Summary
Den leptomeninges eksplantat kultur protokol fra human postmortem hjerne er en teknisk robust og enkel måde at udlede fibronektin-positive meningitis fibroblaster inden for 6-8 uger, og Cryopreservering ca. 20-30 millioner celler.
Abstract
Selv om der er gjort store fremskridt i den kliniske karakterisering af Parkinsons sygdom, rapporterer flere undersøgelser, at diagnosticering af Parkinsons sygdom ikke er patologisk bekræftet hos op til 25% af klinisk diagnosticeret Parkinsons sygdom. Derfor væv opsamlet fra klinisk diagnosticerede patienter med idiopatisk Parkinsons sygdom kan have en høj fejldiagnose; dermed in vitro-undersøgelser fra sådanne væv for at studere Parkinsons sygdom som en præklinisk model kan blive forgæves.
Ved at samle postmortem human leptomeninges med en bekræftet neuropatologisk diagnose af Parkinsons sygdom og karakteriseret ved nigrostriatale celletab og intracellulære protein inklusioner kaldet Lewy-legemer, kan man være sikker på, at klinisk observeret parkinsonisme ikke er forårsaget af en anden underliggende sygdomsproces (f.eks tumor, arteriosklerose).
Denne protokol Presents dissektion og forberedelse af postmortem menneskelige leptomeninges til afledning af en meningeal fibroblast kultur. Denne procedure er robust og har en høj succesrate. Udfordringen af kulturen er sterilitet som hjernen indkøb generelt ikke udføres under sterile forhold. Derfor er det vigtigt at supplere dyrkningsmediet med en cocktail af penicillin, streptomycin og amphotericin B.
Udledningen af meningitis fibroblaster fra autopsi-bekræftede tilfælde med Parkinsons sygdom giver grundlaget for in vitro-modellering af Parkinsons sygdom. Meningeal fibroblaster vises 3-9 dage efter prøveforberedelse og omkring 20-30 millioner celler kan kryopræserveres i 6-8 uger. Den meningeal fibroblast kultur er homogen og cellerne udtrykker fibronectin, et almindeligt anvendt markør til at identificere meninges.
Introduction
Meninges består af tre membraner, der beskytter hjernen: dura mater, arachnoid og pia mater. For nylig er det blevet erkendt, at meninges også spille en vigtig rolle i udviklingen af hjernen og hjerne homeostase 1. Meninges er afledt af mesenchymale og crista neuralis-afledte celler og interessant er det blevet vist, at progenitorceller bopæl i meninges kan give anledning til neuroner in vitro og efter transplantation in vivo 2, 3, 4. Meninges kulturer er også med succes anvendt som fødelag, da de besidder stromal celleafledt inducerende aktivitet for differentiering af embryonale stamceller i dopaminerge neuroner 5. Desuden leptomeninges har potentiale til direkte at differentiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter under iskæmiske tilstande 6.
Til denne protokol, er humane postmortem meninges prøver indsamlet fra arachnoid og pia mater, kollektivt kaldet leptomeninges, og er indkøbt som en del af en menneskelig hjerne donation til forskningsformål. Dissektion af hjernen er udført inden for 24 timer fra døden og leptomeninges prøven anbringes i koldt vækstmedier til videre forarbejdning i næste 6-8 timer som illustreret her i denne protokol.
Denne protokol beskriver dissektion og fremstilling af humane meninges prøver til udviklingen af patientens primære leptomeninges cellekultur. Vævet skæres i 25-30 stykker af ca. 3 mm x 3 mm kvadrater. Tre stykker anbringes i hver 6-brønds gelatineovertrukket godt og holdes nede med runde dækglas. Den meninges dissektion tager omkring 25-35 min. Den største udfordring med denne kultur er sterilitet som hjernen udtagning, transport og dissektion generelt ikke udføres under sterile betingelser. Therefore, er det vigtigt at supplere dyrkningsmediet med en cocktail af penicillin, streptomycin og amphotericin B og anvende multi-brønds skåle til hver kultur vævsstykker.
