Summary
بروتوكول ثقافة السحايا الرقيقة يزدرع من تشريح الإنسان الدماغ هو وسيلة قوية من الناحية الفنية وبسيطة لاستخلاص الخلايا الليفية السحائية-الفيبرونكتين إيجابية في غضون 6-8 أسابيع وcryopreserve ما يقرب من 20 حتي 30000000 الخلايا.
Abstract
على الرغم من إحراز تقدم كبير في توصيف السريري لمرض الشلل الرعاش، وتفيد العديد من الدراسات أن تشخيص مرض باركنسون لم يتأكد بشكل مرضي في ما يصل إلى 25٪ من تشخيص المرض سريريا باركنسون. لذلك، الأنسجة التي تم جمعها من المرضى الذين شخصت سريريا مع مرض مجهول السبب باركنسون يمكن أن يكون ارتفاع معدل خطأ في التشخيص. وبالتالي في الدراسات المختبرية من هذه الأنسجة لدراسة مرض باركنسون كنموذج قبل السريرية يمكن أن تصبح غير مجدية.
من خلال جمع السحايا الرقيقة الإنسان بعد الوفاة مع تشخيص عصبية مرضية مؤكدة بمرض باركنسون وتميزت فقدان الخلية السوداوي المخططي والادراج البروتين داخل الخلايا تسمى الهيئات ليوي، يمكن للمرء أن يكون على يقين من أن الرعاش وحظ سريريا لا ينتج عن عملية المرض الكامنة أخرى (مثل الورم، وتصلب الشرايين).
هذا presen بروتوكولنهاية الخبر تشريح وإعداد السحايا الرقيقة الإنسان بعد الوفاة لاشتقاق ثقافة الخلايا الليفية السحائية. هذا الإجراء هو قوي ولديه نسبة نجاح عالية. التحدي المتمثل في الثقافة هو العقم كما هو عادة يتم تنفيذ شراء الدماغ تحت ظروف معقمة. وبالتالي، فمن المهم لاستكمال سائل الإعلام والثقافة مع كوكتيل من البنسلين، الستربتومايسين، وأمفوتيريسين B.
اشتقاق الخلايا الليفية السحائية من حالات التشريح المؤكدة بمرض باركنسون يوفر الأساس لفي المختبر نماذج من مرض الشلل الرعاش. تظهر الخلايا الليفية سحائي بعد 3-9 أيام إعداد العينات وحوالي 20-30 مليون خلية يمكن cryopreserved في 6-8 أسابيع. ثقافة الخلايا الليفية السحائية هي متجانسة والخلايا تعبر عن فبرونيكتين، علامة تستخدم عادة لتحديد السحايا.
Introduction
تتكون السحايا من ثلاثة أغشية التي تحمي الدماغ: الأم الجافية، العنكبوتية والأم الحنون. وفي الآونة الأخيرة، تم الاعتراف بأن السحايا أيضا أن تلعب دورا هاما في نمو الدماغ والمخ التوازن 1. وتستمد السحايا من الوسيطة والخلايا المشتقة من قمة العصبية والمثير للاهتمام، فقد تبين أن الخلايا السلف المقيمين في السحايا يمكن أن تؤدي إلى الخلايا العصبية في المختبر، وبعد زرع في الجسم الحي 2، 3، 4. كما استخدمت الثقافات السحايا بنجاح كما طبقات المغذية، كما أنها تمتلك انسجة المشتقة من خلية النشاط على حث لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الدوبامين 5. وعلاوة على ذلك، السحايا الرقيقة لديها القدرة على التفريق مباشرة إلى الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes في ظل ظروف الدماغية 6.
لهذا البروتوكول، يتم جمع عينات السحايا بعد الوفاة البشرية من أم عنكبوتية والحنون، مجتمعة تسمى السحايا الرقيقة، ويتم شراؤها كجزء من التبرع الدماغ البشري لأغراض البحث. يتم إجراء تشريح الدماغ خلال 24 ساعة من وفاة ويتم وضع عينة السحايا الرقيقة في وسائل الإعلام نمو البارد لمزيد من المعالجة ضمن ح 6-8 القادمة كما هو موضح هنا في هذا البروتوكول.
