इस प्रोटोकॉल वयस्क और वृद्ध लोगों के कंकाल की मांसपेशी से अलगाव और myoblast पूर्वज कोशिकाओं की संस्कृति का एक मजबूत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सरल विधि का वर्णन है। यहां इस्तेमाल की मांसपेशियों पैर और पैर की मांसपेशियों में शामिल हैं। यह दृष्टिकोण कार्यात्मक अध्ययन के लिए प्राथमिक myoblasts की एक समृद्ध आबादी के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है।
कंकाल की मांसपेशी homeostasis मांसपेशियों की वृद्धि (अतिवृद्धि), शोष और उत्थान पर निर्भर करता है। उम्र बढ़ने के दौरान और कई रोगों में, मांसपेशी बर्बाद होता है। मांसपेशियों और समारोह के नुकसान की मांसपेशी फाइबर प्रकार शोष, फाइबर प्रकार स्विचिंग, दोषपूर्ण मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं, मांसपेशियों में स्टेम सेल, और अन्य pathophysiological प्रक्रियाओं की शिथिलता के साथ जुड़े उत्थान के साथ जुड़ा हुआ है। इन परिवर्तनों intracellular में परिवर्तन के साथ ही स्थानीय और प्रणालीगत niches के साथ जुड़े रहे हैं। मांसपेशियों में उम्र बढ़ने के सबसे अधिक इस्तेमाल किया कृंतक मॉडल के अलावा, मांसपेशियों homeostasis अध्ययन करने के लिए एक की जरूरत है और मानव मॉडल है, जो नैतिक प्रभाव के कारण, इन विट्रो संस्कृतियों का मुख्य रूप से मिलकर बनता है का उपयोग कर बर्बाद कर रहे। मानव Myogenic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (MPCs) और myogenesis में प्राथमिक myoblasts के व्यापक उपयोग के बावजूद, वहाँ आणविक तंत्र उम्र जुड़े मुसलमानों के विभिन्न पहलुओं को विनियमित अध्ययन करने के लिए मानव प्राथमिक myoblast और myotube संस्कृतियों के प्रयोग पर सीमित डेटा हैCLE बर्बाद, उम्र बढ़ने कृंतक मांसपेशियों में प्रस्तावित के तंत्र के सत्यापन में सहायता। मानव MPCs, प्राथमिक myoblasts और myotubes वयस्क और वृद्ध लोगों से अलग, का उपयोग मांसपेशियों की वृद्धि, शोष और उत्थान के साथ जुड़े प्रक्रियाओं के आणविक तंत्र की एक physiologically प्रासंगिक मॉडल उपलब्ध कराता है। myoblasts और myotubes enzymatic पाचन का उपयोग करते हुए मानव मांसपेशियों के नमूनों से – यहाँ हम विस्तार से अलगाव और मानव MPCs और उनकी संतान के रखरखाव के लिए एक मजबूत, सस्ती, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन। इसके अलावा, हम बीतने संख्या, जिस पर वयस्क और वृद्ध लोगों से प्राथमिक myoblasts इन विट्रो संस्कृति में वार्धक्य गुजरना निर्धारित किया है। अंत में, हम इन myoblasts transfect करने की क्षमता और उनके proliferative और भेदभाव क्षमता विशेषताएँ और myogenesis और मांसपेशियों में इन विट्रो में बर्बाद कर के आणविक तंत्र के कार्यात्मक अध्ययन के प्रदर्शन के लिए उनकी उपयुक्तता का प्रस्ताव करने की क्षमता दिखा। </p>
दोष में कंकाल की मांसपेशियों और समारोह के परिणामों के रोग और उम्र से संबंधित प्रगतिशील हानि, आयु वर्ग के लोगों के जीवन की गुणवत्ता में शक्ति और कमी में गिरावट। कंकाल की मांसपेशी लगभग 40% शरीर द्रव्यमान 1 के लिए खातों। वसा और फाइब्रोसिस की घुसपैठ के कारण अलग-अलग myofibers और मांसपेशियों में गुणवत्ता की कमी के प्रगतिशील शोष उम्र बढ़ने और रोग, के दौरान होता है 1, 2, 3, 4, 5, 6। हाल ही में, यह प्रस्ताव किया गया है कि कंकाल की मांसपेशी की उम्र बढ़ने में प्रजातियों विशिष्ट मतभेद होते हैं, विशेष रूप से उस मांसपेशी फाइबर नुकसान कृन्तकों में होने वाली है, मनुष्य 7 में नहीं हो सकता है। फिर भी, वृद्ध स्तनधारियों की शेष मांसपेशी फाइबर की क्षति और बिगड़ा उत्थान के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता की विशेषता है <supवर्ग = "xref"> 8। वयस्क मांसपेशियों की मरम्मत और रखरखाव के लिए उपग्रह कोशिकाओं 9, 10 द्वारा मध्यस्थता है। मांसपेशी की चोट और अन्य प्रासंगिक संकेतों पर, उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय और पैदा हो जाते हैं। कोशिकाओं के एक सबसेट मौन राज्य के लिए रिटर्न और शेष myoblasts (Myogenic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं – MPCs) में प्रगति। ये मौजूदा myofiber 11 की मरम्मत के लिए योगदान करते हैं। उपग्रह कोशिकाओं की कार्यक्षमता पेशी उत्थान की सफलता और उम्र बढ़ने प्रदर्शन किया गया है 12, 13, 14, 15 के साथ उपग्रह सेल उपलब्धता में परिवर्तन निर्धारित करता है। इसके अलावा, पुराने मानव और मूषक की पेशी से उपग्रह कोशिकाओं एक ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफ़ाइल स्विच दिखाने के लिए और पुनर्योजी क्षमता को कम कर 16, 17, </sup> 18, 19। वर्ष चूहों और इंसानों से पेशी के सैटेलाइट कोशिकाओं को भी अपने सीमित कार्यक्षमता 20 में जिसके परिणामस्वरूप वार्धक्य गुजरना करने के लिए दिखाया गया है।
