Protocol
1. Voorbereiding van Cultuur Medium en gerechten (10 min)
- Voeg 100 pl Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) aan de putjes van een 96-well V-bodemplaat.
- Verwijderen van een pre-hoeveelheden verdeeld-flesje van ongeveer 100 pi van halfvaste matrix van het 20 ° C vriezer en plaats deze direct op het ijs.
LET OP: Doe dit voorafgaand aan de dorsale wortel ganglion (DRG) oogst, omdat de halfvaste matrix duurt ongeveer 30 minuten naar vloeibare toestand te bereiken op het ijs, die nodig zijn voor de volgende stappen is. Als u de halfvaste matrix op ijs te allen tijde te houden zal resulteren een slechte kwaliteit matrix druppel. - Label glazen bodem kweken platen met permanente inkt, het creëren van unieke identificatoren in elk van de vier hoeken op de onderzijde van de plaat. Leg de platen op de kop op het ijs op de plaat oppervlak te koelen.
Opmerking: Elke muis opbrengst 32-40 DRG, zodat labelen van 1 tot 40. Het is niet nodig om vooraf chill pihuisdier tips, zoals gekoelde tips zal opwarmen in de loop van het plaatsen van de matrix druppeltjes, mogelijk invoering van verschillen in de matrix consistentie.
2. Dissectie van muizen-DRG (45 min)
- Euthanize een athymische naakt muis volgens specifieke laboratoriumprotocollen, bijvoorbeeld door het gebruik van een CO 2 kamer en een thoracotomie.
- Stel de dissectie gebied en microscoop. Gebruik de schone, gesteriliseerd, en platte onderkant van polystyreen containers voor 15- of 50-ml conische buizen.
OPMERKING: Bovendien zijn zij geschikt voor gebruik als het ontleden ondergrond, zodat zij goedkoop, wegwerpbaar, en zorgen voor fixatie van de wervelkolom via pinnen of naalden. Gebruik alleen gesteriliseerde instrumenten en naalden. - Onder natuurlijk zicht Maak een longitudinale incisie langs de wervelkolom van de wortel van de staart aan het hoofd van de muis met een paar rechte of gebogen fijne schaar.
- Gebruik dezelfde schaar om dwars verdelen onder de sacral wervelkolom. Ontleden beide zijden van de wervelkolom helemaal tot aan de schedelbasis met de schaar. Op dit punt, opdat de cervicale wervelkolom craniaal wat wordt doorsneden mogelijk met een schaar.
- Acht het cervicale uiteinde van de wervelkolom onder behandelmicroscoop gering vermogen. De witte ruggenmerg blijkt in het midden van een benige ring, die wordt omgeven door variabele hoeveelheden paraspinale spieren en zacht weefsel.
- Splits de dorsale of hoger aspect van de eerste 2-3 wervels met microscopische voorjaar schaar. Met de veerwerking van de schaar, opent deze eerste bot snijden zodat het wervellichaam ontleding trad op de middellijn. Ga verder in kleine stappen in de richting van de sacrale wervelkolom, en dan halveren de ruggengraat door het invullen van de identieke bezuinigingen op het ventrale of inferieure aspect van de wervellichamen.
Opmerking: Het niet zorgen voor de middellijn dissectie van de benige wervelkolom zal leiden tot een lagere opbrengst DRG. - bij this punt wordt de wervelkolom in twee helften verdeeld. Plaats een hemi-rug opzij, met het ruggenmerg op zijn plaats en naar beneden op een steriele plaat.
Opmerking: Het verlaten van de ruggenmerg in plaats voorkomt de DRG uitdrogen, de DRG diep naar het ruggenmerg. - Secure beide uiteinden van de andere hemi-rug met twee 18-gauge naalden op de polystyreen ontleden platform. Vanaf het cervicale uiteinde (hetgeen blijkt doordat de wervelkolom is smaller, DRG dichter bij elkaar en er rib inserties) voorzichtig afpellen het ruggenmerg ongeveer 4 vertebrale niveaus.
- Houd u aan de gevoelszenuwen (meestal twee) die de DRG. In het gebied waar de zenuwen te voegen aan de DRG, voorzichtig grijpen van de omliggende fascia met een microscopische pincet. Ontleden en trim dit fascia en andere zenuwweefsel met de microscopische veer schaar om vrij te maken van de DRG. Gentle terugtrekking zal de DRG uit zijn positie te brengen binnen de benige wervelkolom.
