DMEMför varje cell tillstånd. Värm detta till 37 ° C innan den läggs till celler.
- Avlägsna odlingsmediet inom 6-ml plattan och lämnar de adherenta HNSCC cellerna på plattan. Tillsätt 2 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och ta bort 2 ml av 10 | iM cell fläck / serumfritt DMEM till varje platta
- Returnera 6-ml odlingsplatta med cell fläcken till 37 ° C inkubator i 40 min.
- Efter 40 min, aspirera mediet. Tillsätt 2 ml PBS och sedan aspirera den. Tillsätt 1 ml 0,025% trypsin till varje platta och ersätta dem i 37 ° C inkubator.
- Tillsätt 2 ml DMEM med 10% FBS efter 3-5 minuter och överför de suspenderade celler till en 15-ml koniska rör. Snurra cellerna och återsuspenderas dem i 1 ml DMEM med 10% FBS.
- Räkna cellerna med en hemocytometer eller automatiserad cellräknare, och sedan lägga till DMEM med 10% FBS för att skapa en slutlig cellkoncentration av 300.000 celler per ml.
6. Plating Head och Neck Cancer Cells
- Ta bort glasbottnade plattor med matris DRG-analyser från inkubatorn.
OBS: Återigen, de är lämpliga när neuriter är minst 75% av vägen till kanten av matrisen, vilket i regel sker efter 2 - 3 dagar. Detta ses bäst med hjälp av åtminstone en 10X mål. - Aspirera mediet i glasbottenplattan. Helt aspirera mediet inom glaset väl utan att avlägsna matris DRG enheter.
- Upprätta 200 mikroliter av 300.000 celler / ml medium med användning av en 200-mikroliter pipett. Placera två droppar av cellerna över varje matris DRG-analys. Utför det här steget för varje matris droppe, skapar fyra upprepningar av varje cell tillstånd på en tallrik.
OBS: Den halvsfäriska formen på matrisen gör det möjligt för cellerna att sedimentera i en ring längs periferin av analysen (figur 3a, Figur 3b). Att hitta en pipett med en mjuk avtryckare gör placeringen av enhetliga droppar mycket lättare. - Bekräfta liknande cellantal och distribution av olika cell villkoren i 4X mikroskopi.
- Placera glasbottnade plattor in i 37 ° C inkubator i ungefär 60 min. OBS: Även om det finns bara en liten mängd celler och media (~ 150 mikroliter), gör analyserna inte torka ut förrän flera timmar inkubator tid har förflutit.
- Efter 60 min, försiktigt lägga 4 ml DMEM med 10% FBS utmed sidoväggen av det glasbottenplattan.
OBS: Under en tidsperiod, cellerna delvis vidhäfta till plattans botten, och metoden för tillsats av mediet inte stör cellerna. Olika celltyper gör ta mer eller mindre tid att börja att ansluta sig till glasbottenplattan. - Byt ut exogena läkemedel eller tillväxtfaktorer vid denna tid för att behålla de tidigare koncentrationsnivåer.
- Återgå analyserna till 37 ° C inkubator, utom när de undersöks i mikroskop. Kvantifiera resultaten av denna analys genom mikroskopisk avbildning. I korthet räkna delar av perineural invasion medi fyra kvadranter med användning av en 4X mikroskopisk bild.
