Introduction
אחת משאלות המפתח בהתפתחות צמח הבנה הוא כיצד תאים בודדים להתנהג במהלך התמיינות וצמיחת איברים. באופן אידיאלי, אירועים הסלולר, כמו דפוסי ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון תאי, ניתן לראות את האור של הקשר רחב של הרקמה. מטרה זו מציבה אתגרים טכניים ודורשת התבוננות איבר שלמה עם מרחבית גבוהה וכן פתרון זמני על פרק הזמן ממושך, אשר עשוי לגרום לתופעות צילום רעילים. מאז צמחים להסתגל במהירות לשינויים סביבתיים, תנאי הגידול חייבים להיות תחת פיקוח הדוק. כדי לעשות הדמיה לטווח ארוך מבלי להפריע את המצב הפיזיולוגי של הצמח, שלושה דברים צריכים להיות מובטחים, 1) תנאי גידול בתא המדגם, 2) מדגם יציב גובר על פני תקופות זמן ארוכות, ו 3) ההדמיה עם לעוצמות אור נמוכות כדי למנוע מצבים צילום נזק הלא פיזיולוגי.
conditi גדל פיסיולוגיons בתא מיקרוסקופ הדגימה הם קריטיים עבור ניסויים לטווח ארוך. ישנם מספר של פרוטוקולים זמינים המתארות תאי גידול הדמיה עבור מיקרוסקופי confocal 1 - 3. עם זאת, מיקרוסקופיה confocal מציגה-עוצמת אור גבוהה למפעל, אשר יכול לגרום לתגובות של מצוקה נפשית ובדרך כלל מעכבת את הצמיחה 4. בנוסף, רוב המיקרוסקופים קונבנציונליים לאפשר מיקום אופקי בלבד של המדגם, אשר אינו אופטימלי עבור צמחים מאז הם מנסים לכוון את עצמם ולגדול לקראת וקטור כובד. במהלך עשר השנים האחרונות, מיקרוסקופ אור הגיליון התפתחה ככלי רב עצמה כדי ללכוד את הפיתוח של דגימות גדולות ברזולוציה הסלולר לפרקי זמן של עד כמה ימים 5 - 9. במיקרוסקופ אור הגיליון מאפשרת מיצוב הדגימה אנכית והוא משמש יותר ויותר במחקר צמח לומדת פיתוח שורש 10 - 21, נבדק לאחרונה על ידי ברt ו מייזל 22. רבים מן המחקרים שהוזכרו 10,13 - 18,21 היו אופטימיזציה וערכו במעבדה של ארנסט HK Stelzer העסיקה דרך מיוחדת המדגם גובר מאופיין גדל השורש על פני השטח של ג'ל 17. במחקרים אלה, מיקרוסקופ מחוייט שמש, שבו הצמח מוחזק מלמטה. לעומת זאת, הרוב המכריע של מיקרוסקופי אור גיליון רחב זמינים להחזיק מדגם מלמעלה. לפיכך, שיטת הכנה המסוימת הזה לא ניתן ליישם בקלות. השיטה המוצגת כאן מספקת פרוטוקול לשיטת ההרכבה והמבוססת על-פני שטח הרלוונטי עבור OpenSPIM 23, פלטפורמת גישה פתוחה על מנת ליישם השיפור מיקרוסקופי תאורת מטוס סלקטיבי (SPIM).
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לאפשר הדמיה לטווח הארוך של שורשי ארבידופסיס במיקרוסקופ OpenSPIM אור הגיליון. המטרה זו מושגת על ידי גידול צמחים זקוף על היםurface של ג'ל עם השורשים בתוך נוזל ואילו העלים להישאר באוויר. על מנת להבטיח פעילות הפוטוסינתזה של הצמח, מערכת תאורה מחוייט מאירה את העלים אבל לא את השורשים (איור 1).
Protocol
1. Culturing ארבידופסיס לפני הדמיה
- הכן בינוני MS ½ (חצי כוח Murashige ו Skoog בינוני) על ידי הוספת סוכרוז 2.15 גרם MS-בינוני, 10 גרם, 0.97 MES g (2- (-morpholino N) חומצה ethanesulfonic) ו -1 L DDH 2 O (מים מזוקקים פעמיים ) לתוך בקבוק L 1. התאם את ה- pH ל -5.8 באמצעות KOH.