Udvækst af meningeal fibroblaster sker normalt inden for den første uge. Mediet skiftes hver to til tre dage, indtil cellerne er sammenflydende og cellerne enzymatisk passage. De meningeale fibroblaster kryokonserveres ved 1 million celler pr ml / hætteglas i kryopræservering medier. Med denne protokol, kan 20-30 millioner meningeal fibroblaster udledes i 6-8 uger for nedfrysning. Downstream anvendelser af disse meningeal fibroblaster er primære kulturer til sygdom forskning, direkte neuronal differentiering eller afledning af inducerede pluripotente stamceller fra leptomeninges for forståelse af sygdomsmekanismer og for lægemiddeludvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
registrering Hjernen donation omfatter dokumentation af registranten af deres hensigt til at donere. Obduktionen tilladelse til væv hentning leveres af de pårørende som tilladt ved lov. Forskning undersøgelser med anvendelse af indsamlede autopsiprøver gennemgås af den institutionelle Review Board (IRB) for at sikre overholdelse af Health Insurance Mobilitet og Accountability Act (HIPAA) regler.
BEMÆRK: leptomeninges prøverne er indsamlet af hjernen dissektoren eller neuropathologist under en hjerne dissektion og gemmes i 50 ml koniske rør indeholdende 25-30 ml meninges vækstmedier. Prøven opbevares ved 4 ° C indtil prøvefremstilling. Forarbejdningen bør udføres så hurtigt som muligt, da levedygtighed af celler falder med tiden post mortem.
1. Set-up før Start af leptomeninges Dissection
BEMÆRK: Trin 1.1 - 1.3 skal udføres inde i et biosikkerhed skab.
- Forbered meninges vækstmedier ved at kombinere 375 ml Dulbeccos Modified Eagle Media, 100 ml føtalt bovint serum, 5 ml 10 mM ikke-essentielle aminosyrer, 5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamin, 5 ml 100 mM natriumpyruvat, 5 ml 10.000 U / ml penicillin / streptomycin og 5 ml 250 ug / ml amphotericin B i 500 ml filterenhed. Filtrer og blandes. Brug medier i op til fire uger.
- Læg alle materialer i biosikkerhed kabinet, før du starter dissektion: 4x petriskåle, 2x 6-brønds plader, 2x skalpeller, 15-20 steriliserede 15-mm dækglas, fosfatbuffer saltvand (PBS), serologiske pipetter, opsugning pipetter.
- Tilsæt 1 ml sterilt-autoklaveret 0,1% gelatine-opløsning til hver brønd i en 6-brønds plade. Sæt pladen til side i 30-60 min. Forbered 2x 6-brønds plader.
2. Udarbejdelse af leptomeninges Sample
BEMÆRK: Trin 2,1-2,3 skal udføres inde i et biosikkerhed skab.
- Der tilsættes ca. 10 ml PBS ien steril 10-cm vævskulturskål og placere meninges prøve i skålen. Ved hjælp af pincet, forsigtigt vaske leptomeninges med PBS for at fjerne blod.
- Overfør meninges til en ny 10-cm vævskulturskål indeholdende 10 ml frisk PBS og fortsætte vask. Gentag efter behov for at fjerne så meget blod som muligt.
- Brug to skalpeller, skåret leptomeninges væv ind en cirka 6 cm x 6 cm stort stykke.
- Placér låg på en dyrkningsskål og overførsel til et dissektionsmikroskop i en horisontal laminær strømning.
3. Dissektion af leptomeninges Tissue
BEMÆRK: Trin 3.1 - 3.3 skal udføres inde i en horisontal laminar flow hætte ved anvendelse af et dissektionsmikroskop.
- Fjern blodkar fra en region på leptomeninges stykke (trin 2.3) stor nok til at skabe mindst 20-25 3 mm x 3 mm stykker. Hold leptomeninges på plads med den ene skalpel og med den anden, så brug en blid og overfladisk skrabe moning til at adskille skibene.
- Skær små firkanter af væv fra den forberedte region. Skær i en trinvis proces ved først at lave større stykker og derefter udskæring dem i mindre sektioner.
- Brug en skalpel til at holde vævet på plads og en anden skalpel til at skære vævet med en rokkende bevægelse. På grund af konsistensen af vævet, er det vanskeligt at skubbe skalpeller mod hinanden. Dette vil kun rive vævet fra hinanden og resulterer i ujævne kanter.
- Fortsæt skære stykkerne i halvdelen til der er omkring 20-25 3 mm x 3 mm stykker.
4. Overførsel af dissekerede meninges Pieces på vævsdyrkningsplader
BEMÆRK: Trin 4 skal udføres inde i et biosikkerhed skab.