OBS: Ett mikroskop med en 4X objektiv och fluorescens kapacitet är tillräcklig för foto dokumentera analyserna. Storleken på analyserna passar fint inom området en 4X mål, som är tillräckligt detaljerade för att fånga de olika områdena i perineural invasion. Perineural invasion visar sig inom 24 timmar, men efter 48 h, börjar integriteten av analyserna att försvagas, eftersom tumörcellerna dela längs periferin av matrisen och invadera. Bortom 48 timmar, det finns också betydande utflöde av fibroblaster från DRG, som skymmer visualisering med hjälp av bright mikroskopi. Därför är det lämpligt att foto dokument resultaten med 4X mikroskopi åtminstone två gånger under det här fönstret (t.ex. vid 24 och 48 timmar efter plätering tumörcellerna). Var medveten om att dessa är 3-dimensionella analyser, och det är svårt att helt bild hela analysen. Mest perineural invasion uppträder i ett plan från botten av plattan, där than celler är inbäddade i matrisen något ovanför botten av plattan. Eftersom detta plan ligger nära horisontell, är den stora majoriteten av neuriter med tumörceller fångas i en enda nivå bild på 4X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter dissektion av DRG och placeringen inuti matrisen droppen bör utseendet hos analysen liknar figur 1. Observera att DRG är inte helt rund, men den är centrerad inuti matrisdroppe. Detta gör det möjligt att utväxt av neuriter i 360 grader, som visas delvis i fig 2. Var medveten om att vissa delar av DRG skicka ut neuriter snabbare och i större antal än andra, typiskt motsvarande där den efferenta och afferenta nervgrenar in och lämnat DRG, respektive. Vi står för detta och för storleksskillnader mellan DRG från slumpvis plätering DRG i grupper om fyra och sedan slumpmässigt tilldela en given platta till varje cell tillstånd.
Såsom beskrivits ovan, vi plattan cellinjerna HSNCC gång neurites har förlängt åtminstone tre fjärdedelar av vägen till kanten av matrisen, som typiskt är pådag 3. De tillsatta celler bildar en runtomgående ring runt matrisen (figur 3a). Vi fotograferar senare analyserna på dag 4 (figur 3b) och dag 5 (Figur 3c). Den cellinje som visas här (Fadu) visar en över genomsnittet förmåga att spåra längs neuriter. Den SQCCY1 cellinje visas i figur 4, visar emellertid liten eller ingen benägenhet att invadera analyserna.
När du använder en ny cellinje, är det importera att utnyttja flera negativa kontroller för att undersöka hur det särskilda cellinje uppträder runt analysen. Först platta celler runt en "blank" analys bestående av matris ensam (Figur 5). Alla cellinjer som vårt labb har undersökts aktivt dela runt matrisen men inte in eller sträcka sig över toppen av matrisen. När överdrivna Cellerna lämnas ovanpå matrisen, kan det finnas en betydande tillväxt över matrisen. Detta belyser behovet av att eNsure att så många celler falla till periferin av matrisen som möjligt, i stället för att lämnas att vila och dividera ovanpå matrisen. Detta kan åstadkommas genom att försiktigt knacka på plattorna innan cellerna vidhäfta eller genom att pipettera små mängder av mediet direkt på toppen av matrisen dropp när väl cellerna har börjat att ansluta sig till glasplattan.
En andra negativ kontroll, vari cellerna stryks ut på samma dag som DRG är placerad inuti matrisen, kan köras. Målet med denna metod är att visa att det inte är en neurotrop attraktion som driver cellerna till DRG, utan att närvaron av neuriter är obligatorisk. Dessutom, när tumörceller har uppe längs periferin av matrisen av större än 2 dagar, blir matrisen kant otydlig. Matrisen börjar sedan lyfta av i glaset botten och kan hittas fritt svävande i medierna strax därefter. Av denna anledning, denna protocol beskriver plätering de HNSCC cellerna en gång neurites har förlängts 75% av avståndet till kanten av matrisen.
Det finns otaliga alternativ för att kvantifiera resultaten av vad är visuellt mycket tydliga skillnader mellan analyser. I en sådan metod, är bilderna av de analyser som delas in i fyra kvadranter med en vertikal och en horisontell linje (figur 6). En poäng tilldelas för varje kvadrant som har åtminstone en sträng av PNI. Om PNI sträcker sig längre än 50% av vägen från kanten av matrisen till DRG, sedan 2 punkter tilldelas i stället. På detta sätt, en poäng av 0 - kan åtta poäng tilldelas. Den stora fördelen med detta system är att analyser som har för många PNI enheter att räkna snabbt kan bedömas. En nackdel är att det inte tillräckligt uttrycka graden av PNI (dvs en kvadrant med en neurite med invasion 100% av avståndet till DRG får samma poäng (2) som en quadrant med 10 liknande-invaderade neuriter). Jämförelse av bright och fluorescerande bilder gör systemet mycket enkelt, även med betydande fibroblast utflödet.