- הוסף 15 גר '/ ל gellan מסטיק עד בינוני ½ MS ו חיטוי אותו במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
- יוצקים 30 מ"ל של מדיום חם לתוך צלחות פטרי רבועים (245 x 245 x 25 מ"מ) כדי ליצור שכבה של ג'ל עם עובי של כ -2 מ"מ. תנו מנות להתקרר לטמפרטורת החדר כדי לאפשר את המדיום כדי לחזק.
- שים זרעים ארבידופסיס מעוקרים לתוך צינור 1.5 תגובה מ"ל המכילה 1 מ"ל סטרילי H 2 O. תרימי את הזרעים באמצעות pipet זכוכית או טיפ 1,000 μL pipet ולזרוע אותם על פני השטח של ג'ל. מניחים את הזרעים בנפרד כ -10 מ"מ זה מזה. חותם את הצלחת עם קלטת.
- דגירה את הצלחת למשך 24 שעות ב 4מעלות צלזיוס (ריבוד).
- טפחו את הצלחת חממה לצמיחה, למשל ב 22 ° C במחזור 16/8 שעות יום / לילה עם 120-140 μmol / m² / s כמות האור במשך 6 ימים. עד 10 ימים צמחים ישנים יכולים לשמש.
2. לדוגמא צמח הכנה שיטה
הערה: בעל המדגם ניתן להדפיס או 3D או בעבודת יד בבית מלאכת מכונית באמצעות הממדים מתוארים באיור 2C. קובץ מודל 3D מסופק ההשלמות (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). ראה את הקישור להזמנה את אותיות 3D ברשימת החומר.
- הוסף 5 גרם נמוכה להמיס agarose לתוך בקבוק 50 מ"ל המכיל 50 מ"ל בינוני ½ MS ו החיטוי אותו במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
- Aliquot הפתרון agarose 1% נמוך להמיס צינורות 1.5 תגובה מ"ל. חנות ב 4 ° C (ניתן להשתמש במשך חודשיים לפחות).
- ממיסים aliquot של 1 %% agarose נמוכה להמיס ב 80 ° C ולתת לו להתקרר עד33 ° C.
- נקה את בעל המדגם ביחידת אולטרסאונד. לעקר בעל המדגם עם 70% אתנול ולשטוף עם מים סטריליים.
- חותכים את ג'ל סביב הצמח באמצעות אזמל.
- הרם את הבלוק עם מרית שטוחה וחלק אותו בזהירות על בעל המדגם בעזרת מרית שנייה.
- מדביקים את הג'ל על בעל מדגם עם 1% agarose (ב 33 ° C) בעזרת פיפטה 100 μL.
- מדביקים את הצמח על הג'ל עם agarose 1% בעזרת פיפטה 10 μL. שימוש במיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא כי העלים אינם מכוסים עם ג'ל. אין להציב את הג'ל ישירות על האזור של עניין.
- כדי למנוע את המפעל מהתייבשות, לעבוד באין מפריע. הכנס את בעל מדגם לתוך טיפ 1,000 μL pipet בכל הזדמנות אפשרית. השתמש טיפ pipet כמו כובע והחלק אותו בזהירות מעל קצה אחד של בעל מדגם שבו ממוקם המפעל.
- מכניסים את בעל מדגם בקופסה קצה פיפטה ולהכין צמחים יותר במידת הצורך. צמחים יכולים להיות directly צלם או להחזיר בחממת הצמיחה.
3. הגדרת מיקרוסקופ
הערה: מערכת התאורה LED היא מנורה שהותקנה. הפרטים הטכניים הנדרשים כדי לבנות את טבעת LED ניתן למצוא באיור 3 ורשימת החומר. ראה את קובץ ההשלמות (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) ה- board design.
- בורג או דבק (סרט דו צדדי למשל) טבעת LED בצד התחתון של הזרוע OpenSPIM x / y / z / θ שלבית.
- חברו את טבעת LED עם ספק כוח מתכוונן (0-30 V, מקסימום 2 א).
- התאם את המתח לעוצמת האור הרצוי (עבור ארבידופסיס, 120-140 μmol / m 2 / s, איור 3D).
- לעקר את התא המדגם עם 70% אתנול ולשטוף עם מים סטריליים.
- נקה את העדשה האובייקטיבית עם רקמת ניקוי בנזין עדשה. לעקר את העדשה האובייקטיבית עם 70% אתנול.
- חבר את perfusiעל צינורות לתא המדגם בהסדר חד סטרי. שים בקבוק 1 ליטר המכיל בינוני טרי ½ MS ועוד בקבוק ריק ליד משאבת זלוף peristaltic. חבר את הבקבוק עם מדיום כשהמפרצון התחתון של תא המדגם באמצעות צינור זלוף אחד. חבר היציאה העליונה של החדר המדגם עם הבקבוק הריק לאשפת המדיום בשימוש באמצעות צינור אחר זלוף.
- קבע את המהירות של זרימת 1 מ"ל / דקה.
הערה: כדי לא להישפך קאמרי המדגם, חשוב שיהיה יצוא גבוה יותר היבוא. כך או להגביר את קצב השאיבה או להשתמש בצינור בקוטר פנימי גדול עבור היצוא. - חותכי ניילון נצמד שחורה לריבועים קטנים 3 מ"מ, לשטוף עם אתנול 70% ולתת להם להתייבש לפני הצבת בתא מדגם על פני המים.
- הסר את קצה pipet מבעל המדגם וכנס בעל המדגם בתא המדגם. אם בעל מדגם מיוצרים החדש לא נכנס זרוע הבמה, להשתמש חול דקנייר כדי לעשות את זה מדלל או להשתמש O-Ring (∅ 6 מ"מ) במקרה זה הוא רזה מדי.
- כדי ליצור את המכסים, לחתוך את נייר האלומיניום השחור לשתי 50 x 25 חתיכות מ"מ. כן 5 מ"מ לחתוך באמצע צד אחד של כל חתיכה. מקפלים ליצור הזחה משולש (איור 1D). סגור את התא המדגם עם שני המכסים על ידי לשים את המכסים על גבי התא המדגם עם החריצים המשולשים מול בעל המדגם. ודא כי עלי הצמח הם לא בצל של העפעפיים ולקבל אור ממערכת התאורה.
- מצא את האזור של עניין באמצעות x / y / z וסיבוב הבמה למקם שורש לרוחב המתעוררים שדה הראייה.
- לפני ההקלטה, לאפשר למערכת לאזן במשך לפחות 15 דקות.
- התקנת רכישת התמונה.
- גדר ערימה של 217 תמונות עם 3 מיקרומטר z-מרווח (650 מיקרומטר) ולהגדיר את הזמן לשגות עם מרווח הדמיה 15 דקות לתקופה כוללת של 17 שעות.
הערה: תיעוד מפורט עלכיצד להפעיל את תוכנת OpenSPIM ניתן למצוא באתר (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack).
- גדר ערימה של 217 תמונות עם 3 מיקרומטר z-מרווח (650 מיקרומטר) ולהגדיר את הזמן לשגות עם מרווח הדמיה 15 דקות לתקופה כוללת של 17 שעות.
- התחלת ההקלטה.
Representative Results
שיטת הכנת מדגם זה מאפשרת טיפוח של הצמח בתוך החדר מדגם מיקרוסקופ תוך שמירה על מערכת שורשים עם מיקרוסקופ אור גיליון (איור 1). הצמח גדל על פני השטח של שכבת ג'ל (½ בינוני MS המכיל 1.5% gellan מסטיק) רכוב על בעל מדגם אישית מעוצבת (איור 2). בעל המדגם הוא 3D מודפס באמצעות שרף שקוף כחומר. גרסת יוצר המדגישה את הממדים מתוארות באיור 2C. שורשי שקועים בנוזל (½ בינוני MS), אשר מתרענן ללא הרף על ידי מערכת טפטוף. העלים נשארים באוויר מואר ברציפות עם עוצמת אור של 130 μmol / m² / שעות המגיע נוריות כחולות ואדומות כי מסודרות טבעת מעל הצמח (איור 1 א ', ב' ו איור 3A-C). טבעת LED מיוצרת בסדנה המכונית שלנואנו מספקים פרטים טכניים על איך לבנות את טבעת LED של האיור 3 ורשימת החומר. עוצמת האור יכול להיות מותאם באופן רציף החל 30-250 μmol / m 2 / s (איור 3D). מערכת השורש מוצללת על ידי יריעות קטנות של ניילון נצמד שחור המכסה את פני מים (איור 1). כל אור התועה מן ההארה כי נאסף על ידי עדשת זיהוי מסונן לפי מסנן GFP (האיור 3E).
עם ההגדרה הזאת, לשגות זמן של שורש ארבידופסיס לרוחב גובר נרשם במשך 17 שעות באמצעות עדשת 20X / 0.5 (איור 4). השורש לרוחב מקורו שכבת תאי pericycle, הנמצא עמוק בתוך השורש העיקרי. כדי להדגים את יכולות ההדמיה אפילו עמוקות בתוך רקמה לפרקי זמן ממושך, בהגדלה גבוהה (40X / 0.75) שמשה כדי ללכוד את ההיווצרות של ro לרוחבot מן primordium השלב הראשון עד הופעתה מתוך השורש העיקרי בתוך פרק זמן של 38 שעות (איור 5). פרוסת 2D למופת של ערכת הנתונים מוצגת באיור. 5B. הקלטה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר הדינמיקה של היווצרות שורש לרוחב ב -3 D (איור 5 א) עם רזולוציה הסלולר.
איור 1: גידול התנאים בתוך תא מדגם OpenSPIM. א) סקיצה של חדר ההדמיה. הצמח גדל זקוף על פני השטח של ג'ל, רכוב על בעל מדגם שהותקן (ראה גם איור 2). השורשים גדלים בתוך נוזל, אשר החליף באופן רציף על ידי מערכת טפטוף. המפעל משאיר לגדול אוויר מואר על ידי נוריות אדומות וכחולות (ראה גם איור 3). מערכת שורש מוצללת שנינות גיליונות h קטנים של ניילון נצמד שחור המכסים את פני מים. מכסה עשוי שני חלקים של רדיד אלומיניום שחור מקטין עוד יותר את כמות האור מתחת לפני המים ושומר לחות בתא המדגם. הפאנל מוגדל מימין מדגיש את היבול על פני השטח של גוש ג'ל שקוע במדיום נוזלי. ירידה של agarose עולה על השורש על הג'ל. התיבה המקווקות מציינת את האזור של העניין נצפה על ידי מיקרוסקופ. צילום B) של חדר הדמיה (ללא מכסה). מספרים (1) - (10) ב A ו- B מייצגים: (1): x / y / z / θ שלבית עם טבעת LED, (2): בעל המדגם, (3): מכסה, (4): thaliana ארבידופסיס , (5): גיליונות של ניילון נצמד שחור, (6): מערכת זלוף, (7): עדשה אובייקטיבית זיהוי, (8): במדיום נוזלי, (9): תא מדגם, (10): עדשה אובייקטיבית תאורה. ג) המכסה עשוי שני חלקים של רדיד אלומיניום שחור. Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: בעל המדגם. א) מודל 3D. קובץ מודל 3D מסופק ההשלמות. צילום B) של הדפסים 3D באמצעות חומרים שונים (1) - (3): פלסטיק אקרילי שקוף, (4) ו- (5): שרף, (6): שרף שקוף. ג) ציור טכני של בעל המדגם, המספרים מייצגים מילימטר. תצלום D) של בעל מדגם מיוצר עם מפעל רכוב. האזור המקווקו יכול להיות שנצפה על ידי מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
להעלות / 55,044 / 55044fig3.jpg "/>
איור 3: הגדרת תאורת צמח. א) דיאגרמת מעגל סכמטי של המנורה. זוגות של נוריות ניתן להפעיל / כיבוי באופן פרטני עבור ברק כיוונית. LED: דיודה פולטת אור, R: התנגדות, T: טרנזיסטור, JP: ראש סיכה. B) את העיצוב הסופי של מנורת התאורה צויר באמצעות-תוכנת PCB (מעגלים מודפסים: מעגלים מודפסים). אנו מספקים את קובץ עיצוב לוח ההשלמות. הלוח יוצר אז התאסף בחנות מכונת MIBA של המכון שלנו. צילום C) של טבעת LED מופעל. ארבעה זוגות של אדום LED כחול מסודרים בטבעת. ד) מגוון של מתח יכול להיות מותאם בין 3.5 V ו -14.0 עמידויות V. שימשו בכדי להגיע לסכום של אור החל 30-250 μmol / m 2 / s (R1-8: 220 אוהם, R9-12: 1,220 אוהם ). ה) ספקטרום הפליטה של המנורה, GFP ו YFP. tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: הקלטה של מעבר זמן של ארבידופסיס thaliana שורש לרוחב. שתיל בן 5 ימים מבטא סמן קרום (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) וכתב גרעיני (pGATA23 :: NLS-גאס-GFP) במיוחד לציון pericycle התאים המתמיינים שורש לרוחב. ערימה של 217 תמונות (3 מיקרומטר z-ריווח) נכבשה כל 15 דקות במשך 17 הקלטה h באמצעות עדשה 20X / 0.5. א) ארבע נקודות פסק זמן של 69 מוצגים השלכה בעוצמה מקסימלית. B) שישה מתוך 217 פרוסות יחידות של Z- מחסנית של נקודת זמן אחת מוצגות. ברי סולם ב A ו- B מייצגים 100 מיקרומטר.