LET OP: Het verhogen van demicroscoop vermogen bij deze stap is gunstig. Crush de DRG de groei van neurieten aanzienlijk beperken. Dit wordt voorkomen door de DRG nooit direct grijpen, maar door grijpen van de omringende fascia. - Snijd de perifere zenuw (DRG heeft over het algemeen een perifere zenuw, die diep ten opzichte van het ontleden weergave) met de microscopische veer schaar om de DRG vrij te geven.
Opmerking: Het is het gemakkelijkst te bepalen waar de zenuwuiteinden en DRG begint tijdens spanning, dus waardoor deze verlaging zo dicht mogelijk bij de DRG op dit punt is ideaal. Zodra dit distale tak wordt gesneden, worden de proximale takken als goed getrimd. - Trim de DRG van elke verdwaalde zenuwvezels of fascial bijlagen met de microscopische voorjaar schaar. Na adequate isolatie, plaatst u de DRG in de kamertemperatuur medium binnen de 96-well V-bodemplaat.
LET OP: Het plaatsen van een donkere achtergrond onder de plaat maakt het visualiseren van de sub-mm wit DRG gemakkelijker. Alleen plaats een DRG in each goed; Zo kunnen ze worden verwerkt gemakkelijker in de daaropvolgende stappen. - Herhaal dit proces helemaal naar beneden een hemi-wervelkolom en dan de andere. Elke kant levert 16-20 DRG's, in totaal 32-40.
Opmerking: Als er minder dan DRG wordt de ontleding van de wervelkolom moet verder craniale en / of caudaal te voeren. De DRG's worden steeds minder goed gedefinieerd als een verloopt caudaal.
3. Voorbereiding van semisolid Matrix Droplets (<1 min per plaat)
- Verwijder één glas goed bodemplaat van ijs en plaats het op een ijsblok onder de operationele microscoop. Controleer de hoeveelheid matrix blijft op ijs te allen tijde.
- Plaats een 1,5-ul druppel matrix in elk van de vier hoeken van de glazen bodemplaat met 2-pl of 10 pl micropipet, waardoor een afstand tenminste zo groot als de druppel zich van de rand van het glas ook.
- Plaats de punt van de pipet rechtstreeks ophet glas in een hoek van 45 graden. pipet langzaam de matrix. af te stappen langzaam van de glazen bodem nadat de matrix is actief op het bord.
NB: De oppervlaktespanning tussen de matrix en glas zou een perfecte halve bol te creëren elke keer. - Stoppen pipetteren net voor de tip leeg omdat onbedoelde injectie van lucht in de matrix druppel maakt de diameter van de druppel matrix veel groter en is moeilijk te verwijderen.
LET OP: Het gebruik van een tweede hand om de pipetteren de hand te stabiliseren vergemakkelijkt meer nauwkeurige plaatsing.
- Plaats de punt van de pipet rechtstreeks ophet glas in een hoek van 45 graden. pipet langzaam de matrix. af te stappen langzaam van de glazen bodem nadat de matrix is actief op het bord.
4. Het inbrengen van DRG in semisolid Matrix Droplets (<2 min per plaat)
- Laat de plaat met de matrix druppels kort bij kamertemperatuur (~ 1 min). Dit verstijft licht de matrix, waardoor het gemakkelijker voor de precieze plaatsing van de DRG.
- Scoop (niet begrijpt) de DRG voorzichtig met gesloten microscopische pincet in de linkerhand. Nogmaals, een donkere achtergrond tegen de kleine, witteDRG faciliteert visualisatie. Breng de DRG aan het uiteinde van een 21-gauge naald in de rechterhand. Deze overdracht zal de resterende media laten op de tang.
- Steek de DRG in het midden van de matrix druppel via een 21-gauge naald (figuur 1). De meeste van de tijd, zal de DRG gemakkelijk los in de matrix en dan kan centraal worden geplaatst met de naald.
- Als de DRG kleeft aan de naald, gebruik maken van de microscopische tang om de DRG te duwen off van de naald en in de matrix druppel. Wick overtollige papier uit de microscopische tang met een lab te vegen.
