This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.
One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.
En av de viktigste spørsmålene i forståelse anlegget utvikling er hvordan enkeltceller oppfører seg under orgel differensiering og vekst. Ideelt sett cellulære hendelser, som genuttrykksmønster og intracellulært protein lokalisering, kan ses i lys av en større sammenheng av vevet. Dette målet utgjør tekniske utfordringer og krever hele organ observasjon med høy romlig samt tidsmessig oppløsning over lengre perioder, som kan forårsake fototoksiske effekter. Siden planter raskt tilpasse seg miljøendringer, må vekstforhold bli kontrollert. For å gjøre langvarig avbildning uten å forstyrre den fysiologiske tilstand av anlegget, tre ting må sikres, 1) vekstbetingelser i prøvekammeret, 2) stabil prøve montering over lange tidsperioder, og 3) den avbildning med lav lysintensitet å unngå foto-skade og ikke-fysiologiske forhold.
Fysiologisk voksende Kondisjoneons i mikroskopet prøvekammeret er avgjørende for langsiktig eksperimenter. Det finnes en rekke protokoller som er tilgjengelige som beskriver avbildningsvekstkammer for konfokale mikroskop 1 – 3. Men introduserer konfokalmikroskopi høy lys intensitet til anlegget, noe som kan føre til stressreaksjoner og vanligvis hemmer veksten fire. I tillegg har de fleste konvensjonelle mikroskop tillate bare horisontal posisjonering av prøven, som ikke er optimal for planter, siden de forsøker å reorientere seg og vokse inn i vektoren av tyngdekraften. I løpet av de siste ti årene, har lys-ark mikros dukket opp som et kraftig verktøy for å fange opp utviklingen av store prøver på celle oppløsning for tidsperioder på opp til flere dager 5 – 9. Lys-ark mikroskopi tillater plassering av prøven vertikalt og blir stadig mer brukt i planteforskning studere rotutvikling 10-21, nylig gjennomgått av Berthet og Maizel 22. Mange av de nevnte studiene 10,13 – 18,21 ble optimalisert og utført i laboratoriet av Ernst HK Stelzer anvendelse av en spesiell måte å prøve monterings karakterisert ved voksende roten på overflaten av en gel 17. I disse studiene ble en skreddersydd mikroskop, karakterisert ved at anlegget holdes fra bunnen. I motsetning til flertallet av bredt tilgjengelige lys-ark mikroskoper holde prøven fra toppen. Således, denne fremstillingsmetoden kan ikke lett anvendes. Metoden som presenteres her gir en protokoll for de veletablerte på-montering metoden gjelder for OpenSPIM 23, en åpen tilgang plattform for å påføre og styrke Selektiv Plane Illumination Mikroskopi (SPAM).
Det overordnede målet med denne protokollen er å gi langsiktig avbildning av Arabidopsis røtter i OpenSPIM lys-ark mikroskop. Dette oppnås ved å dyrke en plante oppreist på surface av en gel med røttene i et flytende medium mens bladene forblir i luften. For å sikre fotosyntetiske aktivitet av anlegget, tennes et skreddersydd lyssystem bladene, men ikke røttene (figur 1).
Lett Blad Fluorescensmikroskopi har den store fordel å kombinere lav fototoksisitet og ultra anskaffelse hastighet, som kan brukes til å fange et stort volum med et høyt rom-tid-oppløsning samtidig holde prøven i en fysiologisk tilstand. Oppløsningen av en lys ark mikroskop kan sammenlignes med den for et konfokalt mikroskop 9. Imidlertid lysspredning og absorpsjon skjer langs eksitasjon og emisjon sti enkeltvis og den generelle bildekvaliteten kan være betydelig lavere på innsiden ugjennomsiktig vev i forhold til overflaten. For å unngå denne komplikasjon kan man benytte muligheten til å rotere prøven langs den vertikale aksen, og observere det samme volum fra forskjellige retninger. Men dette er ikke alltid en fordel, for eksempel lateral røtter dukke opp på den ene siden av roten og bildebehandling bakfra resulterer i en lav bildekvalitet uten å få mer informasjon. Imidlertid kan rotasjons hovedsak skal brukes for å posisjonere sample på best mulig måte. Den klassiske horisontale anordning av objektivlinser åpner for nye måter å prøve montering. Planter dra nytte av en vertikal posisjon. Presentert her, er "på overflaten av gelen" monteringsmetode har flere fordeler sammenlignet med andre festemetoder, slik som å bygge inn roten innsiden av en gel 24,25. 1) Den rotsystemet er i direkte kontakt med det flytende medium. Prøvekammeret er koblet til en perfusjon system som tilveiebringer kontinuerlig friskt medium. Den kan også brukes til hurtig å utveksle hele volumet av prøvekammeret for å bruke forskjellige medier eller medikamenter. 2) Før prøveopparbeidelse planter vokser som de er vant til å dyrke i laboratorier. Planter kan velges under en fluorescens mikroskop og bare de ønskede planter trenger å være forberedt. 3) anlegget blir overført fra petriskålen til prøveholderen, uten å bli berørt. Derved kan anlegget kan videreutvikle på den samme gelen det vokste på i vekst incubator og mekaniske påkjenninger reduseres til et minimum. 4) Visningen på prøven er uhindret og optiske aberrasjoner blir minimalisert fordi rommet mellom prøven og deteksjons målet er utelukkende fylt med medium og ingen andre materialer med forskjellige brytningsindekser.