सबसे स्थापित सेल लाइन पेशी homeostasis के अध्ययन को सक्षम murine C2C12 सेल लाइन 21 है। अध्ययन का एक महत्वपूर्ण राशि भी murine प्राथमिक myoblasts 22 का इस्तेमाल किया है। इन संस्कृतियों murine और कशेरुकी myogenesis के रूप में अच्छी तरह से मांसपेशियों उत्थान, myotube / myofiber शोष, और मांसपेशियों की बीमारी के दौरान होने वाली और 23, 24, 25, 26 की उम्र बढ़ने अतिवृद्धि प्रक्रियाओं की एक महत्वपूर्ण समझ के लिए नेतृत्व किया है। हाल ही में, कई समूहों myogenesis और मांसपेशियों में उम्र बढ़ने के अध्ययन के लिए मानव प्राथमिक myoblasts का उपयोग कर का वर्णन किया है। हालांकि, वहाँ रैगर के साथ आम सहमति की कमी हैवयस्क और वृद्ध मनुष्य 27, 28, 29, 30, 31 की मांसपेशियों से अलग प्राथमिक myoblasts के बीच अंतर करने के लिए डी एस। प्रणालीगत और स्थानीय पर्यावरण विकास के दौरान होने वाली है, बुढ़ापे और बीमारी 6, 32, 33, 34, में विशेषता मतभेदों के बावजूद इन विट्रो myoblast और myotube संस्कृतियों मांसपेशियों के विकास, विकास और शोष के साथ जुड़े आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए सबसे सुलभ उपकरण रहते हैं। इसके अतिरिक्त, इन अध्ययनों से न केवल एक मजबूत प्रदान करते हैं, लेकिन यह भी विट्रो उपकरण में एक अपेक्षाकृत जल्दी, सस्ती और उच्च throughput। इसके अलावा, मानव मांसपेशियों के अध्ययन के साथ जुड़े नैतिक प्रभाव कार्यात्मक जीन अभिव्यक्ति की जोड़तोड़ से जुड़े प्रयोगों के लिए इसका मतलब यह <em> इन विट्रो मानव myoblast और myotube संस्कृतियों एकमात्र विकल्प हड्डीवाला मॉडल जीवों के लिए उपलब्ध रहते हैं।
यहाँ, हम प्राथमिक myoblasts, या MPCs की मजबूत, सस्ती, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने अलगाव के लिए एक सरल प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, वयस्क और वृद्ध लोगों की पेशी से दिखाने के लिए और इन विट्रो संस्कृति (चित्रा 1) के मानकीकृत की स्थिति का वर्णन है। पेशी से प्राथमिक संस्कृतियों आमतौर पर myoblasts के अलावा fibroblasts शामिल हैं, तो हम बेहतर पवित्रता और प्राथमिक myoblasts की गुणवत्ता में लक्ष्य एक Preplating कदम सलाह देते हैं। संक्षेप में, हम एक प्रोटोकॉल कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने अलगाव, संस्कृति और वयस्क और वृद्ध लोगों के कंकाल की मांसपेशी से समृद्ध और कार्यात्मक MPCs / प्राथमिक myoblasts के कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है की स्थापना की है।
यहाँ, हम प्रसारिणी digitorium ब्रेविस, tibialis पूर्वकाल या फुसलाकर halluces मांसपेशियों से वयस्क और वृद्ध मनुष्यों से मांसपेशी कोशिकाओं पूर्वज / प्राथमिक myoblasts अलग-थलग करने का एक सरल, मजबूत, सस्ती, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कुशल तरीका मौजूद है। इस प्रोटोकॉल वयस्क और वृद्ध मनुष्यों से मानव प्राथमिक myoblasts का उपयोग अध्ययन की अनुमति देने के लिए करना है, खासकर जब इस तरह के FACS- या एमएसीएस-छँटाई के रूप में और अधिक परिष्कृत तरीकों, संभव या व्यावहारिक नहीं नहीं कर रहे हैं।
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत अलगाव विधि लगभग 2 घंटे लगते हैं। मांसपेशियों में अलगाव के दौरान, मांसपेशियों आदेश संक्रमण से बचने के लिए 70% इथेनॉल में धोया गया था। मांसपेशियों की हदबंदी enzymatic करने से पहले, यह छोटा लेकिन दिखाई टुकड़ों में मांसपेशियों में कटौती, और बहुत अधिक नख़रेबाज़ से कोशिका क्षति से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। myofibers की हदबंदी और उपग्रह कोशिकाओं और myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं की रिहाई में पाचन का परिणाम है। कंकाल की मांसपेशी के ~ 20 मिलीग्राम, एक 60 मिमी के लिए हमारे मामले में(20 सेमी 2) पेट्री डिश कोशिकाओं की कटाई के लिए सबसे उपयुक्त सतह क्षेत्र था। एक बड़ा सतह पर चढ़ाया कोशिकाओं, कम प्रसार से पता चला है, जबकि कोशिकाओं चढ़ाया पर एक छोटे सतह कोशिका मृत्यु और समूहन वृद्धि हुई दिखाया।