OPMERKING: Invoering media aan de matrix zal de diameter, volume en consistentie van de test te veranderen. Een ijsblok met kleur of gekleurde schrijven geeft achtergrondinformatie contrast, waardoor visualisatie van deze delicate proces vergemakkelijkt.
- Als de DRG kleeft aan de naald, gebruik maken van de microscopische tang om de DRG te duwen off van de naald en in de matrix druppel. Wick overtollige papier uit de microscopische tang met een lab te vegen.
- Nadat de plaat vier DRG, voeren een eindcontrole zodat de DRG in het midden van de matrix druppel. aanpassingen makenals dat nodig is met de 21-gauge naald.
- Breng de voltooide plaat om een 37 ° C incubator. Dit zal de halfvaste matrix stollen en bevestig de DRG in positie.
- Herhaal dit proces voor alle DRG. Plaats lege matrix druppels zonder DRG als de negatieve controle.
- Voeg 4 ml DMEM met 10% FBS media elke glazen bodemplaat na het voltooien van alle platen en bloot te stellen aan de 37 ° C incubator gedurende ten minste 3 min. Plaats de plaat onder een kleine hoek en voeg langzaam het medium, zodat het geleidelijk in contact komt met de matrix-DRG eenheden.
OPMERKING: Als het medium te snel of krachtig wordt toegevoegd, de matrix en / of DRG kan verdreven worden. - Bewaar de assays in de 37 ° C incubator gedurende de volgende 48-72 uur.
OPMERKING: Periodiek onderzoek van de assays zullen omtrek uitgroei van neurieten naar de matrix (figuur 2) tonen. Wanneer de neurieten groter zijn dan driekwart van de weg aan de matrix, tegeschikt is om de cellen te plaat.
5. Voorbereiding van de Head and Neck Cancer Cells
Opmerking uitzondering hoofd en hals plaveiselcel carcinoma cellen Cellijnen kunnen worden gebruikt in deze experimentele ontwerp.
- Onderhouden plaveiselcelcarcinoom cellijnen in DMEM met 10% FBS bij voorkeur kolven of kweekschalen in een 37 ° C incubator. Om cellen voor experimenten, zuig al het medium uit de kolf of schotel te bereiden en was het twee keer met PBS. Suspendeer de cellen door toevoeging van een geschikte hoeveelheid van 0,025% trypsine gedurende 5 minuten, gevolgd door DMEM met 10% FBS. Pipetteer 4 ml van de cel en media mengsel in 6 ml kweekschalen.
OPMERKING: Een 6-mL kweekplaat biedt meer dan genoeg cellen, zelfs wanneer er minder dan 50% confluent. - Blootstellen HNSCC cellijnen verschillende omstandigheden 24 uur voor kleuring en uitplaten op DRG assay. Re-dosis de toestand zodra de cellen worden bedekt om een consistente environme behoudennt.
OPMERKING: antilichamen, groeifactoren, cytokinen, of andere moleculen Naar de celkweekschalen 1-2 dagen na dissectie muis en implantatie van de DRG in de matrix. - Voeg fluorescerende cel vlekken 1 uur voor het uitplaten van de cellen (2-3 dagen na de oogst en DRG implantatie in de matrix).
LET OP: De bijzondere vlekken die hier gebruikt passeren vrij door het celmembraan; echter, na een reactie met intracellulaire thiolgroepen, de vlek blijft in de cel en wordt doorgegeven aan dochtercellen. De kleuring aanzienlijk vergemakkelijkt visualisatie in de assays. Deze tijdelijke vlekken zijn ideaal voor deze testen omdat de fluorescentie aanwezig is 2 - 3 dagen, welke de looptijd van deze experimenten. Het maakt ook het gebruik van veel verschillende kleuren en ondervangt de behoefte bestaat fluorescerend eiwit getransfecteerde cellijnen.- Bereid 10 uM kleurstofoplossing door het mengen van 2 pl van 10 mM stock cel vlekken in 2 ml serumvrij DMEMvoor elke cel staat. Warm deze tot 37 ° C alvorens het aan cellen.
- Verwijder het kweekmedium binnen de 6-mL plaat, waardoor de hechtende HNSCC cellen op het bord. Voeg 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en verwijder 2 ml van de 10 uM cel vlek / serumvrij DMEM toegevoegd aan elke plaat
- Zet de 6-mL cultuur plaat met de cel vlek op de 37 ° C incubator gedurende 40 minuten.