For å kunne utføre langvarige avbildning, er anlegget belysningssystemet er nødvendig for å sikre at fotosyntetiske aktivitet av anlegget. I de fleste laboratorier planter vokser på en gjennomsiktig gel, dvs. røttene blir utsatt for lys. Dette kan føre til ulike reaksjoner på deres miljø og induserer endringer i biokjemi og utvikling 26,27. For å redusere mengden av lys på rotsystemet, ble sort plast folie som brukes til å dekke vannflaten, samt et lokk fremstilt av svart aluminiumsfolie dekket prøvekammeret. Lys kan nå planten går ut gjennom det sentrale hull i lokket. I dette oppsettet, ble det ikke observert noen økning i bakgrunnslyset, suggesting at mengden av strølys fra de røde og blå lysdioder ble betydelig redusert ved GFP filter og skyggelegging tilnærminger. Dette gjorde holde lyset slått på under bildet oppkjøpet uten å øke kameraets bakgrunnsstøy.
Prøveholderen er designet for 3D-utskrift. Imidlertid er valget av materiale avgjørende som flere plastmaterialer som ble testet ikke var 100% stabilt, noe som resulterer i en drift av prøven. Derfor er det anbefalt å bruke harpiks i stedet, eller bygge prøveholderen ved å frese en Polyetylen (PEP) stang. Ved bruk av en lett plate mikroskop oppsett med dobbeltsidig belysningssystem prøveholderen kan påvirke en av de lette plater, avhengig av rotasjonsvinkelen. For å redusere mekanisk påkjenning under øste anlegget fra platen, bruk en flat vinkel på slikkepott. Anlegget kan raskt tørke ut og erfaring luftstrøm for aller første gang. Prøv å unngå luft utkast (raske bevegelser, air-condition flow), work uavbrutt og skyv prøveholderen inn i en 1000 mL pipette tips når det er mulig. Inne i mikroskop, er det viktig å ikke dyppe hele anlegget i flytende og holde bladene tørre.
Teknikken er ideell for avbilding av tidlige stadier av lateral rot formasjonen. Når du utfører langsiktig avbildning av modne root tips man må huske på at Arabidopsis røttene vokser med 100-300 nm / t raskt ut av synsfeltet. En veldig nyttig fremtidig implementering kan være en automatisert sporing algoritme, som ville tillate følgende rotspissen vekst over lengre perioder. Evnen til å kontrollere omgivelsesforhold som lys og næringsblanding av mediet under innhentingsprosessen gjør det mulig å undersøke hvordan plantene tilpasse seg endringer. Roten er i direkte kontakt med det flytende mediet, som kan anvendes for å påføre legemidler for kjemisk å aktivere genekspresjon, for eksempel ved anvendelse av deksametason-induserbar 28 eller den β-estradiol induserbar system 29. Det tar imidlertid tid å bytte hele volumet av prøvekammeret for å vaske ut et medikament. Oppsettet kan forbedres ved å minimere volumet av prøvekammeret for å akselerere medium utveksling. Likevel har denne teknikken et stort potensial. Kombinasjonen av monteringsprosedyren, standardiserte vekstforhold og den milde bilde oppkjøpet ved hjelp av lys-ark mikroskopi tillater langtidsstudier av anlegget utvikling med høy oppløsning på en fysiologisk nivå. Dette vil hjelpe forskerne til å utforske grunnleggende mekanismer av planteutvikling.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Matyáš Fendrych for kritisk lesing / visning og Stephan Stadlbauer for lydutstyr. Takket være Miba Machine Shop på IST Østerrike for deres bidrag til OpenSPIM. Den forskning som fører til disse resultatene har mottatt støtte fra Folke Programme (Marie Curie Actions) i EUs sjuende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under REA tilskuddsavtalen n ° [291734] og European Research Council (prosjekt ERC-2011 -StG-20101109-PSDP).
Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
LED board – PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
Square petri dishes (245x245x25 mm) | VWR | 734-2179 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |