Summary
De leptomeningen explantaatkweek protocol uit menselijke postmortem hersenen is een technisch robuust en eenvoudige manier om fibronectine-positieve meningeale fibroblasten ontlenen binnen 6-8 weken en cryopreserve, circa 20-30 miljoen cellen.
Abstract
Hoewel grote vooruitgang is gemaakt in de klinische karakterisering van de ziekte van Parkinson, een aantal studies rapporteren dat de diagnose van de ziekte van Parkinson niet pathologisch bevestigd tot 25% van de ziekte klinisch gediagnosticeerde Parkinson. Daarom weefsel vanuit klinisch gediagnosticeerde patiënten met de ziekte van Parkinson kunnen een hoog percentage verkeerde diagnose hebben; vandaar in vitro studies uit dergelijke weefsels parkinsondementie onderzoeken als preklinisch model nutteloos kan worden.
Door het verzamelen postmortem menselijk leptomeningen met een bevestigde neuropathologische diagnose van de ziekte van Parkinson en gekenmerkt door nigrostriatale celverlies en intracellulaire eiwit inclusies Lewy lichaampjes, kan men er zeker van zijn dat klinisch waargenomen parkinsonisme niet wordt veroorzaakt door een onderliggende ziekteproces (bijvoorbeeld tumoren, arteriosclerose).
Dit protocol presents de dissectie en de voorbereiding van postmortale menselijke leptomeningen voor het afleiden van een meningeale fibroblast cultuur. Deze procedure is robuust en heeft een hoog slagingspercentage. De uitdaging van de kweek steriliteit als het brein opdrachten algemeen niet onder steriele omstandigheden wordt uitgevoerd. Daarom is het belangrijk om de kweekmedia aangevuld met een cocktail van penicilline, streptomycine en amfotericine B.
De afleiding van meningeale fibroblasten autopsie bevestigde gevallen van de ziekte van Parkinson als basis voor een in vitro model van de ziekte van Parkinson. Meningeale fibroblasten verschijnen 3-9 dagen na de bereiding van de monsters en ongeveer 20-30 miljoen cellen kunnen worden gecryopreserveerd in 6-8 weken. De hersenvlies fibroblast cultuur is homogeen en de cellen brengen fibronectine, een veel gebruikte marker om hersenvliezen te identificeren.
Introduction
Meninges bestaan uit drie vliezen die de hersenen te beschermen: dura mater, arachnoid en pia mater. Meer recent is erkend dat hersenvliezen ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van de hersenen en de hersenen homeostase 1 spelen. Hersenvliezen afstammend van mesenchymale en neurale kam afgeleide cellen en interessant, is aangetoond dat stamcellen die in meninges kan leiden tot neuronen in vitro en in vivo na transplantatie 2, 3, 4 geven. Meninges culturen zijn ook met succes gebruikt als voedsterlagen mocht bezitten stromale cellen afgeleide inducerende activiteit differentiatie van embryonale stamcellen tot dopaminerge neuronen 5. Bovendien leptomeningen hebben het potentieel om direct differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten onder ischemische condities 6.
Voor dit protocol worden menselijke postmortem hersenvliezen monsters van de arachnoid en pia mater, collectief genaamd de leptomeningen, en worden ingekocht als onderdeel van een menselijk brein donatie voor onderzoeksdoeleinden. Dissectie van de hersenen wordt uitgevoerd binnen 24 uur dood en de leptomeningen monster wordt in koud kweekmedium voor verdere verwerking in de volgende 6-8 uur zoals hier is weergegeven in dit protocol.
Dit protocol beschrijft de ontleding en de bereiding van humane hersenvliezen monsters voor de ontwikkeling van patiënt leptomeningen primaire celkweek. Het weefsel wordt gesneden in 25-30 stukjes van ongeveer 3 mm x 3 mm vierkant. Drie stukken zijn geplaatst in elk 6-well-gelatine gecoate goed en hield neer met ronde glazen dekglaasjes. De hersenvliezen dissectie duurt ongeveer 25-35 minuten. De uitdaging met deze cultuur steriliteit als de aanschaf hersenen, transport en dissectie algemeen niet onder steriele omstandigheden uitgevoerd. Therefore, is het belangrijk om de kweekmedia aangevuld met een cocktail van penicilline, streptomycine en amfotericine B meerdelige putjes afzonderlijk cultuur weefselstukken.