- Na 40 min, zuig het medium. Voeg 2 ml PBS en zuig het dan. Voeg 1 ml 0,025% trypsine aan elke plaat en vervangen in de 37 ° C incubator.
- Voeg 2 ml DMEM met 10% FBS na 3-5 minuten en breng de gesuspendeerde cellen een 15-ml conische buis. Draai de cellen opnieuw gesuspendeerd ze in 1 ml DMEM met 10% FBS.
- Tel de cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celgetalmeter, en vervolgens toevoegen DMEM 10% FBS tot een uiteindelijke celconcentratie van 300.000 cellen per ml te maken.
6. Plating Head en Neck kankercellen
- Verwijder de glazen bodem platen met de matrix-DRG assays uit de incubator.
OPMERKING: Ook zijn zij geschikt als neurieten ten minste 75% van de weg naar de rand van de matrix, die gewoonlijk plaatsvindt na 2-3 dagen. Dit is het beste te zien met behulp van ten minste een 10X objectief. - Zuig het medium binnen de glazen bodemplaat. Volledig zuig het medium binnen het glas goed zonder het verwijderen van de matrix-DRG-eenheden.
- Opstellen 200 pi van de 300.000 cellen / ml medium met een 200-gl pipet. Plaats twee druppels van de cellen over elke matrix-DRG assay. Voer deze stap voor elke matrix druppel, het creëren van vier herhalingen van elke cel staat op een bord.
OPMERKING: De halfronde vorm van de matrix kan de cellen zich in een ring langs de omtrek van de assay (figuur 3a, figuur 3b). Het vinden van een pipet met een gladde trekker maakt plaatsing van uniforme daalt veel gemakkelijker. - Bevestig soortgelijke cel aantallen en distribution van de verschillende cel voorwaarden 4X microscopie.
- Plaats de glazen bodem platen in de 37 ° C incubator gedurende ongeveer 60 minuten. OPMERKING: Hoewel er slechts een klein volume van cellen en media (~ 150 pi) zijn de assays niet uitdrogen tot enkele uren incubator tijd is verstreken.
- Na 60 min zachtjes voeg 4 ml DMEM met 10% FBS aan de zijwand van de glazen bodemplaat.
OPMERKING: Over een periode van tijd, de cellen gedeeltelijk hechten aan de plaat bodem en de werkwijze van het toevoegen van het medium niet de cellen verstoren. Verschillende celtypen maken meer of minder tijd om te beginnen zich te houden aan de glazen bodemplaat. - Vervang exogene groeifactoren of geneesmiddelen op dit moment de vorige concentratie vast te houden.
- Zet de assays voor de 37 ° C incubator, behalve wanneer zij microscopisch onderzocht. Kwantificeren van de resultaten van deze test door microscopische beeldvorming. In het kort, de telling van de strengen van perineurale invasie metin vier kwadranten met behulp van een afbeelding 4X microscopische.
LET OP: Een microscoop met een 4X doelstelling en fluorescentie mogelijkheden is geschikt voor foto-documenteren van de testen. De grootte van de assays ligt goed binnen het gebied van een 4X doelstelling, die genoeg is om de afzonderlijke gebieden van perineurale invasie vangen is gedetailleerd. Perineurale invasie duidelijk na 24 uur, maar na 48 uur, de integriteit van de testen begint te verzwakken, omdat de tumorcellen te verdelen langs de omtrek van de matrix en binnenvallen. Dan 48 uur is er ook aanzienlijke uitstroming van fibroblasten van de DRG, die visualisatie verduistert behulp helderveld microscopie. Daarom is het raadzaam om foto-document de resultaten 4X microscopie ten minste twee keer het venster (bijvoorbeeld op 24 en 48 uur na het uitplaten van de tumorcellen). Wees ervan bewust dat deze 3-dimensionale assays, en het is moeilijk om volledig beeld de gehele test. Meest perineurale invasie plaatsvindt in een vlak van de bodem van de plaat, waarbij thij cellen zijn ingebed in de matrix iets boven de bodem van het schaaltje. Omdat dit vlak ligt vlakbij horizontaal, de meeste neurieten met tumorcellen opname één-niveau in 4X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na dissectie van de DRG en de plaatsing in de matrix druppel dient het uiterlijk van de assay lijken Figuur 1. Merk op dat de DRG niet perfect rond, maar het is gecentreerd in de matrix druppel. Dit maakt de uitgroei van neurieten in 360 graden, gedeeltelijk in figuur 2 getoond. Wees ervan bewust dat bepaalde delen van de DRG sturen neurieten sneller en in grotere aantallen dan andere, typisch aangeeft waar de efferente en afferente zenuwbanen ingevoerd en verliet de DRG respectievelijk. We zijn goed voor dit en voor de grootte verschillen tussen DRG door willekeurig plating de DRG's in groepen van 4 en vervolgens willekeurig toewijzen van een bepaalde plaat elke cel staat.