- Aspirer gelatine fra 6-brønds plade (fra trin 1.3). Tilsæt 1 ml af hjernehinden vækstmedier til hver brønd. Ved hjælp af steril pincet, placere 3-4 biopsi stykker i hver brønd.
5. Placering af dækglas end Meninges Pieces
BEMÆRK: Trin 5.1 - 5.2 er der skal udføres inde i en horisontal laminar flow hætte ved anvendelse af et dissektionsmikroskop.
- Dæk stykkerne med 1-2 sterile 15-mm cirkulære dækglas per brønd.
- Tryk ned med pincet for at sikre stykkerne rører bunden af pladen. Dette tillader binding af vævsstykker til bunden af brønden.
- Placer 6-brønds plade til en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
6. Cell Culture Maintenance
BEMÆRK: Trin 6,1-6,3 skal udføres inde i et biosikkerhed skab. Håndtag petriskåle med omhu som dækglas ikke skal bevæge sig og løsne meninges stykker.
- Efter 2 dage i kultur, tilføje yderligere 1 ml frisk hjernehinde vækstmedier til hver brønd.
- På dag 7, omhyggeligt aspireres medierne og tilsættes 2 ml frisk medium til hver brønd.
- Efter Dag 9, fortsætte med at ændre vækstmedier hveranden dag, indtil kulturen bliver sammenflydende.
7. Passage
BEMÆRK: Alle trin skal udføres inde i et biosikkerhed skab. Når meningeal fibroblaster har migreret ud af meningitis vævsstykker og begynder at vokse mod kanterne af dyrkningsbeholderen, udvide meningeal fibroblaster i større dyrkningsskål.
- Før du starter passage, pels kultur fad med 1% gelatine i 15-30 min.
- Aspirer medier fra 6-brønds skål og vask cellerne med 2 ml PBS.
- Tilsæt 1 ml trypsin / EDTA til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 5-10 min. Det er ikke nødvendigt at fjerne dækglas eller meningeal væv til dette trin.
- Når cellerne er afrundet og begynder at frigøre, tilsættes 2 ml kulturmedier.
- Pipette celler op og ned til helt forstyrre alle klumper og overføre cellen løsningen på større kultur fad.
- Brug et forhold på 1: 3 til 1: 4 for at kombinere celler fra tre 6-brønds skåle itil en T75 dyrkningsskål.
- Når meningeal fibroblastceller er sammenflydende i T75-dyrkningskolber, Trypsinisér cellerne, og Cryopreservering i kryokonservering medier ved 1x10 6 celler / ml per hætteglas. En T75 kultur kolbe med sammenflydende meningitis fibroblaster indeholder omkring 5-7 millioner celler.
8. Karakterisering af meningeal fibroblaster ved immunfarvning
BEMÆRK: Før du starter proceduren, forberede 4% paraformaldehydopløsning, 5% normalt gedeserum i PBS (blokerende buffer), 0,3% Triton X-100 i PBS (permeabilisering buffer), primære og sekundære antistof løsninger, og 1 pg / ml Hoechst 33342 fortyndet i PBS fra 10 mg / ml stamopløsning.
- Seed 15.000 til 30.000 meningeale fibroblaster i 8 brønde kammer objektglas overtrukket med 0,1% gelatine.
- Efter 24 timer, når cellerne er bundet, fix celler i 100 pi 4% paraformaldehyd per brønd i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask brøndene 3 gange med 1 x PBS.
- Permeabilisere cellerne med 150 pi af 0,3% Triton X-100 i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask brøndene 3 gange med 1 x PBS.
- Tilsæt 200 pi blokerende opløsning (PBS + 5% normalt gedeserum) i 1 time ved stuetemperatur.
- Aspirer blokeringsopløsningen, og der tilsættes 150 pi af ønskede primære antistoffer fortyndet i blokeringsopløsning. For dobbelt-farvning, forberede arbejder fortyndinger af primære antistoffer i separate centrifugerør på is som følger:
- Forberede 1: 300 fortynding af anti-Fibronectin + 1: 200 fortynding af anti-nestin i blokeringsopløsning. Forberede 1: 250 fortynding af anti-SERPINH1 + 1: 1.000 fortynding af anti-TUJ1 i blokeringsopløsning. Forberede 1: 250 fortynding af anti-SERPINH1 + 1: 100 fortynding af anti-SOX2 i blokeringsopløsning
- Der inkuberes ved 4 ° C natten over.