يصف هذا البروتوكول تشريح وإعداد العينات السحايا الإنسان لتطوير زراعة الخلايا السحايا الرقيقة الأولية للمرضى. يتم قطع الأنسجة إلى 25-30 قطعة من حوالي 3 ملم × 3 مربعات ملم. وضعت ثلاث قطع في كل جيدا 6 جيدا والاحتفاظ باستمرار مع coverslips الزجاج ذهابا والجيلاتين المغلفة. تشريح السحايا يستغرق حوالي 25-35 دقيقة. ويتمثل التحدي الرئيسي مع هذه الثقافة بشكل عام يتم تنفيذ معقمة وشراء الدماغ، والنقل، وتشريح تحت ظروف معقمة. تherefore، فمن المهم لاستكمال سائل الإعلام والثقافة مع كوكتيل من البنسلين، الستربتومايسين، والأمفوتريسين B واستخدام أطباق متعددة جيدا لحدة قطعة نسيج الثقافة.
ثمرة من الخلايا الليفية السحائية يحدث عادة في غضون الأسبوع الأول. يتم تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام حتى الخلايا هي متكدسة وو passaged الخلايا إنزيمي. والخلايا الليفية السحائية هي cryopreserved من 1 مليون خلية لكل مليلتر / قارورة في وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد. مع هذا البروتوكول، 20-30000000 الليفية سحائي يمكن أن تستمد في 6-8 أسابيع لحفظ البرودة. تطبيقات المصب من هذه الخلايا الليفية السحائية هي الثقافات الأولية للبحوث الأمراض، تمايز الخلايا العصبية المباشر أو اشتقاق الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها من السحايا الرقيقة لفهم آليات المرض وتطوير الأدوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتضمن تسجيل التبرع الدماغ وثائق من قبل المسجل من عزمهم على التبرع. يتم توفير إذن التشريح لاسترجاع الأنسجة من قبل الأقرباء ما يسمح به القانون. يتم مراجعة الدراسات البحثية باستخدام عينات التشريح التي تم جمعها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) لضمان الامتثال لنقل التأمين الصحي والأنظمة (HIPAA) قانون محاسبة.
يتم جمع عينات السحايا الرقيقة التي مشرح الدماغ أو أمراض الأعصاب خلال تشريح الدماغ ويتم تخزينها في أنابيب مخروطية 50 مل تحتوي على 25-30 مل السحايا وسائط النمو: ملاحظة. يتم تخزين العينة عند 4 درجات مئوية حتى إعداد العينات. يجب أن يتم تنفيذ معالجة في أقرب وقت ممكن لبقاء الخلايا تتناقص مع مرور الزمن بعد الوفاة.
1. مجموعة المتابعة قبل بدء السحايا الرقيقة تشريح
ملاحظة: خطوات 1،1-1،3 هي التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- إعداد وسائط النمو السحايا من خلال الجمع بين 375 مل من النسر وسائل الإعلام Dulbecco والتعديل، 100 مل من مصل بقري جنيني، 5 مل 10 ملي الأحماض الأمينية غير الأساسية، 5 مل 200 ملي L-ألانيل-L-الجلوتامين، 5 مل 100 ملي الصوديوم البيروفات، 5 مل 10،000 U / مل البنسلين / الستربتومايسين و 5 مل 250 ميكروغرام / مل الامفوتريسين في 500 وحدة تصفية مل. تصفية ومزج. استخدام وسائل الإعلام لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.
- وضع جميع المواد في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية قبل البدء في تشريح: أطباق بتري 4X، 2X 6 لوحات جيدا، 2X المشارط، 15-20 تعقيم 15 ملم تغطية زلات، الفوسفات عازلة المالحة (PBS)، الماصات المصلية، الشفط الماصات.
- إضافة 1 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين معقمة تعقيمها إلى كل بئر من لوحة 6 جيدا. تعيين لوحة جانبا لمدة 30-60 دقيقة. إعداد 2X 6 لوحات جيدا.
2. إعداد السحايا الرقيقة عينة
ملاحظة: خطوات 2،1-2،3 هي التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- إضافة حوالي 10 مل من برنامج تلفزيوني لالعقيمة 10 سم صحن زراعة الأنسجة ووضع العينة السحايا في الطبق. باستخدام ملقط، ويغسل بلطف السحايا الرقيقة مع برنامج تلفزيوني لإزالة الدم.
- نقل السحايا إلى 10 سم، وطبق زراعة الأنسجة الجديدة التي تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني جديد ومواصلة الغسيل. كرر حسب الضرورة لإزالة الكثير من الدم ممكن.
