Protocol
1. Kültür Orta hazırlanması ve Yemekleri (10 dk)
- 100 uL, 96 oyuklu V-tabanlı plaka oyuklarına,% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) ilave edin.
- 20 ° C dondurucu yarı katı matris yaklaşık 100 uL önceden bölünüp-vial kaldırma ve buz üzerine yerleştirin.
NOT: Yarı katı matris sonraki adımlar için gerekli olan buz, sıvı duruma ulaşması için yaklaşık 30 dakika sürer, çünkü bu önceden dorsal kök ganglion (DRG) hasat yapın. her zaman buz üzerinde yan katı matris tutmak için başarısızlık bir düşük kaliteli matris damlacık neden olur. - Etiket cam alt kalıcı mürekkep ile kültürler plakalar, plaka alt yüzeyinde dört bir köşesinden her benzersiz tanımlayıcılar oluşturma. plaka yüzeyini soğutmak için buz üzerinde plakaları sağ tarafını yukarı yerleştirin.
NOT: Her fare verimleri 32-40 DRG, so-soğuk ön pi gerekli değildir 40'a 1'den etiketlemeksoğutulmuş ipuçları potansiyel matris damlacıklarının yerleştirerek matris tutarlılık farklılıkları tanıtan gidişatını üzerinde sıcak olacak gibi ipuçları pet.
Fare DRG 2. Diseksiyon (45 dk)
- Böyle bir CO2 odası ve bir torakotomi aracılığıyla belirli laboratuar protokoller uyarınca bir atimik çıplak fare öldürülür.
- Diseksiyon alanı ve mikroskop ayarlayın. 15- veya 50-ml konik borular polistiren kapları steril, temiz ve düz alt kullanın.
Not: Buna ek olarak, bunlar tek ve ucuz olarak, kesme yüzeyi olarak kullanım için uygun olan ve iğne veya iğne kullanılarak omurga tespiti için verir. Sadece sterilize aletler ve iğneler kullanın. - Doğal vizyon altında, düz ya da eğri ince bir makasla ile fare başkanı kuyruk kökünden omurga boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak.
- SACR altında enine bölünmeden aynı makas kullanınal omurga. tüm yol makas kullanarak kafa tabanına kadar omurganın her iki tarafını teşrih. Bu noktada, servikal vertebra makas ile mümkün olduğunca cranially kadarıyla transeksiyon olduğundan emin olun.
- düşük güçte çalışma mikroskop altında omurganın servikal ucunu gözlemleyin. beyaz omurilik paraspinal kaslar ve yumuşak doku değişken miktarlarda çevrili bir kemikli halka ortasında açıktır.
- mikroskobik yaylı makas ile 3 vertebra gövdeleri - ilk 2 dorsal veya üstün yönü bölün. makas yay eylemini kullanarak, vertebral gövde diseksiyon orta hatta meydana sağlamak için kesilen bu ilk kemikli açın. sakral omurganın doğru küçük artışlarla devam edin ve sonra omurların ventral ya da alt yönü üzerinde aynı kesim tamamlayarak omurga bisect.
NOT: Daha düşük TİG verimi neden olacaktır kemikli omurganın orta hat diseksiyonu sağlamak için başarısızlık. - at this noktası, omurga iki yarıya ayrılmıştır. yerinde ve steril bir plaka üzerinde aşağı bakacak omurilik ile, bir kenara bir hemi-omurga yerleştirin.
NOT: yerinde omurilik bırakmak DRG omuriliğe derin olarak, kurumasını DRG'ler önleyecektir. - polistiren diseksiyon platform üzerinde iki adet 18-gauge iğne ile diğer hemi-omurganın her iki ucunu sabitleyin. Servikal sonunda başlayarak yavaşça yaklaşık 4 vertebra seviyelerinden omurilik geri soyma, (omurga dar olduğu için açıktır, DRG birbirine yakın olan ve kaburga ekleme vardır).
- DRG bağlayan duyu sinirleri (genellikle iki) dikkat edin. sinirler DRG için eklemek alanda, nazikçe mikroskobik forseps ile çevreleyen fasya kavramak. Incelemek ve DRG boşaltmak için mikroskopik yaylı makas ile bu fasya ve diğer sinir dokusunu kırpın. Nazik geri çekme kemik omurga içindeki konumunun dışına DRG getirecektir.