Zoals hierboven beschreven, plaat wij HSNCC cellijnen nadat de neurieten tenminste ¾ van de manier uitgebreid tot de rand van de matrix, die typisch opdag 3. De toegevoegde cellen vormen een rondlopende ring rond de matrix (Figuur 3a). Vervolgens hebben we fotograferen de testen op dag 4 (figuur 3b) en dag 5 (figuur 3c). De cellijn hier getoonde (FaDu) toont een bovengemiddeld vermogen om spoor langs neurieten. De SQCCY1 cellijn figuur 4 toont echter weinig tot geen neiging tot het testen binnenvallen.
Bij gebruik van een nieuwe cellijn, is het importeren naar een aantal negatieve controles te gebruiken om te onderzoeken hoe die bepaalde cellijn gedraagt zich rond de test. Ten eerste plaat cellen aan een "blanco" test bestaat uit matrix alleen (Figuur 5). Alle cellijnen die ons lab actief onderzocht verdelen over de matrix, maar niet voorkomen en uitstrekken over de bovenkant van de matrix. Bij buitengewone cellen overblijven bovenop de matrix, kan aanzienlijke groei in de matrix. Dit onderstreept de noodzaak om eNSure dat zoveel cellen vallen aan de omtrek van de matrix mogelijk, in plaats van met rust gelaten en verdeel bovenop de matrix. Dit kan door voorzichtig tikken op geïncubeerd voordat de cellen hechten of pipetteren kleine hoeveelheden media direct op de matrix druppel wanneer de cellen begonnen zich te houden aan de glasplaat.
Een tweede negatieve controle, waarbij de cellen worden uitgeplaat op dezelfde dag dat de DRG wordt geplaatst in de matrix, kan worden uitgevoerd. Het doel van deze benadering is aangetoond dat het geen neurotrope aantrekkingskracht die de cellen rijdt naar het DRG, maar dat de aanwezigheid van de neurieten verplicht. Bovendien, als tumorcellen langs de omtrek van de matrix langer dan 2 dagen hebben verbleven, de matrix rand wordt onduidelijk. De matrix begint dan tillen van de glazen bodem en vindt vrij zwevend in de media kort daarna. Daarom is deze protocol beschrijft het plateren HNSCC cellen eenmaal de neurieten 75% van de afstand uitgebreid tot de rand van de matrix.
Er zijn talloze mogelijkheden voor het kwantificeren van de resultaten van wat visueel zeer duidelijke verschillen tussen assays. Bij een dergelijke werkwijze worden de beelden van de assays verdeeld in vier kwadranten met een verticale en een horizontale lijn (figuur 6). Een punt wordt toegekend voor elk kwadrant dat tenminste een boom van PNI heeft. Als de PNI verder dan 50% van de weg van de rand van de matrix om de DRG, vervolgens 2 punten plaats toegewezen. Op deze manier, een score van 0 - 8 punten kan worden toegewezen. Het grootste voordeel van dit systeem is dat testen die teveel PNI units rekenen moeten snel kunnen worden geëvalueerd. Een nadeel is dat is niet voldoende de mate van PNI (dwz een kwadrant met 1 neuriet met de invasie van 100% van de afstand tot de DRG krijgt dezelfde score uit te drukken (2) als een quadrant met 10 op dezelfde manier-binnengevallen neurieten). Vergelijking van de helderveld en fluorescerende beelden maakt dit systeem zeer eenvoudig, zelfs met een aanzienlijke fibroblast efflux.