Uitvloeisel van meningeale fibroblasten gebeurt meestal binnen de eerste week. Medium wordt elke twee tot drie dagen vervangen totdat de cellen confluent en de cellen enzymatisch gepasseerd. De meningeale fibroblasten gecryopreserveerd 1 miljoen cellen per ml / injectieflacon cryopreservatie media. Met dit protocol, kan 20-30000000 meningeale fibroblasten afgeleid worden in 6-8 weken voor cryopreservatie. Downstream-toepassingen van deze meningeale fibroblasten zijn primaire kweken voor de ziekte van onderzoek, direct neuronale differentiatie of afleiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen van de leptomeningen voor het begrip van de mechanismen en vaatziekten en voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De registratie hersenen donatie bevat documentatie door de registrant van hun intentie om te doneren. De autopsie toestemming voor tissue ophalen wordt geleverd door de nabestaanden als wettelijk is toegestaan. Onderzoeken met behulp van verzamelde autopsie exemplaren worden beoordeeld door de Institutional Review Board (IRB) om de naleving van Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) regelgeving.
OPMERKING: leptomeningen monsters worden verzameld door de hersenen dissector of neuropathologist tijdens hersenen dissectie en opgeslagen in 50 ml conische buisjes met 25-30 ml meninges groeimedia. Het monster wordt bewaard bij 4 ° C totdat monstervoorbereiding. De verwerking moet zo snel worden uitgevoerd mogelijk als de levensvatbaarheid van de cellen neemt af met de tijd post mortem.
1. Set-up voor het starten van de leptomeningen Dissection
OPMERKING: Stappen 1,1-1,3 moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast.
- Bereid meninges groeimedia combineert 375 ml Dulbecco's Modified Eagle Media, 100 ml foetaal runderserum, 5 ml 10 mM niet-essentiële aminozuren, 5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamine, 5 ml 100 mM natriumpyruvaat, 5 mL 10.000 U / ml penicilline / streptomycine en 5 ml 250 ug / ml amfotericine B in 500 ml filtereenheid. Filter en meng. Gebruik media tot vier weken.
- Plaats alle materialen in de bioveiligheid kast voordat de dissectie: 4x petrischaaltjes, 2x 6-well platen, 2x scalpels, 15-20 gesteriliseerde 15-mm dekglaasjes, fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS), serologische pipetten, opzuigen pipetten.
- Voeg 1 ml steriel 0,1% geautoclaveerde gelatine-oplossing in elk putje van een 6-wells plaat. Zet de plaat opzij voor 30-60 min. Bereid 2x 6-well platen.
2. Voorbereiding van de leptomeningen Sample
OPMERKING: Stappen 2,1-2,3 moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast.
- Voeg ongeveer 10 ml PBS omeen steriele 10-cm weefselkweek schaal en leg de hersenvliezen monster in de schaal. Met behulp van een tang, voorzichtig te wassen leptomeningen met PBS om bloed te verwijderen.
- Breng de hersenvliezen in een nieuwe 10-cm weefselkweekplaat met 10 ml vers PBS en verder wassen. Indien nodig herhalen zoveel bloed te verwijderen mogelijk.
- Met behulp van twee scalpels, leptomeningen weefsel gesneden in een ongeveer 6 cm x 6 cm groot stuk.
- Plaats het deksel op een cultuur schotel en transfer naar een dissectie microscoop in een horizontale laminaire stroming kap.
3. Dissectie van leptomeningen Tissue
OPMERKING: Stappen 3,1-3,3 worden uitgevoerd in een horizontale laminaire stroming kap met behulp van een stereomicroscoop.
- Verwijder de bloedvaten uit een gebied op de leptomeningen stuk (stap 2.3) groot genoeg is om ten minste maart 20-25 mm x 3 mm stukken te creëren. Houd de leptomeningen op zijn plaats met een scalpel en met de andere, gebruik dan een zachte en ondiepe schrapen motie om de schepen te scheiden.
- Knip kleine vierkantjes van weefsel uit de voorbereide regio. Snij in een stapsgewijs proces door eerst het maken van grotere stukken en dan snijden die in kleinere secties.
- Gebruik een scalpel om het weefsel op zijn plaats en een andere scalpel houden om het weefsel te snijden met een schommelende beweging. Door de consistentie van het weefsel, is het moeilijk om de scalpels tegen elkaar schuiven. Dit zal alleen het weefsel scheuren en resulteert in een rafelige randen.
- Ga door het snijden van de stukken in de helft tot er ongeveer 20-25 3 mm x 3 mm stuks.
4. Overdracht van ontleed Meninges Pieces op Tissue Culture Plates
OPMERKING: Stap 4 moet worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast.