- باستخدام اثنين من المشارط، وقطع السحايا الرقيقة الأنسجة إلى حوالي 6 سم × 6 سم قطعة كبيرة.
- مكان غطاء على طبق ثقافة ونقل إلى مجهر تشريح في غطاء تدفق الصفحي أفقي.
3. تشريح الأنسجة السحايا الرقيقة
ملاحظة: خطوات 3،1-3،3 هي التي يتعين القيام بها داخل غطاء تدفق الصفحي أفقي باستخدام مجهر تشريح.
- إزالة الأوعية الدموية من منطقة على قطعة السحايا الرقيقة (الخطوة 2.3) كبيرة بما يكفي لخلق 20-25 مارس على الأقل قطع ملم × 3 مم. عقد السحايا الرقيقة في مكان مع مشرط واحد ومع الآخر، استخدم مو كشط لطيف والضحلةنشوئها لفصل السفن.
- قطع مربعات صغيرة من نسيج المنطقة المعدة. قطع في عملية متدرجة بجعل أول أكبر قطعة ثم تشريح تلك إلى أقسام أصغر.
- استخدام مشرط واحد لعقد الأنسجة في مكان ومشرط آخر لقطع الأنسجة مع حركة التأرجح. ويرجع ذلك إلى اتساق الأنسجة، فمن الصعب أن الشريحة المشارط ضد بعضها البعض. هذا وسوف المسيل للدموع فقط الأنسجة، وبصرف النظر يؤدي إلى حواف خشنة.
- مواصلة قطع القطع في نصف حتى هناك حوالي 20-25 قطع 3 مم × 3 مم.
4. نقل تشريح السحايا قطع على لوحات زراعة الأنسجة
ملاحظة: الخطوة 4 هي التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- الجيلاتين نضح من لوحة 6 جيدا (من الخطوة 1.3). إضافة 1 مل من وسائط النمو السحايا إلى كل بئر. باستخدام ملقط معقم، ضع قطعة 3-4 الخزعة في كل بئر.
5. التنسيب من زلات تغطية على Meninges قطع
ملاحظة: خطوات 5،1-5،2 هي التي يتعين القيام بها داخل غطاء تدفق الصفحي أفقي باستخدام مجهر تشريح.
- تغطية القطع مع 1-2 العقيمة 15 ملم coverslips دائرية لكل بئر.
- اضغط لأسفل بحزم مع ملقط لضمان القطع ولمس الجزء السفلي من لوحة. وهذا يسمح الحجز على قطع الأنسجة إلى قاع البئر.
- وضع لوحة 6 جيدا إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
صيانة الثقافة 6. خلية
ملاحظة: خطوات 6،1-6،3 هي التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. التعامل مع أطباق الثقافة مع الرعاية كما يجب coverslips لا تحرك وطرد السحايا قطعة.
- بعد 2 أيام في الثقافة، إضافة 1 مل إضافية من وسائط النمو السحايا جديدة إلى كل بئر.
- في يوم 7، ونضح بعناية وسائل الإعلام وإضافة 2 مل من وسائط جديدة إلى كل بئر.
- بعد يوم 9، ومواصلة تغيير وسائط النمو كلاليوم الآخر حتى يصبح ثقافة متموجة.
7. الركض
ملاحظة: جميع الخطوات التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. مرة واحدة وقد هاجر الليفية السحائية من قطعة نسيج السحائي وتبدأ في النمو نحو حواف سفينة الثقافة، وتوسيع الخلايا الليفية سحائي في صحن الثقافة أكبر.
- قبل البدء في الركض، ومعطف الطبق الثقافة مع 1٪ الجيلاتين مدة 15-30 دقيقة.
- وسائل الإعلام نضح من صحن 6 جيدا وغسل الخلايا مع 2 مل برنامج تلفزيوني.
- إضافة 1 مل من التربسين / EDTA إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة. وليس من الضروري لإزالة زلات غطاء أو الأنسجة السحائية لهذه الخطوة.
- عندما الخلايا تقريب وتبدأ في فصل، إضافة 2 مل من وسائط الثقافة.
- خلايا ماصة صعودا وهبوطا لتعطيل تماما عن كتل ونقل حل الخلية إلى صحن الثقافة أكبر.
- استخدام نسبة 1: 3-1: 4 الجمع بين الخلايا من ثلاثة أطباق 6 جيدا فيإلى صحن ثقافة T75 واحد.