Monster scoring is getoond in figuur 6. Gebruik vier kwadranten scoresysteem voor figuur 3, 0 punten, 2 punten en 7 punten werden toegewezen panelen figuur 3a, Figuur 3a en Figuur 3c respectievelijk. Figuur 4 kreeg een score van 2 punten en 2 punten in panels figuur 4a en figuur 4b, respectievelijk. De gegevens in tabel 1 toont de resultaten van een aantal experimenten met cellijnen FaDu en SQCCY1. Merk op dat zelfs met een beperkte beoordelingsschaal als deze statistisch significante verschillen in de gemiddelde vierkwadrantendetektor scores worden gemakkelijk verkregen volgens de onafhankelijke T-toets.
Figuur 1. DRG-matrix Assay. Correcte plaatsing van de dorsale wortel ganglion in de matrix druppel, getoond met helderveld microscopie op 4X. Schaal bar vertegenwoordigt 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. uitgroei van neurieten. Neurieten afwezig op dag 0 direct na plaatsing van de DRG in de matrix druppel (A). Overdag 1 (B), neurietuitgroei blijkt bij 10X op helderveld microscopie. Neuriet groei gaat op dag 2 (C) en dag 3 (D); Maar, let op de uitstroom van de fibroblasten. Scale bar vertegenwoordigt 0,1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. DRG-matrix Assay met FaDu. Hoofd en hals plaveiselcel carcinoma lijn FaDu toegevoegd omtrek rond een assay op dag 3 (A), in het groen fluorescentie en helderveld microscopie bij 4X progressieve neurale invasie gezien op dag 4 (B) en dag 5 (C). Schaal bar vertegenwoordigt 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. DRG- matrix Assay met SQCCY1. Hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom lijn SQCCY1 toegevoegd op dag 4 (A), getoond in helderveld en groene fluorescentie microscopie op 4X. Merk op dat deze cellijn niet zo bedreven in perineurale invasie FaDu, zelfs na dag 5 (B). Schaal bar vertegenwoordigt 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Matrix Assay met FaDu. Hoofd en hals plaveiselcel carcinoma cellijn FaDu toegevoegd om een matrix druppeltje zonder DRG op dag 3. helderveld en groene fluorescentie microscopie (4X) getoond op dag 4 (A). Merk op dat de tumorcellen niet de matrix invoeren of groeien in de bovenkant ervan, zelfs op dag 5 (B). Schaal bar vertegenwoordigt 1 mm.ttp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Vier-kwadrant Werkwijze voor Assay kwantificering. Een punt wordt toegewezen voor elke kwadrant een PNI minder dan 50% van de afstand van de rand van de matrix om de DRG. 2 punten worden toegewezen wanneer de PNI reikt dan 50%. Het eerste voorbeeld (A) een score van 5 krijgt (1 punt voor elke kwadrant een PNI minder dan 50%, behalve de rechtsonder, die een PNI verder reikt dan 50%, waarbij 2 punten worden gescoord heeft). Het tweede voorbeeld (B) wordt gescoord als 8 (a PNI dan 50% in alle vier kwadranten). Schaal bar vertegenwoordigt 1 mm. Klik hier om vIEW een grotere versie van deze figuur.
| cellijn | n | dag 4 | SD | P-waarde | dag 5 | SD | P-waarde |
| FaDu | 24 | 2.88 | 1.42 | Ref | 6.04 | 0.35 | Ref |
| SQCCY1 | 20 | 0.60 | 0.60 | <0,001 | 1.05 | 0.17 | <0,001 |
Tabel 1. Vergelijking van de PNI Tussen FaDu en SQCCY1. Gemiddelde vierkwadrantendetektor scores zie figuur 6 tussen de cellijnen FaDu en SQCCY1 bij 24 uur (dag 4) en 48 uur (dag 5) nadat de cellen werden rond de DRG-matrix assay. Vergelijkingen worden gemaakt met behulp van de onafhankelijke sample t-test en tezamen met de standaarddeviatie (SD) en P-waarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in het protocol
De belangrijkste stappen in dit protocol zijn de precieze dissectie en extractie van de dorsale wortel ganglia. Goede doorsnijding van de wervelkolom en een middellijn-longitudinale tweedeling hemi-stekels zijn essentieel voor het verkrijgen van grote aantallen DRG. Bij de dissectie van individuele DRG, de ganglion nooit rechtstreeks behandeld, maar de omringende fascia worden vastgepakt met de microscopische pincet. Gebeurt dit niet resulteert in een verbrijzelingsletsel van de DRG, dat waarschijnlijk de belangrijkste oorzaak van mislukking voor neurietuitgroei. Het is veel beter om onder-trim de omringende neurale weefsels tijdens de dissectie dan om risico's over-behandeling van de DRG en het verkrijgen van geen neuriet groei in de test.