עומס / 55,044 / 55044fig4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: הקלטה של מעבר זמן של ארבידופסיס thaliana שורש לרוחב. שתיל בן 6 ימים מבטא סמן קרום (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) וכתב גרעיני (pGATA23 :: NLS-גאס-GFP) במיוחד לציון pericycle התאים המתמיינים שורש לרוחב. ערימה של 200 תמונות (1.5 מיקרומטר z-ריווח) נכבשה כל 15 דקות במשך 38 הקלטה h באמצעות עדשה 40X / 0.75. א) טיוח 3D של ארבע נקודות זמן, המספרים ברשת מייצגי מיקרומטר, B) פרוסה אחת דרך המישור המרכזי של השורש הראשי. סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. קובץ מודל 3D מסופק. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
קובץ משלימה LED טבעת Board.brd. קובץ עיצוב הלוח מסופק. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Discussion
יש גיליון אור פלואורסצנטי מיקרוסקופיה היתרון הגדול לשלב phototoxicity נמוך ומהירות רכישה מהירה, אשר ניתן להשתמש בם כדי ללכוד כמויות גדולות עם רזולוציה במרחב ובזמן גבוהה תוך שמירה על המדגם במצב פיסיולוגי. הרזולוציה של מיקרוסקופ אור גיליון ניתן להשוות לזה של מיקרוסקופ confocal 9. עם זאת, פיזור אור וקליטה מתרחשים לאורך שביל העירור ופליטה בנפרד ואת איכות התמונה הכוללת יכולה להיות נמוכה משמעותי בתוך רקמות אטומות לעומת פני השטח. כדי לעקוף סיבוך זה ניתן להשתמש את האפשרות לסובב את המדגם לאורך הציר האנכי ולבחון את הנפח זהה מכיוונים שונים. אבל זה לא תמיד יתרון, שורשים לרוחב למשל לצאת בצד אחד של השורש וההדמיה מאחור תוצאות איכות תמונה נמוכה מבלי להשיג מידע נוסף. עם זאת, הסיבוב יכול לשמש בעיקר כדי למקם את sample על הצד הטוב. ההסדר האופקי הקלסי של העדשות האובייקטיביות מאפשר דרכים חדשות של הרכבה מדגמת. צמחים ליהנות במצב אנכי. מוצג כאן, "על פני השטח של הג'ל" שיטת הרכבה יש מספר יתרונות בהשוואה לשיטות הרכבה אחרות כגון הטבעת השורש הפנימית של ג'ל 24,25. 1) מערכת השורש נמצאת בקשר ישיר עם במדיום הנוזלי. תא המדגם מחובר למערכת זלוף אשר מספקת מדיום חדש ברציפות. זה יכול לשמש גם כדי להחליף את כל הנפח במהירות של החדר מדגם ליישם מדיה או תרופות שונות. 2) לפני לטעום צמחים כנים לגדול כפי שהם משמשים לגידול במעבדות. צמחים יכולים לבחור תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ורק הצמחים הרצויים צריכים להיות מוכנים. 3) המפעל מועבר מצלחת פטרי לבעל המדגם בלי שנוגעים בו. ובכך הצמח יכול לפתח עוד יותר על ג'ל אותו הוא הלך וגדל על ב incubato הצמיחהr לחץ מכאני מצטמצמים למינימום. 4) ההשקפה על הדגימה אינה חסומה ו סטיות אופטיות הן מזעריות כי החלל בין המדגם לבין מטרת זיהוי מלא אך ורק עם מדיום ולא חומרים אחרים עם מדדי שבירה שונים.
על מנת לבצע הדמיה לטווח ארוך, מערכת תאורה צמח יש צורך להבטיח פעילות הפוטוסינתזה של הצמח. ברוב המעבדות הצמחים גדלים על ג'ל שקוף, כלומר השורשים נחשפים לאור. דבר זה עלול לגרום לתגובות שונות לסביבת העבודה גורם לשינויים ביוכימיה והתפתחותם 26,27. על מנת להקטין את כמות האור על מערכת השורשים, רדיד פלסטיק שחור שימש לכיסוי פני המים כמו גם מכסה מנייר אלומיניום שחור כיסה את תא המדגם. אור יכול להגיע עלי הצמח דרך החור המרכזי במכסה. במצב זה, אין עלייה קלה ברקע נצפתה, רומזתg כי כמות האור התועה מן הנוריות האדומות וכחולות הופחתה באופן משמעותי על ידי מסנן GFP וגישות ההצללה. זה אפשר לשמור את האור דולק במהלך רכישת תמונה מבלי להגדיל את רעשי רקע מצלמה.
בעל המדגם נועד להדפסת 3D. עם זאת, הבחירה של חומר חיונית כמו כמה פלסטיק שנבדקו היה לא 100% יציבים, וכתוצאה מכך סחיפה של המדגם. לכן, מומלץ להשתמש שרפים במקום או לבנות בעל מדגם ידי כרסום מוט פוליאתילן (PEP). בעת שימוש התקנת מיקרוסקופ גיליון אור עם מערכת תאורה דו צדדית בעל המדגם עלול להפריע אחד מדפי האור בהתאם לזווית הסיבוב. כדי להפחית את הלחץ המכני במהלך גורף את הצמח מהצלחת, להשתמש זווית שטוחה של מרית. הצמח יכול במהירות להתייבש וזרימת אוויר ניסיון בפעם הראשונה. נסה להימנע מכל טיוטת אוויר (תנועות מהירות, זרימת אוויר-תנאים), ווRK באין מפריע וחלק בעל מדגם לתוך טיפ 1,000 μL pipet בכל הזדמנות אפשרית. בתוך מיקרוסקופ, חשוב לא לטבול את הצמח כולו בנוזל ולשמור על עלים יבשים.
הטכניקה היא אידיאלית עבור הדמיה בשלבים מוקדמים של היווצרות שורש לרוחב. בעת ביצוע הדמיה לטווח ארוך של טיפים שורש בוגר אחד חייב לזכור כי השורשים ארבידופסיס לגדול עם 100-300 מיקרומטר / h במהירות מחוץ לשדה הראייה. יישום עתידי מאוד שימושי יכול להיות אלגוריתם מעקב אוטומטי, אשר יאפשר צמיחת קצה השורש הבא על פני פרק הזמן ממושך. היכולת לשלוט בתנאים סביבתיים כגון אור והרכב תזונתי של המדיום במהלך תהליך הרכישה מאפשרת חוקרת כיצד צמחים להסתגל לשינויים. שורש נמצא בקשר ישיר עם במדיום נוזלי, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ליישם תרופות להפעיל ביטוי גנים כימית, למשל באמצעות dexamethasone מושרה 28 או β-ESTRadiol מערכת מושרה 29. עם זאת, זה לוקח זמן להחליף את כל נפח תא המדגם לשטוף את תרופה. ההתקנה עשויה להשתפר באמצעות מזעור ההיקף הקאמרי מדגם להאיץ חילופי בינוני. עם זאת, טכניקה זו יש פוטנציאל גדול. השילוב של הליך הרכבה, תנאי גידול סטנדרטיים רכישת התמונה העדינה באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון מאפשר מחקרים ארוך טווח של התפתחות צמח עם רזולוציה גבוהה ברמה פיזיולוגית. זה יעזור לחוקרים לחקור מנגנונים בסיסיים של התפתחות צמח.