- بمجرد متموجة الخلايا الليفية السحائي في قوارير ثقافة T75، ويعرض للتريبسين الخلايا، وcryopreserve في وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد في الخلايا 1x10 6 / مل في القارورة. واحد T75 الثقافة قارورة مع الخلايا الليفية السحائية متكدسة يحتوي على حوالي 5-7 مليون خلية.
8. توصيف الخلايا الليفية السحائية التي كتبها المناعية
ملاحظة: قبل البدء في إجراء وإعداد حل لامتصاص العرق 4٪ و 5٪ طبيعي مصل الماعز في برنامج تلفزيوني (عازلة تمنع)، 0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني (العازلة permeabilization)، حلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية، و1 ميكروغرام / مل من هويشت 33342 المخفف في برنامج تلفزيوني من 10 ملغ الأسهم / مل.
- البذور 15،000 إلى 30،000 الخلايا الليفية السحائية في 8 جيدا الشرائح الغرفة المغلفة مع الجيلاتين 0.1٪.
- بعد 24 ساعة عندما يتم إرفاق الخلايا، إصلاح الخلايا في 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ لكل بئر لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الآبار 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
- Permeabilize الخلايا مع 150 ميكرولتر من 0.3٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الآبار 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 200 ميكرولتر عرقلة الحل (PBS + 5٪ مصل الماعز العادي) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح عرقلة الحل، وإضافة 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المطلوبة مخففة في عرقلة الحل. لالمزدوج تلطيخ، وإعداد التخفيفات عمل الأجسام المضادة الأولية في أنابيب الطرد المركزي منفصلة على الجليد على النحو التالي:
- إعداد 1: 300 التخفيف من معاداة فيبرونكتين] + 1: 200 التخفيف من مكافحة nestin في عرقلة الحل. إعداد 1: 250 التخفيف من مكافحة SERPINH1 + 1: 1000 تخفيف من مكافحة TUJ1 في عرقلة الحل. إعداد 1: 250 التخفيف من مكافحة SERPINH1 + 1: 100 التخفيف من مكافحة SOX2 في عرقلة الحل
- احتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- غسل الآبار 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إعداد العمل 1: 400 التخفيف من fluorescently المسمى الأجسام المضادة الثانوية الماعز المضادة للأرنب (الأخضر؛ م ت / م 2 2 590/617 نانومتر) في حل الحجب وإضافة 100 ميكرولتر إلى كل بئر. احتضان لمدة 1 ساعة، في الظلام، في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل الآبار مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 100 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل هويشت 33342 (الأزرق؛ م ت / م 2 358/461 نانومتر) حل كل بئر واحتضان في الظلام لمدة 3 دقائق. غسل الآبار 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X، وترك في برنامج تلفزيوني 1X غسل النهائي في البئر، وتغطية الشريحة مع رقائق الألومنيوم.
- تحليل الخلايا تحت المجهر الفلورسنت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عندما كان بروتوكول السحايا الرقيقة المعالجة ناجحة، ويلاحظ نمو الخلايا الليفية السحائية لأول مرة بعد 3-9 أيام تشريح، على الرغم من أن هذا يمكن أن تعتمد على طول فترة ما بعد الوفاة للدماغ. يوضح الشكل 1 الثقافات الليفية السحائية من أربع جهات مانحة مختلفة. ويبين الشكل 1A قطعة السحايا الرقيقة التي عقدت بنسبة زلة غطاء زجاجي (خط مائل غامق) وثمرة الليفية في جميع أنحاء الأنسجة أربعة أيام بعد المعالجة من متبرع البالغ من العمر 88 عاما مع 10 ساعة 20 دقيقة فترة ما بعد الوفاة. ويبين الشكل 1B متفرق الليفية ثمرة سبعة أيام بعد المعالجة من متبرع البالغ من العمر 70 عاما و 11 ساعة و 45 دقيقة فترة ما بعد الوفاة. ويبين الشكل 1C الليفية ثمرة 13 يوما بعد تشريح من متبرع البالغ من العمر 88 عاما و 24 ساعة فترة ما بعد الوفاة. ويبين الشكل 1D ثقافة متكدسة التي كانت passaged إلى VESS T75ايل وخلايا يمكن cryopreserved في هذه المرحلة.