Wijzigingen en problemen oplossen
De experimentele werkwijze als hierboven geeft de optimale voldaanhodology vastgesteld op basis van een groot aantal procedurele aanpassingen die over meerdere jaren. direct vermeld onder de desbetreffende stap in de sectie protocol is een aantal nota's en valkuilen die voortvloeiden uit de ervaringen van de auteurs bij het gebruik van deze methode. Gezien het aantal stappen die betrokken zijn, zijn er inderdaad veel wijzigingen die bij dit protocol kunnen worden gemaakt door toekomstige onderzoekers. Zoals de ervaring met deze wijzigingen groeit, wordt verwacht dat bijkomende middelen van het oplossen van problemen zullen worden ontwikkeld op basis van de voorkeuren van het onderzoeksteam.
Beperkingen van de Techniek
Er zijn drie belangrijke beperkingen aan deze techniek. De eerste is dat zeer fijne neurieten worden gebruikt als een surrogaat voor grote neurale invasie, wat pathologen observeren tumormonsters. Het is niet bekend welke rol neurieten, in tegenstelling tot neuronen, in vivo omdat identificatie perineuriteinvasie is dan de mogelijkheden van een routine histopathologisch onderzoek. Ten tweede perineurale invasie is een vorm van zacht weefsel invasie die niet alleen tumorcellen en een aangrenzende neuron kan, zoals gesimuleerd in deze test. Als zodanig exogene factoren afkomstig uit de in vitro tumor milieu ontbreken in deze test. Tenslotte wordt de periode gedurende welke PNI bestudeerd kunnen worden beperkt tot ongeveer 48 uur door de combinatie van fibroblast efflux en verlies van integriteit matrix. Zo zal cellijnen die efficiënt bij neurale invasie maar traag verdelen en / of invasie gemist worden geacht niet bedreven in PNI zijn.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods
Voor zover wij weten is dit de enige in vitro model momenteel beschikbaar voor PNI onderzoeken HNSCC. Gezien de frequentie waarmee PNI optreedt in HNSCC en de beperkte kennis van de mechanismennu bestaat, deze werkwijze is voordelig om verschillende redenen. Ten eerste, het heeft een zeer hoog slagingspercentage en uitstekende reproduceerbaarheid. De totale experiment tijd is ook relatief klein in vergelijking met gelijkaardige protocollen 12,17-19. Tenslotte wordt via talrijke assays die kunnen worden gegenereerd uit een enkele muis, veel voorwaarden kan worden getest met wetenschappelijk geschikte duplo's. De combinatie van deze factoren maakt de snelle beoordeling van een groot aantal verschillende aandoeningen met consistente resultaten.
Tegelijkertijd de hoge kwaliteit van de assay maakt nader onderzoek naar de interactie tussen de tumorcellen en de neurieten. Het gebruik van de live-cell imaging zorgt voor de appreciatie van de neurietuitgroei-proces en de HSNCC cel invasie in time-lapse video vorm. De toevoeging van fluorescent gekleurde cellen maakt duidelijk onderscheid tussen de kankercellen en achtergrondinformatie, zoals fibroblasten en dichte neurieten outgrowth (die auto-fluoresceren rood). Of na dit protocol of die beschreven door anderen, het algemene experimentele opzet is in de relatieve kinderschoenen en is verre van een gouden standaard voor het in vitro onderzoek van PNI. Daarom, hoe zal deze assay die worden beschreven in detail, hoe groter de kans voor de gezamenlijke ontwikkeling van een ideale methode.