- Vask brøndene 3 gange med 1 x PBS.
- Forbered en arbejdsgruppe 1: 400 fortynding af fluorescens-mærket sekundære antistoffer gede anti-kanin (grøn; Ex / Em 2 2 590/617 nm) i blokerende opløsning, og 100 pi til hver brønd. Der inkuberes i 1 time i mørke ved stuetemperatur. Vask derefter brøndene en gang med 1 x PBS.
- Tilsæt 100 pi 1 mg / ml Hoechst 33342 (blå; Ex / Em 2 358/461 nm) til hver brønd og inkuberes i mørke i 3 min. Vask brøndene 3 gange med 1 x PBS, forlader i den endelige 1x PBS vask i brønden, og dække objektglasset med aluminiumsfolie.
- Analyser celler under fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når leptomeninges behandlingsprotokol har været en succes, er udvækst af meningitis fibroblaster først observeret tre til ni dage efter dissektion, selv om dette kan afhænge af længden af intervallet post-mortem for hjernen. Figur 1 viser meningeale fibroblastkulturer af fire forskellige donorer. Figur 1A viser en leptomeninges stykke holdt nede af et glas dækglas (mørk diagonal linje) og fibroblast udvækst omkring væv fire dage efter behandling fra en 88-årig donor med 10 timer interval post-mortem 20 min. Figur 1B viser sparsomme fibroblast udvækst syv dage efter behandling fra en 70-årig donor og 11 h 45 min post mortem interval. Figur 1C viser fibroblast udvækst 13 dage efter dissektion fra en 88-årig donor og 24 timer post mortem interval. Figur 1D viser et konfluent kultur, som blev passeret ind i en T75 Vessel og celler kan kryopræserveres på dette stadium.
Meningeal fibroblaster er bipolar eller multipolær og har aflange eller uregelmæssige former (Figur 2). De er karakteriseret ved ekspressionen af glycoprotein fibronectin og fibroblast markør SERPINH som er lokaliseret til det endoplasmatiske reticulum (figur 2A-2C). Meningeale fibroblaster er ikke immunreaktive til transkriptionsfaktor SRY (Sex bestemmende region Y) -Box 2 (SOX2), som er en markør for udifferentierede stamceller (figur 2A). Men en delmængde af leptomeningeal fibroblaster er positiv for type VI mellemliggende filament nestin, en neural stamcelle markør (figur 2B), og neuron-specifik klasse III beta-tubulin (TUJ1) (figur 2C).
Figur 1.Eksempler på udvækst af meningeal fibroblaster fra fire forskellige donorer. A) leptomeninges væv stykke holdes nede af et glas dækglas (mørk diagonal linje) og fibroblast udvækst omkring vævet blev observeret fire dage efter behandling fra en 88-årig donor med 10 timer interval post-mortem 20 min. B) Sparse fibroblast udvækst syv dage efter behandling fra en 70-årig donor og 11 h 45 min post mortem interval. C) Meningeal fibroblast udvækst 13 dage efter dissektion fra en 88-årig donor og 24 timer post mortem interval. D) Sammenflydende meningeal fibroblast kultur passeret ind i en T75 fartøj. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Immunost aining for meninges, stamceller, neural stamcelle, og neuron markører. A) Immunfluorescensfarvning for fibroblast markører SERPINH1 (grøn) og stamcellemarkør SOX2 (rød). SERPINH1 blev udtrykt i alle optalte cellekerner. Stamcellemarkør SOX2 blev ikke påvist i disse leptomeninges kultur. B) Immunofluorescens-farvning for meninges-specifikke markør fibronectin (grøn) og neural stamcelle markør nestin (rød). 52,1% af optalte cellekerner var positive for både nestin og fibronectin. C) Immunofluorescens-farvning for SERPINH1 (grøn) og neuronal markør TUJ1 (rød). 6,9% af optalte kerner var positive for SERPINH1 og TUJ1. Celletalsdata blev bestemt ved hjælp af den manuelle Cell Counter Multi-Select værktøj på ImageJ. Single farvede billeder blev vurderet ved at tælle antallet af DAPI-positive celler i forhold til antallet af celler positive for hver markør i procenter.lank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Dag | forventede resultater | |||||
| 3-9 | Udvækst af første meningeal fibroblaster. | |||||
| 7-18 | Meningeal fibroblaster udvide, og kultur bliver tættere. Mediaskift af 2 ml hver anden dag. | |||||
| 18-25 | 6-brønds plade bliver sammenflydende, når meningeal fibroblaster er sammenflydende kombinere tre brønde i en T75 dyrkningskolbe (passage ved 1: 3 til 1: 4). | |||||
| 26-45 | Et sammenflydende T75 dyrkningskolbe resulterer i 5-7 millioner celler. Cryopreservering meningeale fibroblaster ved 1 million celler / hætteglas. | |||||
Table 1: Tidslinje for cellulær udvækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en enkel og robust protokol til at udlede en meningeal fibroblast kultur fra humane postmortem leptomeninges indsamlet i forbindelse med en hjerne donation. Der er meget få beskrivelser af protokoller at udlede cellekulturer fra postmortem humant materiale. To studier beskriver hudafledte fibroblastkulturer 7, 8, 9, en undersøgelse beskriver dura prøver 10, og en anden beskriver ikke-kryopræserverede frosset dura prøver 11.