الليفية السحائية هي القطبين أو متعدد الأقطاب، وقد ممدود أو الأشكال غير النظامية (الشكل 2). فهي تتميز التعبير عن بروتين سكري فبرونيكتين وعلامة الليفية SERPINH التي يتم ترجمتها إلى الشبكة الإندوبلازمية (أرقام 2A-2C). الليفية السحائية ليست المناعية تفاعلية للعامل النسخ SRY (الجنس تحديد منطقة Y) بوكس 2 (SOX2) وهي علامة للحصول على الخلايا الجذعية غير المتمايزة (الشكل 2A). ومع ذلك، مجموعة فرعية من الخلايا الليفية السحايا الرقيقة إيجابية لنوع السادس nestin خيوط وسيطة، والعصبية الخلايا الجذعية علامة (الشكل 2B)، وفئة الخلايا العصبية المحددة الثالث بيتا تويولين (TUJ1) (الشكل 2C).
شكل 1.أمثلة على ثمرة من الخلايا الليفية السحائية من أربع جهات مانحة مختلفة. أ) يتم عقد قطعة نسيج السحايا الرقيقة بنسبة زلة غطاء زجاجي (خط مائل غامق) وثمرة الليفية في جميع أنحاء الأنسجة لوحظ بعد أربعة أيام من المعالجة من متبرع البالغ من العمر 88 عاما مع 10 ساعة 20 دقيقة فترة ما بعد الوفاة. ب) الخلايا الليفية متناثر ثمرة سبعة أيام بعد تجهيز من متبرع البالغ من العمر 70 عاما و 11 ساعة و 45 دقيقة فترة ما بعد الوفاة. C) السحائي ثمرة الليفية بعد 13 يوما تشريح من متبرع البالغ من العمر 88 عاما و 24 ساعة فترة ما بعد الوفاة. D) متكدسة ثقافة الخلايا الليفية السحائية passaged في وعاء T75. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. Immunost aining لالسحايا، الخلايا الجذعية، الخلايا الجذعية العصبية، وعلامات العصبية. أ) تلطيخ المناعي للعلامات الليفية SERPINH1 (الخضراء) والخلايا الجذعية علامة SOX2 (الحمراء). وأعرب عن SERPINH1 في كل نواة الخلية فرزها. لم يتم الكشف عن الخلايا الجذعية علامة SOX2 في هذه الثقافة السحايا الرقيقة. B) تلطيخ المناعي لالسحايا محددة علامة فبرونيكتين (الخضراء) والعصبية الخلايا الجذعية علامة NESTIN (الحمراء). كانت 52.1٪ من نوى الخلايا عدها إيجابية لكلا NESTIN وفيبرونكتين]. C) تلطيخ المناعي للSERPINH1 (الخضراء) وTUJ1 علامة العصبية (الحمراء). كانت 6.9٪ من نوى عدها إيجابية لSERPINH1 وTUJ1. تم تحديد البيانات عدد خلايا باستخدام دليل خلية مكافحة متعدد أداة التحديد على يماغيج. تم تقييم الصور الملون واحدة عن طريق حساب عدد من الخلايا دابي إيجابي مقارنة مع عدد الخلايا الإيجابية لكل علامة في النسب.نحيف "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| يوم | نتائج متوقعة | |||||
| 3-9 | ثمرة من الخلايا الليفية السحائية الأولى. | |||||
| 7-18 | توسيع الخلايا الليفية السحائية، وثقافة تصبح أكثر كثافة. تغيير وسائل الاعلام من 2 مل كل يوم. | |||||
| 18-25 | لوحة 6 جيدا تصبح متموجة، مرة واحدة الخلايا الليفية السحائية هي متكدسة الجمع بين ثلاثة آبار في قارورة ثقافة T75 (مرور في 1: 3-1: 4). | |||||
| 26-45 | واحدة متموجة النتائج ثقافة T75 قارورة في 5-7 مليون خلية. Cryopreserve الليفية السحائية عند 1 مليون خلية / قارورة. | |||||
علامة التبويبلو 1: الجدول الزمني للثمرة الخلوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول بروتوكول بسيط وقوي لاستخلاص الثقافة الليفية السحائية من السحايا الرقيقة تشريح الإنسان جمعها بالتزامن مع هبة الدماغ. هناك عدد قليل جدا من أوصاف بروتوكولات لاستخلاص مزارع الخلايا من المواد البشرية بعد الوفاة. تصف دراستين الجلد المستمدة الثقافات الليفية 7، 8، 9، تصف دراسة واحدة عينات الجافية 10، وآخر يصف غير cryopreserved عينات الذرة المجمدة 11.