Toekomstige toepassingen of richtingen na Mastering deze techniek
Net zoals er verschillende benaderingen voor het opzetten van de testen, zijn er verschillende benaderingen voor het meten van de resultaten. In de bovenstaande tekst, een methode om snel het kwantificeren van de mate van perineurale invasie in elke assay werd gepresenteerd. Dit is ideaal voor het screenen van het effect van een groot aantal verschillende wegen op PNI, vooral omdat men isoleren 32-40 DRG per muis. Er zijn een aantal geavanceerde beeldvormingstechnieken te beoordelen PNI,waaronder de hoeveelheid fluorescentie binnen een bepaald gebied, de afstand en snelheid van celinvasie en het ruwe aantal cellen in de assay. Zodra het dynamische deel van het experiment is voltooid, kunnen de cellen in de assay en / of het supernatans worden verzameld voor verdere moleculaire analyse.
Deze experimentele methode biedt de mogelijkheid om mechanismen betrokken bij de PNI van HNSCC en andere kankers helderen. Deze kennis kan de ontwikkeling van therapeutica rijden naar de paden van PNI, die op dit moment ontbreekt in HNSCC targeten. Specifiek richten PNI wanneer die als bijwerking pathologische kenmerk kan mogelijk overbodig maken de niet-specifieke adjuvante therapieën, zoals stralingstherapie en chemotherapie, die momenteel worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES | Corning Cellgro | 10-090-CV | Manassas, VA |
| Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11150 | Flowery Branch, GA |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies Corporation | 25200056 | Grand Island, NY |
| Phosphate buffered Saline 1x | Corning | 21-040-CM | Manassas, VA |
| Matrigel hESC-Qualif Mouse | Corning Incorporated | 354277 | Bedford, MA |
| Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Ashland, MA |
| SteREO Discovery.V8 Operating Microscope | Carl Zeiss Microimaging | 495015-0021-000 | Thornwood, NY |
| Schott ACE I light source | Schott | A20500 | Germany |
| CellTracker | Life Technologies Corporation | C2925 | Carlsbad, CA |
| BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G | BD | 305195 | Franklin Lakes, NJ |
| Premium Microdissecting Tweezer | Harvard Apparatus | 60-3851 | Holliston, MA |
| Premium Fine Operating Standard Scissors | Harvard Apparatus | 52-2789 | Holliston, MA |
| Premium Spring Scissors | Harvard Apparatus | 60-3923 | Holliston, MA |
| Dressing Forceps | Harvard Apparatus | 72-8949 | Holliston, MA |
| Athymic nude mice (002019) | Jackson Laboratory | 002019 | Bar Harbor, ME |
References
- Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin. 56 (2), 106-130 (2006).
- Hinerman, R. W., et al. Postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity: 35-year experience. Head Neck. 26 (11), 984-994 (2004).
- Rahima, B., Shingaki, S., Nagata, M., Saito, C. Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 97 (4), 423-431 (2004).
- Woolgar, J. A., Scott, J. Prediction of cervical lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue/floor of mouth. Head Neck. 17 (6), 463-472 (1995).
- Tai, S. K., et al. Treatment for T1-2 oral squamous cell carcinoma with or without perineural invasion: neck dissection and postoperative adjuvant therapy. Ann Surg Oncol. 19 (6), 1995-2002 (2012).
- George, D. L., et al. Nosocomial sinusitis in patients in the medical intensive care unit: a prospective epidemiological study. Clin Infect Dis. 27 (3), 463-470 (1998).
- Fagan, J. J., et al. Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (6), 637-640 (1998).
- Soo, K. C., et al. Prognostic implications of perineural spread in squamous carcinomas of the head and neck. Laryngoscope. 96 (10), 1145-1148 (1986).
- Parsons, J. T., Mendenhall, W. M., Stringer, S. P., Cassisi, N. J., Million, R. R. An analysis of factors influencing the outcome of postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 39 (1), 137-148 (1997).
- Liao, C. T., et al. Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in pT1-3N0 oral cavity cancer with tumor-free margins and perineural invasion. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 71 (2), 371-376 (2008).
- Fan, K. H., et al. Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher recurrence rates. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 77 (4), 1024-1029 (2010).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach. Hum Pathol. 38 (2), 299-307 (2007).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer: a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374 (3), 442-447 (2008).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
- He, S., et al. GFRalpha1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (19), 2008-2017 (2014).
- He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
- Bakst, R. L., et al. Radiation impairs perineural invasion by modulating the nerve microenvironment. PLoS One. 7 (6), 39925 (2012).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion. J Vis Exp. (110), (2016).