- Aspireren gelatine van 6-well plaat (uit stap 1.3). Voeg 1 ml meninges kweekmedium aan elke well. Met behulp van een steriel pincet, plaatst 3-4 biopsie stukken in elk putje.
5. Plaatsing van Cover bevestiging over Meninges Pieces
OPMERKING: Stappen 5,1-5,2 worden uitgevoerd in een horizontale laminaire stroming kap met behulp van een stereomicroscoop.
- Bedek de stukken met 1-2 steriele 15-mm ronde dekglaasjes per putje.
- Druk stevig met een tang te zorgen voor de stukken zijn de bodem van het schaaltje raken. Dit maakt bevestiging van weefsel stukjes naar de bodem van de put.
- Plaats de 6-well plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
6. Cell Culture Onderhoud
OPMERKING: Stappen 6,1-6,3 moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast. Behandel cultuur gerechten met zorg als dekglaasjes niet mag bewegen en verjagen de hersenvliezen stukken.
- Na 2 dagen in kweek, voeg nog eens 1 ml vers meninges groeimedium aan elk putje.
- Op dag 7, voorzichtig zuigen de media en voeg 2 ml vers medium aan elk putje.
- Na Dag 9, blijven groeimedia elke wijzigingde andere dag tot cultuur wordt confluent.
7. Passage
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast. Zodra meningeale fibroblasten uit de meningeale weefselstukken gemigreerd en beginnen te groeien naar de randen van het kweekvat Vouw meningeale fibroblasten in grotere kweekschaal.
- Voordat u begint met de passage, de vacht van de cultuur schotel met 1% gelatine gedurende 15-30 min.
- Aspireren media van 6-well gerecht en was cellen met 2 ml PBS.
- Voeg 1 ml trypsine / EDTA aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten. Het is niet nodig de dekglaasjes of meningeale weefsel voor deze stap verwijderd.
- Wanneer de cellen zijn afgerond en beginnen te los te maken, voeg 2 ml van de cultuur media.
- Pipet cellen omhoog en omlaag om volledig te verstoren alle klonten en breng de cel oplossing voor grotere cultuur schotel.
- Met een verhouding van 1: 3 tot 1: 4 cellen combineren van drie 6 putjes inéén T75 cultuur schotel.
- Zodra meningeale fibroblasten cellen confluent in T75 cultuur kolven, trypsinize de cellen en cryopreserve in cryopreservatie media op 1x10 6 cellen / ml per flacon. Een T75 kolf met samenvloeiing meningeale fibroblasten bevat ongeveer 5-7 miljoen cellen.
8. Analyse van de Meningeale fibroblasten door Immunokleuring
LET OP: Voor het starten van de procedure, de voorbereiding van 4% paraformaldehyde-oplossing, 5% normaal geit serum in PBS (blokkerende buffer), 0,3% Triton X-100 in PBS (permeabilisatie buffer), primaire en secundaire antilichaam-oplossingen, en 1 ug / ml Hoechst 33.342 verdund in PBS van 10 mg / ml voorraad.
- Seed 15.000 tot 30.000 meningeale fibroblasten in 8-well kamer dia bekleed met 0,1% gelatine.
- Na 24 uur bij de cellen gevoegd, vast cellen in 100 pi 4% paraformaldehyde per putje gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de putjes 3 keer met 1x PBS.
- Permeabilize de cellen met 150 pl 0,3% Triton X-100 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de putjes 3 keer met 1x PBS.
- Voeg 200 pl blokkeeroplossing (PBS + 5% normaal geit serum) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Zuig de blokkerende oplossing en voeg 150 ul van gewenste primaire antilichamen verdund in blokkeeroplossing. Voor double-kleuring, voor te bereiden werken verdunningen van primaire antilichamen in afzonderlijke centrifugebuizen op ijs als volgt:
- Bereid 1: 300 verdunning van anti-fibronectine + 1: 200 verdunning van anti-nestine in blokkeeroplossing. Bereid 1: 250 verdunning van anti-SERPINH1 + 1: 1000 verdunning van anti-TUJ1 in blokkeeroplossing. Bereid 1: 250 verdunning van anti-SERPINH1 + 1: 100 verdunning van anti-SOX2 in blokkeeroplossing
- Incubeer bij 4 ° C overnacht.
- Was de putjes 3 keer met 1x PBS.
- Bereid een werkende 1: 400 verdunning van fluorescent gelabelde secundaire antilichamen geit anti-konijn (groen; Ex / Em 2 2 590/617 nm) in blokkeeroplossing en voeg 100 ul aan elk putje. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur. Was daarna wells eenmaal met 1x PBS.