Acknowledgments
אנו מודים מתייאשים Fendrych לקריאה / צפייה ביקורתית סטפן Stadlbauer עבור ציוד אודיו. הודות חנות Miba המכונית ב IST אוסטריה עבור תרומתם OpenSPIM. המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מתוכנית אנשים (Actions מארי קירי) של תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7 / 2007-2013) תחת הסכם מענק REA n ° [291,734] מועצת המחקר האירופית (ERC פרויקט-2011 -StG-20101109-PSDP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
| Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
| Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
| LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
| LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
| LED board - PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
| Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
| Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm) | VWR | 734-2179 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |
References
- Grossmann, G., Guo, W. -J., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Busch, W., Moore, B. T., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Methods. 11 (1), 22 (2015).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. Plant J. 36 (2), 280-290 (2003).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Höckendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative Analysis of Embryogenesis: A Perspective for Light Sheet Microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Methods. 12 (1), 23-26 (2015).
- Maizel, A., Von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. PLoS ONE. 6 (6), e21303 (2011).
- Costa, A., Candeo, A., Fieramonti, L., Valentini, G., Bassi, A. Calcium Dynamics in Root Cells of Arabidopsis thaliana Visualized with Selective Plane Illumination Microscopy. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Šamajová, O., Takáč, T., von Wangenheim, D., Stelzer, E. H. K. Update on methods and techniques to study endocytosis in plants. Endocytosis in Plants. , 1-36 (2012).
- Rosquete, M. R., Von Wangenheim, D., et al. An auxin transport mechanism restricts positive orthogravitropism in lateral roots. Curr Biol. 23 (9), 817-822 (2013).
- Lucas, M., Kenobi, K., et al. Lateral root morphogenesis is dependent on the mechanical properties of the overlaying tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (13), 5229-5234 (2013).
- Vermeer, J., von Wangenheim, D., et al. A Spatial Accommodation by Neighboring Cells Is Required for Organ Initiation in Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
- Von Wangenheim, D., Daum, G., Lohmann, J. U., Stelzer, E. H. K., Maizel, A. Live Imaging of Arabidopsis Development. Arabidopsis Protocols. 1062, 539-550 (2014).
- Berson, T., von Wangenheim, D., et al. Trans-Golgi network localized small GTPase RabA1d is involved in cell plate formation and oscillatory root hair growth. BMC Plant Biol. 14 (1), 252 (2014).
- Langhans, M., Meckel, T. Single-molecule detection and tracking in plants. Protoplasma. 251 (2), 277-291 (2014).
- Novak, D., Kucharova, A., Ovecka, M., Komis, G., Samaj, J. Developmental nuclear localization and quantification of GFP-tagged EB1c in Arabidopsis root using light-sheet microscopy. Front Plant Sci. 6, (2015).
- Von Wangenheim, D., Fangerau, J., et al. Rules and Self-Organizing Properties of Post-embryonic Plant Organ Cell Division Patterns. Curr Biol. 26 (4), 439-449 (2016).
- Berthet, B., Maizel, A. Light sheet microscopy and live imaging of plants. J Microsc. , (2016).
- Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
- de Luis Balaguer, M. A., et al. Multi-sample Arabidopsis Growth and Imaging Chamber (MAGIC) for long term imaging in the ZEISS Lightsheet Z.1. Dev Biol. 419 (1), (2016).
- Ovečka, M., Vaškebová, L., Komis, G., Luptovčiak, I., Smertenko, A., Šamaj, J. Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy. Nat Protoc. 10 (8), 1234-1247 (2015).
- Yokawa, K., Kagenishi, T., Kawano, T., Mancuso, S., Baluška, F. Illumination of Arabidopsis roots induces immediate burst of ROS production. Plant Signal Behav. 6 (10), 1460-1464 (2011).
- Silva-Navas, J., et al. D-Root: a system for cultivating plants with the roots in darkness or under different light conditions. Plant J. 84 (1), 244-255 (2015).
- Aoyama, T., Chua, N. -H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. Plant J. 11 (3), 605-612 (1997).
- Brand, L., et al. A versatile and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis. Plant Physiol. 141 (4), 1194-1204 (2006).