NOT: ArtanBu aşamada mikroskop gücü faydalıdır. önemli ölçüde neurites büyümesini sınırlayacaktır DRG için ezilme yaralanması. Bu asla doğrudan DRG tutarak kaçınılmalıdır değil, çevredeki fasya tutarak edilir. - Periferik sinir DRG serbest bırakmak için mikroskopik yaylı makas ile (DRG genellikle diseksiyon görünümüne derin göreceli bir çevresel sinir, vardır) kesin.
NOT: sinir uçları ve DRG yüzden bu noktada DRG mümkün olduğunca yakın bu kesim yaparak, gerginlik sırasında başlayan idealdir olduğu tespit etmek kolay değildir. Bu uzak şube kesilir sonra, proksimal dallar da kesilmiş. - mikroskobik yaylı makas ile herhangi bir sokak sinir lifleri veya fasiyal ekleri DRG Trim. Yeterli izole edildikten sonra, 96-gözlü V-dipli levhanın içinde oda sıcaklık ortamına DRG yerleştirin.
NOT: levha beyaz DRG kolay alt mm görselleştirme yapar altında karanlık bir arka plan yerleştirilmesi. Sadece EAC bir DRG yerh iyi; Bu şekilde, daha kolay daha sonraki adımlarda açıklanabilir. - bir hemi-omurga ve daha sonra diğer aşağı Bu işlemi tüm yol tekrarlayın. 40 - 32 toplam 20 DRG'ler, - Her iki taraf 16 verir.
Not: Bu daha az DRG'ler varsa, omurga diseksiyon sefalad ve / veya kaudal gerçekleştirilebilir gerekmektedir. DRG bir kaudal ilerledikçe giderek daha az iyi tanımlanmış olur.
Yarı Katı Matris Damlacıkların 3. Hazırlama (<plaka başına 1 dakika)
- buz bir bardak iyi alt plakasını çıkarın ve ameliyat mikroskobu altında bir buz bloğu üzerine yerleştirin. Emin matris kısım her zaman buz üzerinde kalır emin olun.
- de camın kenarından damlacık kendisi en az büyük bir mesafe bırakarak, bir 2-uL ya da 10-uL Mikropipet cam-alt plaka dört köşesinin her birinde matrisin 1.5 uL damlacık yerleştirin.
- doğrudan üzerine pipet ucu yerleştirin45 derecelik bir açıyla cam. Yavaşça matrisi pipetlemeyin. matris plaka üzerinde devreye girer sonra yavaş yavaş cam alt uzaklaşın.
NOT: matris ve cam arasındaki yüzey gerilimi mükemmel bir hemisfer her zaman oluşturmanız gerekir. - matris damlacık içine istenmeyen hava enjeksiyon matrisi damlacık çok daha büyük çapı yapar ve kaldırmak zor, çünkü ucu, boş hemen önce pipetleme durdurun.
NOT: pipetleme el stabilize etmek için bir ikinci el kullanarak daha doğru yerleştirilmesini kolaylaştırır.
- doğrudan üzerine pipet ucu yerleştirin45 derecelik bir açıyla cam. Yavaşça matrisi pipetlemeyin. matris plaka üzerinde devreye girer sonra yavaş yavaş cam alt uzaklaşın.
Yarı sert Matrix damlacıklar halinde DRG 4. Yerleştirme (<plaka başına 2 dk)
- kısaca oda sıcaklığında (~ 1 dk) matris damlacıkları ile plaka bırakın. Bu biraz DRG kesin yerleştirilmesi için daha kolay hale matris sertleştiği.
- Scoop (kavramak değil) DRG yavaşça sol elinde kapalı mikroskobik forseps ile. Yine, küçük karşı koyu bir arka plan, beyazDRG görüntülenmesini kolaylaştırır. sağ elinde bir 21-gauge iğne ucuna DRG aktarın. Bu transfer forseps üzerinde kalan medyayı bırakacaktır.
- Yavaşça 21 gauge iğne (Şekil 1) kullanılarak matris damlacığının ortasına DRG yerleştirin. Çoğu zaman, DRG kolayca matrise yayınlayacak ve iğne ile merkezi olarak yerleştirilmiş olabilir.
- DRG iğne sopa varsa, iğne kapalı ve matris damlacık içine DRG itmek için mikroskobik forseps kullanabilir. Bir laboratuvar ile mikroskobik forseps Wick uzak aşırı medya silin.
NOT: matrise medyayı Tanıtımı tahlil çapı, hacmi ve tutarlılık değiştirecektir. renk veya renkli yazı ile bir buz bloğu bu hassas sürecin görselleştirme kolaylaştırır arka plan kontrast sağlar.
- DRG iğne sopa varsa, iğne kapalı ve matris damlacık içine DRG itmek için mikroskobik forseps kullanabilir. Bir laboratuvar ile mikroskobik forseps Wick uzak aşırı medya silin.
- Plaka dört DRG'ler sahip sonra, DRG matris damlacık merkezinde olduğundan emin olmak için son bir kontrol yapın. ayarlamalar yapın21-guage iğne ile gerektiği gibi.
- 37 ° C inkübatör tamamlanmış plaka aktarın. Bu yarı katı matris kuvvetlendirmek ve konumda DRG çözecektir.
- DRG'ler tümü için bu işlemi tekrarlayın. Negatif kontrol olarak bir DRG olmadan boş matriks damlacıkları yerleştirin.
- Tüm levhalar tamamlayan ve en az 3 dakika süreyle 37 ° C inkübatör maruz bırakılmasından sonra, her cam alt plakaya% 10 FBS ortamı ile DMEM 4 ml. hafif bir açıyla plaka koyun ve yavaş yavaş yavaş yavaş matris DRG birimleri ile temas şekilde, orta ekleyin.
NOT: orta, çok hızlı ya da güçlü bir şekilde matrisi ve / veya DRG eklenirse yerinden olabilir. - - 72 saat sonraki 48 ve 37 ° C inkübatör tahlilleri saklayın.
NOT: testlerin periyodik muayene matrisi kenarı (Şekil 2) doğru neurites çevresel akıbet gösterecektir. neurites matrise yol dörtte üçü daha büyük olduğunda, onuhücreler plaka uygundur.
Baş ve Boyun Kanserleri Hücrelerinin 5. Hazırlık
Not: baş ve boyun yassı hücreli karsinom hücreleri dışındaki hücre hatları, bu deney tasarımında kullanılabilir.
- 37 ° C kuluçka makinesi içinde tercih edilen şişeler veya kültür tabaklarında,% 10 FBS DMEM skuamöz hücreli karsinoma hücre çizgileri koruyun. tüm orta kültürü şişesi veya çanak deney, emme hücreleri hazırlamak ve PBS ile iki kez yıkayın. % 10 FBS DMEM, ardından 5 dakika için% 0.025 tripsin, uygun bir miktarda eklenerek hücrelerin süspansiyonu. 6 ml kültür tabaklarında içine hücre ve ortam karışımı pipetle 4 mi.
NOT: 6-ml kültür plakası fazlasıyla hücreler de sağlar, hatta en az% 50 konfluent. - boyama ve DRG deneyi üzerinde kaplama 24 saat önce farklı koşullara HNSCC hücre hatları Açığa. Yeniden doz hücre tutarlı environme korumak için kaplama bir kez durumnt.
Not: Hücre kültür tabaklarına 1 antikorları, büyüme faktörleri, sitokinler, ya da diğer moleküllerin ekleyin - Fare diseksiyon ve matrise DRG yerleştirilmesinden 2 gün. - (- 3 gün matris içine DRG hasat ve implantasyon sonrası 2) hücreleri kaplama önce floresan hücre lekeleri 1 saat ekleyin.
NOT: hücre zarından serbestçe geçmesine burada kullanılan özel lekeler; Bununla birlikte, hücre içi tiol grupları ile reaksiyona sokularak, leke hücre içinde kalır ve yavru hücrelere de geçirilir. boyama büyük deneylerde görüntülenmesini kolaylaştırır. Bu deneylerin zaman aralığı 3 gün, - floresans 2 mevcut olduğu için, bu, geçici lekeler Bu tahliller için idealdir. Aynı zamanda, pek çok farklı renk kullanımına izin verir ve floresan protein transfekte hücre çizgileri oluşturmak için ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır.- serumsuz DMEM 2 mL 2 uL 10 mM stok, hücre lekeleri karıştırılarak boya çözeltisi 10 um hazırlanmasıHer hücre durumu için. hücrelere eklenmeden önce 37 ° C'ye kadar, bu ısıtın.
- plaka üzerinde yapışık HNSCC hücreleri bırakarak, 6 mL plaka içinde kültür ortamı çıkarın. 10 uM hücresi leke / serumsuz DMEM mL fosfat tamponlu tuz (PBS) 2 ml ilave edilir ve 2 çıkarın her bir plakaya ilave
- 40 dakika için 37 ° C inkübatör hücre leke ile 6 ml kültür plakası döner.
- 40 dakika sonra, ortam aspire. 2 mL PBS ekleyin ve sonra aspire. Her bir plaka için% 0.025 tripsin 1 ml ilave edilir ve 37 ° C inkübatör değiştirin.
- 3 sonra% 10 FBS ile DMEM 2 mL ekleyin - 5 dakika ve 15 ml konik tüp askıya hücreleri aktarın. hücreleri Spin ve% 10 FBS DMEM 1 mL bunları yeniden askıya alınmıştır.
- Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücre sayımı ve ml başına 300.000 hücre nihai hücre konsantrasyonu oluşturmak için,% 10 FBS bulunan DMEM ekleyin.
6. Kaplama Başkanı ve Neck Kanser Hücreleri
- inkübatör matris-DRG deneyleri ile cam alt plakaları sökün.
Not: - 3 gün, nevritlerin genellikle 2 sonra ortaya çıkan matris, kenarına bir şekilde en az% 75 olduğu zaman yine, uygun bulunmaktadır. Bu en iyi, en azından bir 10X objektif kullanılarak görülüyor. - Cam alt plaka içinde ortamı aspire. Tamamen iyi matris-DRG üniteleri çıkarmadan camın içinde orta aspire.
- 200 mcL pipet kullanarak 300.000 hücre / mL ortamı 200 uL hazırlayın. Her matris-DRG tahlil üzerinde hücrelerin iki damla yerleştirin. bir plaka üzerinde her hücre durumunun dört tekrarlar oluşturarak her matris damlacık için bu adımı gerçekleştirin.
Not: matris Şekillerde yanm-küresel hücrelerin deneyi (Şekil 3a, Şekil 3b) çevresi boyunca halka yerleşmeye izin verir. pürüzsüz tetikleyici ile bir pipet bulma üniforma yerleştirme çok daha kolay düşer hale getirir. - Benzer hücre sayıları ve di onaylamak4X mikroskopta çeşitli hücre koşullarının PAZARLAMA.
- Yaklaşık 60 dakika boyunca 37 ° C inkübatör içine cam alt tabak yerleştirin. Not: hücreler ve ortam (~ 150 mL) arasında sadece küçük bir hacim olsa da kuluçka süresi birkaç saat geçtikten kadar deneyler kuru değildir.
- 60 dakika sonra, yumuşak cam alt plakanın yan duvar boyunca,% 10 FBS DMEM 4 ml.
Not: bir süre içinde, hücreler, kısmen levha alt ve hücrelerin rahatsız etmez ortam ilave yöntemine uygun. Farklı hücre tipleri cam alt plakaya bağlı başlaması fazla veya daha az bir zaman alır olun. - Bir önceki konsantrasyon seviyesini korumak için şu anda herhangi bir eksojen ilaçlar veya büyüme faktörleri değiştirin.
- onlar mikroskopik olarak incelenir dışında, 37 ° C inkübatör deneyleri dönün. mikroskopik görüntüleme ile bu tayinin sonuçları ölçmek. Kısaca, ile perinöral invazyon ipliklerini saymakdört çeyrek daireye 4X mikroskobik görüntü kullanılarak.
NOT: 4X objektif ve floresan yetenekleri ile bir mikroskop fotoğrafı-belgeleyen deneyleri için yeterlidir. tahlillerin boyutu perinöral invazyon bireysel alanlarda yakalamak için yeterince detaylı bir 4X objektif, alanında güzel uyuyor. Perinöral invazyon 24 saat içinde belirgin hale gelir, ancak 48 saat ötesinde, tahlillerin bütünlüğü tümör hücreleri matris çevresi boyunca bölmek ve işgal gibi zayıflatmak başlar. 48 saat ötesinde, aynı zamanda aydınlık mikroskopi kullanılarak görselleştirme gizler DRG gelen fibroblast önemli efflux vardır. Bu nedenle, bu pencerede sırasında en az iki kez fotoğraf belge 4X mikroskobu ile sonuçları tavsiye edilir (örneğin, tümör hücreleri kaplama sonra 24 ve 48 saatte). Bu 3 boyutlu analizler, ve tamamen görüntü tüm tahlil zor olduğunu dikkatli olun. Çoğu perinöral invazyon plakanın alt t bir düzlemde gerçekleşiro hücreler hafifçe plakanın alt yukarıdaki matriks içinde gömülürler. Bu düzlem, yatay yakın olduğu için, tümör hücreleri ile neurites büyük çoğunluğu 4X tek bir düzey görüntü yakalanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DRG diseksiyonu ve matris damlacık içinde yerleştirildikten sonra, testin görünüş DRG mükemmel yuvarlak olmadığı Şekil 1. Not benzer olmalıdır, ancak matris damlacık içinde ortalanır. Bu, Şekil 2'de kısmen gösterilen 360 derece nöritlerin büyümesinin, sağlar. DRG belirli kısımları ise genellikle efferent ve afferent sinir dalları girdi ve sırasıyla DRG çıkıldı nerede karşılık, diğerlerinden daha hızlı ve daha fazla sayıda neurites göndermek unutmayın. Bunun için rastgele 4'lü gruplar halinde DRG'ler kaplama ve sonra rasgele her bir hücre durumuna, belirli bir levha atayarak DRG'ler arasındaki boyut farklılıkları hesaba.
Yukarıda açıklandığı gibi neurites genellikle açık matris kenarına, yoldan en az ¾ artırdık kez biz HSNCC hücre hatları plaka3. Gün ilave hücreler matriks (Şekil 3a) etrafında çevresel bir halka oluşturur. Biz sonradan gün 4 (Şekil 3b) ve gündüz 5 (Şekil 3c) ile ilgili tahlilleri fotoğraf. Burada gösterilen hücre hattı (Fadu) neurites boyunca izlemek için ortalamanın üzerinde bir kabiliyetini gösterir. Şekil 4'te gösterilen SQCCY1 hücre çizgisi Ancak tahlilleri istila etme eğilimi az gösterir.
Yeni bir hücre hattı kullanırken, o belirli hücre hattı tahlilinde etrafında nasıl davrandığını incelemek için birkaç negatif kontroller kullanmak ithal olduğunu. İlk olarak, tek başına bir matristen oluşan bir "boş" deneyinde yaklaşık plaka hücreleri (Şekil 5). Bizim laboratuvar aktif incelemiştir Tüm hücre çizgileri matris etrafında bölmek ama girmek veya matrisin üst üzerinde uzatmak yok. Aşırı hücre matrisinin üzerine bırakılır, matris üzerinde önemli büyüme olabilir. Bu e gereğini vurgulamaktadırgibi birçok hücre mümkün matris çevresine düşer şekilde almalarının sağlanması yerine dinlenme ve matrisin üst bölmeye bırakılmıştır. Bu hücreler, uygun önce iyice tabakalarına dokunarak veya hücrelerin cam plakaya bağlı başladığı zaman, doğrudan matris damlacığının üzerine ortam küçük miktarlarda pipetleme ile gerçekleştirilebilir.
Hücreler DRG matris içine yerleştirilir aynı gün kaplama olup, burada ikinci bir negatif kontrol, çalıştırılabilir. Bu yaklaşımın hedefi DRG hücreleri sürücüler, ama neurites varlığı zorunludur ziyade bir nörotropik cazibe olmadığını göstermektir. Tümör hücreleri daha büyük 2 gün boyunca matris çevresi boyunca ikamet eden Dahası, matris kenarı belirsiz hale gelir. Matris daha sonra cam alt off kaldırmaya başlar ve serbest yüzen kısa bir süre sonra medyada bulunabilir. Bu nedenle, bu protoneurites matris kenarına mesafe% 75 artırdık kez col HNSCC hücreleri kaplama açıklar.
görsel tahliller arasında çok belirgin farklar nelerdir sonuçlarını ölçülmesine yönelik sayısız seçenek vardır. Bu tür bir yöntemde, deneylerin resim dikey ve yatay hat (Şekil 6) ile dört parçaya ayrılır. Bir nokta PNI en az bir dize olan her çeyrek için atanır. PNI DRG matrisin kenarından yolu% 50 ötesine uzanan, daha sonra 2 puan yerine atanır. Bu şekilde, 0 bir skor - 8 puan atanabilir. Bu sistem büyük avantajı saymak için çok PNI birimleri deneyleri hızla değerlendirilebilir olmasıdır. Bir dezavantajı yeterli PNI derecesini (yani işgaliyle 1 neurite DRG uzaklığın% 100 olan bir kadran aynı puanı alan ifade etmez olmasıdır (2) qu olarak) 10 benzer şekilde işgal neurites ile adrant. Aydınlık ve floresan görüntülerin karşılaştırılması bile önemli fibroblast efflux ile bu sistem çok kolay hale getirir.