- Voeg 100 ul van 1 ug / ml Hoechst 33342 (blauw; Ex / Em 2 358/461 nm) oplossing aan elk putje en incubeer in het donker gedurende 3 min. Was de putjes 3 keer met 1x PBS, waardoor in de finale 1x PBS wassen in de put, en hebben betrekking op de dia met aluminiumfolie.
- Analyseer cellen onder fluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer de verwerking leptomeningen protocol succesvol is geweest, is uitgroei meningeale fibroblasten eerst waargenomen 3-9 dagen na sectie, hoewel dit kan afhankelijk van de duur van post-mortem interval voor de hersenen. Figuur 1 toont hersenvlies fibroblast culturen van vier verschillende donoren. Figuur 1A toont een leptomeningen stuk naar beneden door een glazen afdekplaat slip (donkere diagonale lijn) en fibroblast uitgroei rond het weefsel vier dagen na de verwerking van een 88-jarige donor plaats met 10 uur en 20 minuten post-mortem interval. Figuur 1B toont schaars fibroblast uitgroei zeven dagen na de verwerking van een 70-jarige donor en 11 h 45 min post-mortem interval. Figuur 1C toont fibroblast uitgroei 13 dagen na dissectie van een 88-jarige donor en 24 uur post-mortem interval. Figuur 1D toont een confluente cultuur die werd gepasseerd in een T75 Vessel en cellen kunnen worden gecryopreserveerd in dit stadium.
Meningeale fibroblasten zijn bipolaire of multipolaire en hebben verlengd of onregelmatige vormen (figuur 2). Ze worden gekenmerkt door de expressie van glycoproteïne fibronectine en fibroblast marker SERPINH is gelokaliseerd in het endoplasmatisch reticulum (Figuren 2A-2C). Meningeale fibroblasten niet immunoreactieve aan transcriptiefactor SRY (geslacht bepalend gebied Y) -Box 2 (SOX2) die een merker voor ongedifferentieerde stamcellen (Figuur 2A). Echter, een subset van leptomeningiale fibroblasten positief voor Type VI intermediaire filament nestine, een neurale stamcel marker (figuur 2B) en neuron-specifieke klasse III beta-tubuline (TUJ1) (figuur 2C).
Figuur 1.Voorbeelden van uitgroei van meningeale fibroblasten uit vier verschillende donoren. A) leptomeningen stuk weefsel wordt vastgehouden door een glazen afdekplaat slip (donkere diagonale lijn) en fibroblast uitgroei rond het weefsel werd waargenomen vier dagen na de verwerking van een 88-jarige donor met 10 h 20 min post-mortem interval. B) Dunne fibroblast uitgroei zeven dagen na de verwerking van een 70-jarige donor en 11 h 45 min post-mortem interval. C) Meningeale fibroblast uitgroei 13 dagen na dissectie van een 88-jarige donor en 24 uur post-mortem interval. D) Confluente meningeale fibroblast cultuur gepasseerd in een T75 vat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Immunost aining voor hersenvliezen, stamcel, neurale stamcellen, en neuron markers. A) Immunofluorescentie kleuring voor fibroblast markers SERPINH1 (groen) en stamcel marker SOX2 (rood). SERPINH1 werd uitgedrukt in alle celkernen geteld. Stamcel marker SOX2 werd niet gedetecteerd in deze leptomeningen cultuur. B) Immunofluorescentie kleuring voor hersenvliezen-specifieke marker fibronectine (groen) en neurale stamcellen marker nestin (rood). 52,1% van de getelde celkernen waren positief voor zowel nestin en fibronectine. C) Immunofluorescentie kleuring voor SERPINH1 (groen) en neuronale marker TUJ1 (rood). 6,9% van de getelde kernen waren positief voor SERPINH1 en TUJ1. Celgetalgegevens werden bepaald met behulp van de handleiding Cell Counter Multi-Select tool op ImageJ. Één gekleurd beelden werden beoordeeld door het tellen van het aantal DAPI-positieve cellen in vergelijking met het aantal positieve cellen voor elke marker in procenten.lank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Dag | Verwachte resultaten | |||||
| 3-9 | Uitvloeisel van de eerste meningeale fibroblasten. | |||||
| 7-18 | Meningeale fibroblasten uit te breiden, en de cultuur wordt dichter. Media veranderen van 2 ml om de andere dag. | |||||
| 18-25 | 6-well plaat wordt confluent zodra meningeale fibroblasten confluent combineren drie putjes in een T75 kolf (passage 1: 3 tot 1: 4). | |||||
| 26-45 | Een confluente T75 kweekfles resultaten 5-7 miljoen cellen. Cryopreserve meningeale fibroblasten 1 miljoen cellen / flesje. | |||||
table 1: Tijdlijn van cellulaire uitgroei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een eenvoudig en robuust protocol om een meningeale fibroblast cultuur afkomstig zijn van menselijke postmortem leptomeningen verzameld in combinatie met een brein donatie. Er zijn maar weinig beschrijvingen van protocollen bij celculturen afkomstig van postmortale menselijk materiaal. Twee studies beschrijven huid afgeleide fibroblast cultures 7, 8, 9, een studie beschrijft dura monsters 10 en andere beschrijft niet- gecryopreserveerde monsters ingevroren dura 11.