अलगाव पर, कोशिकाओं सुसंस्कृत थे और laminin से ढके प्लेटों पर विस्तार किया। के गैर लेपित सतहों उपयोग अलगाव की सफलता में कमी हो जाती थी। इस कारण से, कोशिकाओं अधिमानतः सीधे अलगाव के बाद एक पूर्व लेपित सतह पर काटा जा सकता है। Fibroblasts समृद्ध संस्कृतियों myoblasts व्युत्पन्न कोशिकाओं के बजाय प्रबल कोशिकाओं को सीधे अलगाव के बाद एक गैर लेपित सतह पर काटा जाता है, तो होगा। इसके अलावा laminin से, इस तरह के Matrigel और कोलेजन आधारित अभिकर्मकों के रूप में अन्य सेल लगाव समाधान के उपयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कोटिंग के समाधान के विकास के कारकों और अन्य यौगिकों कि सेल के विकास को बढ़ावा देंगे शामिल हो सकते हैं, लेकिन इन सेल व्यवहार और इसलिए प्रयोगात्मक परिणामों को बदल सकता है। मेंहमारे अनुभव, 10 माइक्रोग्राम / एमएल laminin इष्टतम एकाग्रता और उपग्रह कोशिकाओं और myoblast लगाव और प्रसार के लिए उचित कोटिंग अभिकर्मक के रूप में यह किसी भी वृद्धि कारक या अन्य पूरक का अभाव है। इसके अलावा, laminin आधारी पटल, सीधे sarcolemma, जो कंकाल की मांसपेशी फाइबर के माध्यम से उपग्रह सेल लगाव और प्रवास में एक महत्वपूर्ण समारोह निभाता से जुड़े में स्वाभाविक रूप से मौजूद है।
संस्कृति मीडिया की खुराक भी प्राथमिक myoblast के व्यवहार पर एक हानिकारक प्रभाव हो सकता है। ऐसे FGFs या IGFs के रूप में उदाहरण के विकास का पहलू समूहों के लिए, FGF -2 दोनों mitogenic और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु प्रतिक्रिया 31 को नियंत्रित करने के साथ, प्राथमिक myoblast संस्कृतियों पर pleiotropic प्रभाव है। इसलिए यह कड़ाई से संस्कृति की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से, क्योंकि वयस्क और वृद्ध लोगों की मांसपेशियों से अलग प्राथमिक myoblasts के व्यवहार में अंतर पवित्रता ओ के कारण बहुत ही होने की संभावना हैसंस्कृतियों और लंबी अवधि संस्कृतियों 35 के दौरान संस्कृति में myoblasts घोषणाओं fibroblasts की संभावना च। हम आदेश fibroblasts के साथ संस्कृतियों के संक्रमण को कम करने के लिए एक गैर-लेपित सतह पर पहली बंटवारे के दौरान कोशिकाओं के 1 घंटे पूर्व चढ़ाना इस्तेमाल किया है।
विधि का वर्णन हम दोनों वयस्क और वृद्ध मनुष्य की मांसपेशियों से myogenic पूर्वज कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयुक्त है। के रूप में myogenic कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत ने संकेत (Myod अभिव्यक्ति और myogenic गुण आंकड़े 1 में MF20 immunostaining द्वारा कल्पना और 2) और प्रक्रियाओं के कार्यात्मक अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता पृथक सेल कोशिकाओं के एक प्रतिनिधि myogenic आबादी के होते हैं पेशी homeostasis के साथ जुड़े।
पिछले अध्ययनों से अलगाव और गुण में मतभेद, या उसके अभाव, मानव प्राथमिक myoblasts से विशेषता हैवयस्क और वृद्ध लोगों 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 से 6, 37, 38। बुढ़ापे की और / या गैर कार्यात्मक मानव MPCs के अस्तित्व 6 प्रदर्शन किया गया है, 20, 22। हालांकि, हौसले से अलग मानव MPCs के व्यवहार में कोई अंतर भी 27 दिखाया गया है। हमारी प्रोटोकॉल प्राथमिक myoblasts, इस तरह के आयु वर्ग के लोगों की मांसपेशियों से अलग प्राथमिक myoblasts की proliferative संभावित या वार्धक्य को कम कर के रूप में है कि कम से कम आंशिक रूप से उनके phenotype बनाए रखने के अलगाव के लिए अनुमति देता है और इनमें से उपयोग की अनुमतिउम्र बढ़ने के दौरान मांसपेशियों 22 homeostasis के आणविक तंत्र के कार्यात्मक अध्ययन के लिए कोशिकाओं।
प्राथमिक विधि यहाँ वर्णित का उपयोग कर अलग myoblasts myogenic भेदभाव के अध्ययन के लिए ही नहीं बल्कि इस तरह के उम्र बढ़ने के दौरान मानव myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं में होने वाली जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के रूप में intracellular परिवर्तन, जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, परिवर्तन है कि लंबे समय तक पूर्व vivo संस्कृति के दौरान कोशिकाओं में पाए जाते हैं जब उम्र बढ़ने के दौरान होने वाली प्ररूपी और genotypic परिवर्तन का विश्लेषण विचार किया जाना चाहिए। हम इस उद्देश्य के लिए हौसले से अलग कक्षों का उपयोग करना चाहिये।