Vi udarbejder to 6-brønds plader med 2-3 vævsstykker (ca. 3 mm x 3 mm) i hver brønd for at sikre tilstrækkelig udvækst og ekspansion før kryopræservering. Det er kritisk, meninges stykker er fastgjort til dyrkningsskålen ved forsigtig presning en steril dækglas onto vævsstykker at holde dem på plads. Uden et dækglas, meninges stykker vil ikket vedhæfte til bunden af dyrkningsskålen. Vellykket udvækst kun observeret, når vævsstykkerne er i direkte kontakt med plastik bund. Hvis vævsstykkerne flyde i dyrkningsmedierne, er ingen celle udvækst fra vævet observeret. Dette bør udføres med ca. 500 pi vækstmedium til ikke tørre ud prøverne og derefter tilføje op til 1 ml vækstmedium til beholderen. Det er ikke nødvendigt yderligere at anvende silikone for at holde dækglas på plads.
Hvis stykkerne er mindre end 3 mm x 3 mm, det udvækst er langsommere og i nogle tilfælde kan etableres ikke sammenflydende kulturer. Det er vigtigt at ikke vokse cellerne for sparse og vi anbefaler en split forhold på 1: 3 til 1: 4. Individuelle små brønde mulighed for bedre styring potentiel forurening. Brønde kan fodres individuelt og pipetter skal skiftes mellem brøndene.
Vi har med succes afledt meningeal fibroblaster fra 9 postmortem prøver med en postmortem intervallet mellem 10-24 timer. Donorerne var mellem 70 og 88 år og har sygdom varigheder på Parkinsons sygdom mellem 8-31 år. Vi bemærker, at væv med et interval længere post mortem tager længere tid, før de første celler vokse ud (op til 9 dage). I prøver med kortere interval post mortem, vi observerer udvækst, så snart 3 dage efter forberedelse. Vi har ikke bemærket en forskel i vækst baseret på alder af donor, men vi havde kun donorer> 70 år.
Betydningen af metoden er afledningen af en primær cellekultur for en sporadisk neurodegenerativ sygdom som Parkinsons sygdom, som kun i øjeblikket bekræftes ved obduktion 12, 13, 14, da der er ingen helt definere kliniske karakteristika, billeddiagnostiske teknikker eller biomarkører, der kan give en sikker diagnose i løbet af livet 15. Vi har tidligere developed en protokol for afledningen af fibroblaster fra huden biopsier primært for genetisk bekræftede tilfælde af Parkinsons sygdom 16, som har givet os mulighed for at generere inducerede pluripotente stamceller og studere sygdomsmekanismer 17, 18, men denne nye protokol vil være afgørende for direkte at sammenligne neuropatologiske forandringer med resultaterne i vitro for sporadisk Parkinsons sygdom. Til vores viden, er dette den første protokol følger meningeal fibroblaster fra post mortem menneskelige leptomeninges.
Meningeale fibroblastkulturer direkte kan anvendes til undersøgelse af molekylære mekanismer vedrørende sygdom eller beskadigelse eller som en kilde til nuklear omprogrammering i inducerede pluripotente stamceller eller direkte omdannelse til neuronale kulturer som avancerede prækliniske modeller for sporadisk Parkinsons sygdom eller andre neurodegenerative lidelser 19. Disse humand patient-afledte modeller giver fundamentet og fremskynde fremskridt i personlig og regenerativ medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1,000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