Örnek puanlama Şekil 6'da gösterilmiştir. Şekil 3 0 puan, 2 puan, 7 puan, bu dört-kadranlı skorlama sistemi kullanılarak, sırasıyla panel Şekil 3a, Şekil 3a ve Şekil 3c, tahsis edilmiştir. Şekil 4, sırasıyla Şekil 4b 2 puan ve 2 panoları Şekil 4a puan ve puan aldı. Tablo 1 deki veriler hücre çizgileri Fadu ve SQCCY1 kullanarak çeşitli deney sonuçlarını göstermektedir. Hatta sınırlı derecelendirme ölçeği ile bu gibi, ortalama dört kadran puanlarında istatistiksel anlamlı farklılıklar kolayca bağımsız örneklem t-testi kullanılarak elde edilir unutmayın.
Şekil 1. DRG-matris Deneyi. 4X de aydınlık mikroskobu ile gösterilen matris damlacık içinde dorsal kök ganglion doğru yerleştirilmesi. Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Neurites 2. sonucudur Şekil. Nöritler hemen matrisi damlacık (A) DRG yerleştirdikten sonra 0. günde yoktur. 1. gün (B), nörit gelişimi aydınlık mikroskobu 10x belirgindir. Akson büyümesini 2. günde (C) ve 3. günde (D) devam eder; Bununla birlikte, fibroblastlar akışını not edin. scale bar 0,1 mm temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Fadu Şekil 3. DRG-matris Deneyi. Baş ve boyun skuamöz hücre karsinomu hattı Fadu 4. günde (B) ve 5. gün (C) görülür 4X Aşamalı nöral invazyon yeşil floresan ve aydınlık mikroskobu gösterilen günlük 3 (a) ile ilgili bir deneyde, etrafına çepeçevre ilave edildi. Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. DRG- SQCCY1 matris Deneyi. Baş ve boyun skuamöz hücre çizgisi SQCCY1 4X aydınlık ve yeşil flüoresan mikroskopi gösterilen 4. günde (A) ilave edildi. Bu hücre çizgisi bile gün 5 (B), Fadu olarak perinöral invazyon itibariyle yetkin olmadığını unutmayın. Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Fadu Şekil 5. Matris Deneyi. Baş ve boyun skuamöz hücre karsinomu hücre soyu Fadu 3. gün aydınlık ve yeşil flüoresan mikroskobu (4X), günde 4 (A) gösterilen bir DRG olmayan bir matris damlacık çevresinde en ilave edildi. Tümör hücreleri bile gün 5 (B), matris girmek ya da üst üzerinde büyümek değil unutmayın. Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder.ttp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tahlil Niceleme 6. Dört kadranda Yöntemi Şekil. Bir nokta DRG matrisin kenar mesafesinde bir PNı az% 50, her çeyrek öngörülmüştür. PNI% 50 ötesine uzanır zaman 2 puan atanır. İlk örnek (A) (2 puan puanlanır% 50, ötesine uzanan bir PN, sahip sağ alt hariç, bir PNI az% 50 her kadranda için 1 puan) 5 puan alacak. İkinci örnek (B) (dört kadranda% 50 ötesinde PNI) 8 olarak puanlanır. Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder. V için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu iew.