इसके अलावा, प्राथमिक myoblast संस्कृति विधि यहाँ वर्णित मजबूत इन विट्रो कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है, विस्तार और मानव प्राथमिक myoblasts की अपेक्षाकृत लंबी अवधि संस्कृति के लिए अनुमति देता है। हम पहले से पता चला है कि myogenic पूर्वज हमारे विधि का उपयोग कर अलग कोशिकाओं दोनों अभिव्यक्ति की रूपरेखा और फू के लिए इस्तेमाल किया जा सकतामांसपेशियों में उम्र बढ़ने के साथ जुड़े 22 प्रक्रियाओं के nctional अध्ययन करता है। इस विधि को भी वयस्क और पुराने मूषक की मांसपेशियों के लिए लागू है और है कि उम्र बढ़ने और कार्यात्मक अध्ययन 22 के दौरान आनुवंशिक और epigenetic परिवर्तन की रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता myoblasts की एक समृद्ध संस्कृति के अलगाव के लिए अनुमति देता है। इस विधि की सीमाओं का उपयोग करते हैं, कुछ हद तक शामिल हैं, उपग्रह कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी के बजाय कोशिकाओं की मिश्रित आबादी है, जो और अधिक परिष्कृत प्रकाशित तरीकों 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42 का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है 43।
हम वयस्क और वृद्ध से प्राथमिक myoblasts कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक, सरल, सस्ती, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रस्तुतमनुष्य। हमारे अनुभव में, (उपग्रह कोशिकाओं से हल FACS ऐसे MACS- या के रूप में) अलगाव और मानव प्राथमिक myoblasts की संस्कृति के उपलब्ध है, और अधिक परिष्कृत तरीके ऐसी कोशिकाओं में transcriptomic या प्रोटिओमिक परिवर्तनों की रूपरेखा के रूप में अध्ययन के कुछ प्रकार, के लिए आदर्श होते हैं। हालांकि, इन तरीकों महंगे हैं, विशेषज्ञता के कम से कम कुछ स्तर की आवश्यकता होती है, और शुद्ध प्राथमिक myoblast संस्कृतियों और myoblasts overgrowing fibroblasts की कम proliferative दर की वजह से मुश्किल साबित हो सकता है।
हम एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल है कि कार्यात्मक अध्ययन में उपयोग के लिए सरल अलगाव और मानव प्राथमिक myoblasts की संस्कृति परमिट प्रस्तुत करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम laminin 42 के उपयोग और सीमित एक सफल संस्कृति 44 के लिए महत्वपूर्ण कारक के रूप में bFGF के उपयोग का प्रस्ताव है। हम भी जब कोशिकाओं को विभाजित करने और पारित होने के पहले 45 में से एक पूर्व चढ़ाना कदम centrifugation द्वारा उत्पन्न तनाव से बचने का प्रस्ताव। संक्षेप में, हम हैअलगाव और वयस्क और वृद्ध मनुष्य की मांसपेशियों को भी मूषक की मांसपेशियों के लिए लागू है और अभिव्यक्ति और मांसपेशियों homeostasis के कार्यात्मक अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है कि प्राथमिक से myoblasts / MPCs की संस्कृति के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल अनुकूलित।
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), the MRC and Arthritis Research UK as part of the MRC – Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) and the Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). The authors would like to thank Dr Dada Pisconti (University of Liverpool) for her expertise and advice in the isolation of muscle progenitor cells.
60mm Petri dishes | Greiner Bio One | 628160 | Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS. |
Cell culture plates (6 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3516 | Corning Costar cell culture plates. 6 well, flat bottom (Individually wrapped) . |
Cell culture plates (12 wells) | Greiner bio-one | 657 160 | Cellstar Cell culture Multiwell Plates. |
Culture flasks | Greiner Bio One | 690175 (25cm2); 658175 (75cm2). | Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks. |
Standard Disposable Scalpel | Granton | 91310 | Sterile stainless steel blade, pattern: 10. |