Prov scoring visas i figur 6. Med hjälp av denna fyra-kvadranten poängsystem för figur 3, 0 poäng, 2 poäng och 7 poäng tilldelades för paneler Figur 3a, Figur 3a och figur 3c, respektive. Figur 4 fick en poäng av 2 poäng och 2 poäng i paneler Figur 4a och figur 4b resp. Data i Tabell 1 visar resultaten av flera experiment med användning av cellinjerna Fadu och SQCCY1. Observera att även med en begränsad betygsskala som denna, är statistiskt signifikanta skillnader i medel fyra-kvadranten poäng lätt erhållas med hjälp av oberoende prover t-test.
Figur 1. DRG-matrix-analys. Korrekt placering av dorsala ganglion inom matrisen droppen, som visas med ljusfält mikroskopi på 4X. Skala stapel representerar 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. utväxt av neuriter. Neuriter är frånvarande på dag 0 omedelbart efter placering av DRG i matrisen droppen (A). Vid dag 1 (B), är neuritutväxt uppenbart vid 10X på bright mikroskopi. Neurite tillväxten fortsätter på dag 2 (C) och dag 3 (D); dock notera utflödet av fibroblaster. scale stapel representerar 0,1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. DRG-matris analys med Fadu. Huvud och hals skivepitelcancer linje Fadu lagt perifert runt en analys på dag tre (A), som visas i grönt fluorescerande och bright mikroskopi vid 4X progressiva neurala invasion syns på dag 4 (B) och dag 5 (C). Skala stapel representerar 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. DRG- matris Assay med SQCCY1. Huvud och nacke skvamös cell-linje SQCCY1 sattes på dag 4 (A), som visas i bright och grönt fluorescerande mikroskopi vid 4X. Observera att denna cellinje är inte lika skickliga på perineural invasion som Fadu, även av dag 5 (B). Skala stapel representerar 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Matrix Assay med Fadu. Huvud och hals skivepitelcancer cellinje Fadu sattes runt en matrisdroppe utan DRG på dag 3. bright och grönt fluorescerande mikroskopi (4X), som visas på dag 4 (A). Observera att tumörcellerna inte kommer in i matrisen eller växa över toppen av det, till och med dag 5 (B). Skala stapel representerar 1 mm.ttp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Fyra-kvadranten metod för analys kvantifiering. En poäng tilldelas för varje kvadrant med en PNI mindre än 50% av avståndet från kanten av matrisen till DRG. 2 poäng tilldelas när den PNI sträcker sig utanför 50%. Det första exemplet (A) skulle få en poäng av 5 (1 poäng för varje kvadrant för PNI mindre än 50%, med undantag för det nedre högra, som har en PNI sträcker sig utanför 50%, där 2 poäng gjorde). Det andra exemplet (B) scored som en 8 (a PNI utöver 50% i alla fyra kvadranter). Skala stapel representerar 1 mm. Klicka här för att visa b en större version av denna siffra.
| cellinje | n | dag 4 | SD | P-värde | dag 5 | SD | P-värde |
| Fadu | 24 | 2,88 | 1,42 | ref | 6,04 | 0,35 | ref |
| SQCCY1 | 20 | 0,60 | 0,60 | <0,001 | 1,05 | 0,17 | <0,001 |
Tabell 1. Jämförelse av den PNI Mellan Fadu och SQCCY1. Betyda fyra-kvadrant poäng såsom visas i fig 6 mellan cellinjer Fadu och SQCCY1 vid 24 h (dag 4) och 48 h (dag 5) efter det att cellerna ströks runt DRG-matrisanalys. Jämförelser görs med hjälp av oberoende sampel t-test och presenteras med standardavvikelsen (SD) och P-värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
De viktigaste stegen i detta protokoll är exakt dissekering och utvinning av dorsalrotsganglier. Korrekt transektion av ryggraden och en mittlinje-longitudinell uppdelning i två hemi-ryggar är kritiska för att erhålla ett stort antal DRG. Under dissektion av enskilda DRG bör ganglion aldrig hanteras direkt, utan snarare de omgivande fascia ska gripas med mikroskopiska pincett. Underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i en krosskada av DRG, vilket är sannolikt den främsta orsaken till misslyckande för neuritutväxt. Det är mycket bättre att under trimma den omgivande neurala vävnader under dissektion än risken över hantera DRG och få någon neurite tillväxt i analysen.
Ändringar och felsökning
Det experimentella protokollet som beskrivits ovan speglar den optimala uppfylldahodology etableras från ett stort antal procedur justeringar gjorts under flera år. Noterade direkt under motsvarande steg i protokollenheten finns ett antal sedlar och fallgropar som resulterade från erfarenheterna av författarna när du använder denna metod. Med tanke på antalet steg inblandade, det finns faktiskt många modifieringar som kan göras för att detta protokoll genom framtida utredare. Som erfarenhet med dessa modifieringar växer, är det planerat att ytterligare medel för felsökning kommer att utvecklas i enlighet med de preferenser utredningsgruppen.
Begränsningar av tekniken
Finns det tre stora begränsningar för denna teknik. Den första är att mycket fina neuriter används som ett surrogat för stora neurala invasion, vilket är vad patologer observera i tumörprover. Det är inte känt vilken roll neuriter, till skillnad från neuroner, är in vivo eftersom identifiera perineuriteinvasion är bortom kapaciteten hos en rutin histopatologisk undersökning. För det andra är perineural invasion en form av mjuk-vävnadsinvasion som inte kan helt enkelt involvera tumörceller och en intilliggande neuron, som simuleras i denna analys. Som sådan, yttre faktorer hemma i in vitro tumörmiljön saknas i denna analys. Slutligen är den tidsperiod under vilken PNI kan studeras begränsas till cirka 48 timmar på grund av en kombination av fibroblast utflödet och förlust av matrisintegritet. På detta sätt kommer cellinjer som är effektiva vid neural invasion men är långsam skilje och / eller invaderande missas och antas inte vara skickliga på PNI.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Såvitt vi vet är detta det enda in vitro-modell för närvarande tillgängliga för att undersöka PNI i HNSCC. Med tanke på hur ofta PNI sker i HNSCC och begränsad kunskap om mekanismer somnärvarande existerar, denna metod är fördelaktig av flera skäl. För det första har det en mycket stor framgång och utmärkt reproducerbarhet. Den totala experiment tid är också relativt kort jämfört med liknande protokoll 12,17-19. Slutligen, med stort antal analyser som kan genereras från ett enda mus, många förhållanden kan testas med vetenskapligt lämpliga replikat. Kombinationen av dessa faktorer möjliggör en snabb bedömning av många olika förhållanden med konsekventa resultat.
Samtidigt, den höga kvaliteten på analysen tillåter mer detaljerad undersökning av interaktionen mellan tumörcellerna och neuriter. Användningen av levande cell imaging möjliggör uppskattning av neuritutväxt processen och HSNCC cellinvasion i time-lapse video formulär. Tillsatsen av fluorescerande-färgade celler skapar mycket tydlig skillnad mellan cancerceller och bakgrundsmaterial, såsom fibroblaster och tät neurite outgrowth (vilken auto fluorescerar rött). Vare sig efter detta protokoll eller de som beskrivs av andra, är denna allmänna experimentell design i sin relativa linda, och det är långt ifrån en guldmyntfot för in vitro-studie av PNI. Av dessa skäl, desto mer närmar sig till denna analys som beskrivs i detalj, desto större möjlighet för samarbete för utveckling av en ideal metod.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter behärska denna teknik
Precis som det finns flera olika sätt att ställa upp analyserna, det finns flera metoder för att mäta resultaten. I ovanstående text, har en enda metod för att snabbt kvantifiera graden av perineural invasion i varje analys presenteras. Detta är idealiskt för att screena effekterna av ett flertal olika vägar på PNI, särskilt med tanke på att man kan isolera 32 - 40 DRG per mus. Det finns ett antal avancerade avbildningstekniker för att bedöma PNI,inklusive mängden fluorescens inom ett givet område, avståndet och hastigheten för cellinvasion, och den råa antalet celler i analysen. När den dynamiska delen av experimentet är klar, kan cellerna i analysen och / eller supernatanten också samlas in för vidare molekylanalys.