Wij bereiden twee 6-wells platen met 2-3 weefsel stukjes (ongeveer 3 mm x 3 mm) in elk putje om voldoende uitgroei en verwijding voor cryopreservatie waarborgen. Het is cruciaal dat de hersenvliezen stukken door voorzichtig het indrukken van een steriele glazen afdekplaat slip op het weefsel stukken om ze te houden in plaats van de cultuur schotel zijn bevestigd. Zonder een dekglaasje, de hersenvliezen stukken zullen geent hechten aan de bodem van de kweekschaal. Succesvolle uitgroei wordt alleen waargenomen als de weefselstukken in direct contact met de kunststof bodem. Als de stukken weefsel drijven in het kweekmedium wordt geen cel uitgroei van het weefsel waargenomen. Dit dient met ongeveer 500 pi groeimedium niet uitdrogen van de monsters en vervolgens optellen tot 1 ml groeimedium aan het vat. Het is niet noodzakelijk verdere siliconenkit de dekglaasjes zijn plaats te houden.
Als de stukken kleiner dan 3 mm x 3 mm, de uitgroei trager en in sommige gevallen geen confluente kweken kan worden vastgesteld. Het is cruciaal om niet groeien de cellen te schaars en we raden een split-verhouding van 1: 3 tot 1: 4. Individuele kleine putten zorgen voor een beter beheer van mogelijke besmetting. Wells kunnen afzonderlijk worden gevoed en pipetten worden gewijzigd tussen de putjes.
We hebben met succes afgeleid meningeale fibroblasten van 9 postmortem monsters met een postmortem interval tussen 10-24 uur. Donoren waren tussen 70 en 88 jaar en de ziekte duur van de ziekte van Parkinson tussen 8-31 jaar. We merken dat weefsels met een langere post-mortem interval langer duren voordat de eerste cellen groeien uit (tot 9 dagen). In monsters met een kortere post-mortem interval, zien we uitgroei zo snel 3 dagen na de bereiding. We hebben niet gemerkt van een verschil in groei op basis van de leeftijd van de donor, maar we hadden alleen donateurs> 70 jaar.
De betekenis van de werkwijze is het afleiden van een primaire celkweek een sporadische neurodegeneratieve ziekte zoals de ziekte van Parkinson, die momenteel alleen bij autopsie 12 kan worden bevestigd, 13, 14 omdat er geen volledig definieert klinische kenmerken, beeldvormende technieken of biomarkers die kunnen zorgen voor een definitieve diagnose gedurende 15 leven. We hebben eerder devekeld een protocol voor de afleiding van fibroblasten van de huid biopsieën in de eerste plaats voor genetisch bevestigde gevallen van de ziekte van Parkinson 16 die ons hebben toegestaan om geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren en te bestuderen ziektemechanismen 17, 18, maar dit nieuwe protocol zal cruciaal zijn voor neuropathologische veranderingen direct te vergelijken met de bevindingen in vitro sporadische ziekte van Parkinson. Voor zover wij weten, is dit het eerste protocol voortvloeiende meningeale fibroblasten van post-mortem menselijk leptomeningen.
Meningeale fibroblast cultures kunnen direct worden gebruikt voor de studie van moleculaire mechanismen betreffende ziekte of letsel of als bron voor nucleaire herprogrammering in geïnduceerde pluripotente stamcellen of directe omzetting in neuronale culturen geavanceerde preklinische modellen voor de ziekte van sporadische Parkinson of andere neurodegeneratieve aandoeningen 19. deze human-patiënt afgeleide modellen vormen de basis en te versnellen vooruitgang in de gepersonaliseerde en regeneratieve geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1,000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