ونحن نستعد لوحين 6 جيدا مع 2-3 قطعة نسيج (حوالي 3 ملم × 3 مم) في كل بئر لضمان نمو كافية والتوسع قبل الحفظ بالتبريد. ومن الأهمية بمكان أن السحايا القطع هي تعلق على طبق الثقافة عن طريق الضغط لطيف العقيمة الغطاء الزجاجي الانزلاق على قطعة نسيج لعقد لهم في المكان. دون ساترة، السحايا قطع لنر نعلق على الجزء السفلي من صحن الثقافة. ويلاحظ ثمرة ناجحة فقط عندما تكون قطعة نسيج على اتصال مباشر مع الجزء السفلي من البلاستيك. إذا تطفو قطعة نسيج في وسائل الإعلام والثقافة، ويتم احترام أي ثمرة الخلية من الأنسجة. يجب أن يتم تنفيذ هذا مع حوالي 500 ميكرولتر من نمو وسائل الإعلام لعدم تجفيف العينات وثم تضيف ما يصل إلى 1 مل من وسائط النمو إلى السفينة. وليس من الضروري لمواصلة استخدام السيليكون لعقد زلات الغطاء في مكانه.
إذا كان القطع أصغر من 3 ملم × 3 ملم، وثمرة أبطأ، وفي بعض الحالات يمكن أن تنشأ أي الثقافات متموجة. فمن الأهمية بمكان أن لا تنمو الخلايا ضئيل للغاية، ونحن نوصي نسبة الانقسام 1: 3-1: 4. الآبار الصغيرة الفردية تسمح للتلوث محتمل أفضل إدارة. آبار ويمكن تغذية بشكل فردي ويجب تغيير ماصات بين الآبار.
لقد المستمدة بنجاح الليفية السحائية من 9 عينات بعد الوفاة مع بوstmortem الفاصلة بين 10-24 ساعة. وكانت الجهات المانحة ما بين 70 و 88 سنة من العمر ولها فترات مرض الشلل الرعاش بين 8-31 سنوات. نلاحظ أن الأنسجة مع فترة ما بعد الوفاة تعد تستغرق وقتا أطول قبل الخلايا الأولى تنمو خارج (ما يصل إلى 9 أيام). في عينات مع أقصر فترة ما بعد الوفاة، نلاحظ نمو في أقرب وقت بعد 3 أيام التحضير. نحن لم احظت وجود اختلاف في النمو على أساس السن من الجهات المانحة، ولكن كان لدينا جهات مانحة فقط> 70 عاما.
أهمية الطريقة هي اشتقاق من ثقافة الخلية الأولية لمرض الاعصاب متفرقة مثل مرض باركنسون، والتي لا يمكن إلا أن حاليا يتم تأكيد في تشريح 12، 13، 14 منذ هناك تحديد أي تماما الخصائص السريرية، وتقنيات التصوير أو المؤشرات الحيوية التي يمكن أن توفر تشخيص واضح خلال الحياة 15. لدينا سابقا ديفيloped بروتوكول لاشتقاق الخلايا الليفية من خزعات الجلد في المقام الأول عن الحالات المؤكدة وراثيا لمرض الشلل الرعاش 16 التي سمحت لنا لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها ودراسة آليات المرض 17، 18، ولكن هذا البروتوكول الجديد سيكون حاسما لمقارنة مباشرة تغييرات عصبية مرضية مع هذه النتائج في المختبر لمرض باركنسون متفرقة. على حد علمنا، هذا هو البروتوكول الأول اشتقاق الخلايا الليفية السحائية من السحايا الرقيقة الإنسان بعد الوفاة.
ويمكن مباشرة الثقافات الليفية السحائية أن تستخدم لدراسة الآليات الجزيئية المتعلقة بأمراض أو الإصابة أو كمصدر لإعادة البرمجة النووية إلى الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها أو التحويل المباشر إلى الثقافات العصبية كنماذج قبل السريرية المتقدمة لمرض باركنسون متفرقة أو غيرها من اضطرابات الاعصاب 19. هذه هو جين تاوتقدم رجل النماذج المستمدة من المريض الأساس وتسريع التقدم في الطب الشخصي والتجدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1,000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