Denna experimentella metod ger möjlighet att belysa mekanismer som är involverade i PNI av HNSCC och andra cancerformer. Denna kunskap kan driva utvecklingen av läkemedel att rikta vägar PNI, som i dagsläget, saknas i HNSCC. Särskild inriktning på PNI när identifierats som en negativ patologisk funktion kan potentiellt eliminera behovet av icke-specifika adjuvans behandlingar, såsom strålbehandling och kemoterapi, som för närvarande utnyttjas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES | Corning Cellgro | 10-090-CV | Manassas, VA |
| Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11150 | Flowery Branch, GA |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies Corporation | 25200056 | Grand Island, NY |
| Phosphate buffered Saline 1x | Corning | 21-040-CM | Manassas, VA |
| Matrigel hESC-Qualif Mouse | Corning Incorporated | 354277 | Bedford, MA |
| Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Ashland, MA |
| SteREO Discovery.V8 Operating Microscope | Carl Zeiss Microimaging | 495015-0021-000 | Thornwood, NY |
| Schott ACE I light source | Schott | A20500 | Germany |
| CellTracker | Life Technologies Corporation | C2925 | Carlsbad, CA |
| BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G | BD | 305195 | Franklin Lakes, NJ |
| Premium Microdissecting Tweezer | Harvard Apparatus | 60-3851 | Holliston, MA |
| Premium Fine Operating Standard Scissors | Harvard Apparatus | 52-2789 | Holliston, MA |
| Premium Spring Scissors | Harvard Apparatus | 60-3923 | Holliston, MA |
| Dressing Forceps | Harvard Apparatus | 72-8949 | Holliston, MA |
| Athymic nude mice (002019) | Jackson Laboratory | 002019 | Bar Harbor, ME |
References
- Jemal, A., et al.
- Hinerman, R. W., et al. Postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity: 35-year experience. Head Neck. 26 (11), 984-994 (2004).
- Rahima, B., Shingaki, S., Nagata, M., Saito, C. Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 97 (4), 423-431 (2004).
- Woolgar, J. A., Scott, J. Prediction of cervical lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue/floor of mouth. Head Neck. 17 (6), 463-472 (1995).
- Tai, S. K., et al. Treatment for T1-2 oral squamous cell carcinoma with or without perineural invasion: neck dissection and postoperative adjuvant therapy. Ann Surg Oncol. 19 (6), 1995-2002 (2012).
- George, D. L., et al. Nosocomial sinusitis in patients in the medical intensive care unit: a prospective epidemiological study. Clin Infect Dis. 27 (3), 463-470 (1998).
- Fagan, J. J., et al. Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (6), 637-640 (1998).
- Soo, K. C., et al. Prognostic implications of perineural spread in squamous carcinomas of the head and neck. Laryngoscope. 96 (10), 1145-1148 (1986).
- Parsons, J. T., Mendenhall, W. M., Stringer, S. P., Cassisi, N. J., Million, R. R. An analysis of factors influencing the outcome of postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 39 (1), 137-148 (1997).
- Liao, C. T., et al. Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in pT1-3N0 oral cavity cancer with tumor-free margins and perineural invasion. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 71 (2), 371-376 (2008).
- Fan, K. H., et al. Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher recurrence rates. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 77 (4), 1024-1029 (2010).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach. Hum Pathol. 38 (2), 299-307 (2007).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer: a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374 (3), 442-447 (2008).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
- He, S., et al. GFRalpha1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (19), 2008-2017 (2014).
- He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
- Bakst, R. L., et al. Radiation impairs perineural invasion by modulating the nerve microenvironment. PLoS One. 7 (6), 39925 (2012).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion. J Vis Exp. (110), (2016).