| Hücre çizgisi | n | 4. gün | SD | P-değeri | 5. gün | SD | P-değeri |
| Fadu | 24 | 2.88 | 1.42 | Ref | 6.04 | 0.35 | Ref |
| SQCCY1 | 20 | 0.60 | 0.60 | <0.001 | 1.05 | 0.17 | <0.001 |
Tablo Fadu ve SQCCY1 arasında PNI 1. Karşılaştırma. 24 saat (Gün 4) ve hücreler, DRG matris tahlilinde yaklaşık kaplandı 48 saat sonra (gün 5) hücre hatları Fadu ve SQCCY1 arasındaki Şekil 6'da gösterildiği gibi, dört-kadranlı skorları ortalama. Karşılaştırmalar, bağımsız Sam kullanılarak yapılırple t-testi ve standart sapma (SD) ve P-değerleri ile başvurdu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
Bu protokol kapsamında en önemli adımlar hassas diseksiyon ve dorsal kök gangliyon çıkarma vardır. İki hemi-dikenler içine omurga ve orta hat-boyuna bölünme uygun transseksiyon DRG çok sayıda elde etmek önemlidir. Bireysel TİG'lerin diseksiyonu sırasında, ganglion doğrudan ele asla, daha ziyade çevredeki fasya mikroskobik forseps ile kavranabilir olmalıdır. Bunu yapmak için başarısızlık olasılığı neurit için başarısızlık önemli nedenidir DRG, bir ezilme yaralanması neden olacaktır. Bitti işleme DRG ve deneyde hiçbir nörit büyüme elde riski daha diseksiyonu sırasında çevredeki nöral Döşeme altında çok daha iyidir.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
yukarıda tarif edildiği gibi deneysel protokol araya Optimal yansıtıryıllarda yapılan prosedürel ayarlamaları çok sayıda tesis hodology. protokol bölümünde gelen adımı altında doğrudan Listelenen bu yöntemi kullanırken yazarların deneyimlerinden kaynaklanan notlar ve tuzaklar bir sayıdır. aşama sayısı göz önüne alındığında, gelecekteki araştırmacılar tarafından bu protokol yapılabilir gerçekten de pek çok değişiklik vardır. Bu değişikliklerle deneyim büyüdükçe, sorun giderme ek araçlar soruşturma ekibinin tercihlerine göre geliştirilmiş olacağı tahmin edilmektedir.
Tekniğin Sınırlamalar
Bu tekniğe üç büyük sınırlamalar vardır. İlk çok ince neurites patologlar tümör örneklerinde gözlemlemek ne büyük nöral invazyon, bir vekil olarak kullanılmasıdır. Belirleme nedeniyle nöron zıt olarak, ne nöritlere rolü bilinmemektedir, in vivo olarak perineuriteişgali rutin histopatolojik sınav yetenekleri dışındadır. İkinci olarak, sinir invazyonu, bu tahlilde simüle olduğu gibi sadece tümör hücreleri, ve bitişik bir nöron dahil değil yumuşak doku istilasına şeklidir. In vitro olarak tümör ortamında yerli gibi ekzojen faktörler de bu tahlilde eksiktir. Son olarak, PNI incelenebilir süre zarfı Fibroblast efflux ve matris bütünlüğü kaybı kombinasyonu yaklaşık 48 saat ile sınırlıdır. Bu şekilde, nöral invazyon etkilidir ama yavaş bölünmesini ve / veya istila hücre hatları özleyeceğiz ve PNI yetkin olamaz tahmin.
Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi
Bildiğimiz kadarıyla, bu HNSCC içinde PN, incelemek için mevcut tek in vitro modeldir. PNI HNSCC meydana sıklığını ve mekanizmaların sınırlı bilgisi verilenBu yöntem, çeşitli nedenlerle avantajlıdır bulunmaktadır. Birincisi, bu çok yüksek bir başarı oranı ve mükemmel tekrarlanabilirlik sahiptir. Toplam deney süresi benzer protokoller 12,17-19 karşılaştırıldığında da oldukça kısadır. Son olarak, tek bir fare elde edilebilir testlerin çok sayıda, birçok durum bilimsel uygun çoğaltır ile test edilebilir. bu faktörlerin kombinasyonu tutarlı sonuçlar ile pek çok farklı koşullar hızlı değerlendirilmesi için izin verir.
Aynı zamanda, tahlilin, yüksek kaliteli, tümör hücreleri ve nöritlere arasındaki etkileşimin daha ayrıntılı bir inceleme sağlar. canlı hücre görüntüleme kullanımı nörit gelişimi sürecinin takdir ve time-lapse video şeklinde HSNCC hücre işgali için izin verir. floresan lekeli hücrelerin eklenmesi gibi fibroblast ve yoğun nörit ou olarak kanser hücreleri ve arka plan malzeme, arasında çok açık bir farklılaşma yaratırtgrowth (ki otomatik floresan kırmızı). Bu protokol veya diğerleri tarafından tarif edilen takip olsun, bu genel deney tasarımı göreceli bebeklik ve PNI in vitro çalışma için bir altın standart uzakta bulunmaktadır. Bu nedenlerden dolayı, daha fazla bir yere metodoloji ortak geliştirme için büyük bir fırsat, detaylı bir şekilde tarif edilmiştir, bu deneyde yaklaşımlar.
Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi
deneyleri kurma birkaç farklı yaklaşımlar vardır gibi, sonuçlarını ölçmeye yarayan çeşitli yaklaşımlar vardır. Yukarıdaki metinde, hızlı bir şekilde, her deneyde perinöral invazyon derecesinin miktarını bulmak için tek bir yöntem sunulmuştur. fare başına 40 DRG'ler - Bu, özellikle bir 32 ayırabilirsiniz verilen PNI çok sayıda farklı yollar etkisini, tarama için idealdir. İleri görüntüleme teknikleri bir dizi PN, değerlendirmek için vardır,Belirli bir alan içinde floresan miktarı, mesafe ve hücre istilası oranı ve deney içindeki hücrelerin ham sayısı da dahil olmak üzere. Deney dinamik bölümü tamamlandıktan sonra, deney ve / veya yüzer olan hücreler daha da moleküler analiz için toplanabilir.
Bu deneysel metodoloji HNSCC ve diğer kanserlerin PNI katılan mekanizmaları aydınlatmak için bir fırsat sunuyor. Bu bilgi, şu anda, HNSCC eksik olan PNI, yollarını hedef tedavilerin gelişimini sürebilirim. PNI spesifik hedefleme zaman potansiyel olarak şu anda kullanılmaktadır böyle radyoterapi ve kemoterapi gibi spesifik olmayan adjuvan tedaviler, ihtiyacını ortadan kaldıran bir olumsuz patolojik özellik olarak belirledi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES | Corning Cellgro | 10-090-CV | Manassas, VA |
| Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11150 | Flowery Branch, GA |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies Corporation | 25200056 | Grand Island, NY |
| Phosphate buffered Saline 1x | Corning | 21-040-CM | Manassas, VA |
| Matrigel hESC-Qualif Mouse | Corning Incorporated | 354277 | Bedford, MA |
| Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Ashland, MA |
| SteREO Discovery.V8 Operating Microscope | Carl Zeiss Microimaging | 495015-0021-000 | Thornwood, NY |
| Schott ACE I light source | Schott | A20500 | Germany |
| CellTracker | Life Technologies Corporation | C2925 | Carlsbad, CA |
| BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G | BD | 305195 | Franklin Lakes, NJ |
| Premium Microdissecting Tweezer | Harvard Apparatus | 60-3851 | Holliston, MA |
| Premium Fine Operating Standard Scissors | Harvard Apparatus | 52-2789 | Holliston, MA |
| Premium Spring Scissors | Harvard Apparatus | 60-3923 | Holliston, MA |
| Dressing Forceps | Harvard Apparatus | 72-8949 | Holliston, MA |
| Athymic nude mice (002019) | Jackson Laboratory | 002019 | Bar Harbor, ME |
References
- Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin. 56 (2), 106-130 (2006).
- Hinerman, R. W., et al. Postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity: 35-year experience. Head Neck. 26 (11), 984-994 (2004).
- Rahima, B., Shingaki, S., Nagata, M., Saito, C. Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 97 (4), 423-431 (2004).
- Woolgar, J. A., Scott, J. Prediction of cervical lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue/floor of mouth. Head Neck. 17 (6), 463-472 (1995).
- Tai, S. K., et al. Treatment for T1-2 oral squamous cell carcinoma with or without perineural invasion: neck dissection and postoperative adjuvant therapy. Ann Surg Oncol. 19 (6), 1995-2002 (2012).
- George, D. L., et al. Nosocomial sinusitis in patients in the medical intensive care unit: a prospective epidemiological study. Clin Infect Dis. 27 (3), 463-470 (1998).
- Fagan, J. J., et al. Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (6), 637-640 (1998).
- Soo, K. C., et al. Prognostic implications of perineural spread in squamous carcinomas of the head and neck. Laryngoscope. 96 (10), 1145-1148 (1986).
- Parsons, J. T., Mendenhall, W. M., Stringer, S. P., Cassisi, N. J., Million, R. R. An analysis of factors influencing the outcome of postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 39 (1), 137-148 (1997).
- Liao, C. T., et al. Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in pT1-3N0 oral cavity cancer with tumor-free margins and perineural invasion. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 71 (2), 371-376 (2008).
- Fan, K. H., et al. Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher recurrence rates. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 77 (4), 1024-1029 (2010).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach. Hum Pathol. 38 (2), 299-307 (2007).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer: a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374 (3), 442-447 (2008).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
- He, S., et al. GFRalpha1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (19), 2008-2017 (2014).
- He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
- Bakst, R. L., et al. Radiation impairs perineural invasion by modulating the nerve microenvironment. PLoS One. 7 (6), 39925 (2012).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion. J Vis Exp. (110), (2016).