Pipettes | Greiner bio-one | 606 180 (5 ml); 607 180 (10 ml); 760 180 (25 ml) | Cellstar Serological Pipettes. |
Pasteur plastic pipettes | Starlab | E1414-0311 | 3.0ml Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped. |
Syringe | BD | 300613 | 20 mL BD eccentric tip syringe. |
0.2 µm filters | Gilson | ALG422A | Sterile Syringe Filters CA 0.2um 33mm Pk50. |
Cell strainers | Fisher Scientific | 11597522 | Cell culture strainer sterile individually packed 70µm polypropylene. |
Collagenase D | Roche | 11088882001 | Collagenase D; ctivity: >0.15 U/mg |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 units/mg solid. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis |
Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1mg/mL. |
DMEM-high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose. With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate. |
F-12 media | Gibco | 21765029 | Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine. |
FGF-b | PetroTech | 100-18B | Recombinant Human Fibroblast Growth Factor-basic. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Fetal Bovine Serum. |
Horse serum (HS) | Sigma-Aldrich | H1270 | Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered. |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered. |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered. |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red. |
DPBS (cell culture) | Sigma-Aldrich | D8537 | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. |
PBS (immunostaining) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Phosphate buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4). |
Methanol | Fisher | M/4000/PC17 | Methanol Analytical Reagent Grade |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 for molecular biology. |
anti-MF 20 antibody | DSHB | MF20-c 2ea 211 µg/ml. | MYH1E (MF 20) Mouse mAb. |
anti-MyoD antibody | Cell Signaling Technology | 13812P | MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb. |
anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | Rabbit mAb to Ki67 [SP6]. |
Anti-mouse 488 secondary antibody | Invitrogen | A-11029 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
Anti-rabbit 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
DAPI | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | Senescence β-Galactosidase Staining kit. |
DMSO | Sigma-Aldrich | 41639 | Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC). |
Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A8097 | Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O. |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Lipofectamine 2000 Transfection Reagent |
Scramble control for transfections | Qiagen | 1027271 | miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol) |
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay | Qiagen | 218300 | Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor | Qiagen | 219300 | Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Megafuge 2.0 R Centrifuge | Heraeus | 75003085 | n/a |
Centrifuge rotor | Heraeus | 3360 | Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm. |
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System | Nikon | n/a | Eyepieces: CFI 10x/22; Total magnification: 100x (MF20, Live/dead and Ki67). |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10x/25; Total magnification: 100x (Senescence β-Galactosidase Staining). |
Axiovert 25 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: E-PL 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope | Nikon | n/a | Eyepiece: CFWN 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | Hydromount |