Summary
Dit protocol beschrijft een robuuste, reproduceerbare en eenvoudige methode van isolatie en de cultuur van myoblast stamcellen uit de skeletspieren van volwassen en ouderen. De spieren die hier gebruikt behoren voet- en beenspieren. Deze aanpak maakt het isoleren van een verrijkte populatie van primaire myoblasten voor functionele studies.
Abstract
Skeletspieren homeostase hangt af van de spiergroei (hypertrofie), atrofie en regeneratie. Tijdens veroudering en in een aantal ziekten, spieratrofie optreedt. Verlies van spiermassa en functie wordt geassocieerd met type spiervezels atrofie, soort vezel omschakeling, slecht werkende spier regeneratie geassocieerd met disfunctie van satelliet-cellen, spier stamcellen, en andere pathofysiologische processen. Deze veranderingen zijn geassocieerd met veranderingen in intracellulaire evenals lokale en systemische niches. Naast meest gebruikte diermodellen voor veroudering spier, er behoefte spier homeostase bestuderen en verspillen met menselijke modellen, die vanwege ethische implicaties bestaan voornamelijk uit in vitro culturen. Ondanks het brede gebruik van menselijke Myogene Progenitor Cells (MTR) en primaire myoblasten in myogenesis, is er beperkte gegevens over het gebruik van menselijke primaire myoblasten en myotube culturen te bestuderen de moleculaire mechanismen tot regeling van de verschillende aspecten van het ouder worden muskel wasting, hulp bij de validatie van mechanismen van veroudering voorgesteld in knaagdieren spier. Het gebruik van menselijke mediterrane partnerlanden, primaire myoblasten en myotubes geïsoleerd van volwassen en oude mensen, zorgt voor een fysiologisch relevante model van de moleculaire mechanismen van processen die verband houden met de spiergroei, atrofie en regeneratie. Hier beschrijven we in detail een robuuste, goedkope, reproduceerbare en efficiënt protocol voor de isolatie en het onderhoud van menselijke MTR en hun nageslacht - myoblasten en myotubes van menselijk spierweefsel monsters met behulp van enzymatische digestie. Verder hebben we de passagegetal waarbij primaire myoblasten van volwassenen en ouderen ondergaan senescentie in een in vitro kweek bepaald. Tenslotte tonen we de mogelijkheid om deze myoblasten transfecteren en de mogelijkheid om hun proliferatieve en differentiatiecapaciteit karakteriseren en stellen hun geschiktheid voor het uitvoeren van functionele studies van de moleculaire mechanismen van myogenese en spieratrofie in vitro.
Introduction
Ziekte- en leeftijdsgebonden progressief verlies van spiermassa en functie resulteert in zwakheid, daling van de sterkte en de afname van de kwaliteit van leven van ouderen. Skeletspieren goed voor ongeveer 40% body mass 1. Tijdens veroudering en ziekte, progressieve atrofie van individuele spiervezels en vermindering van spiermassa kwaliteit door de infiltratie van vet en fibrose 1, 2, 3, 4, 5, 6. Onlangs is voorgesteld dat soort-specifieke verschillen in vergrijzing van skeletspieren voorkomen, dat specifiek spiervezel verlies ontstaan bij knaagdieren kan optreden bij mensen 7. Toch is de resterende spiervezels van oude zoogdieren worden gekenmerkt door een verhoogde gevoeligheid voor schade en verminderde regeneratie
De meest gevestigde cellijn waardoor de studie van de spier homeostase is muizen C2C12 cellijn 21. Een aanzienlijke hoeveelheid studies hebben ook murine primaire myoblasten 22. Deze culturen hebben geleid tot een aanzienlijke begrip van muizen en gewervelde myogenese en spierregeneratie, myotube / myofiber atrofie en hypertrofie processen die optreden tijdens spierziekte en veroudering 23, 24, 25, 26. Recenter zijn verschillende groepen beschreven met menselijke primaire myoblasten tot myogenesis en spier verouderingsstudie. Echter, er is een gebrek aan consensus met regards verschillen tussen primaire myoblasten geïsoleerd uit de spier van volwassen en oude mensen 27, 28, 29, 30, 31. Ondanks verschillen kenmerk de systemische en lokale omgeving optreedt tijdens de ontwikkeling, veroudering en ziekte 6, 32, 33, 34, in vitro myoblasten en myotube culturen blijven de meest toegankelijke gereedschappen voor de studie van moleculaire mechanismen van spierontwikkeling, groei en atrofie. Bovendien zijn deze studies niet alleen een robuust, maar ook een relatief snelle, goedkope en zeer snelle in vitro tool. Bovendien ethische implicaties in verband met studies van de menselijke spieren betekenen dat voor functionele experimenten met manipulaties van genexpressie Hier tonen wij een eenvoudige experimentele protocol voor robuuste, goedkope en reproduceerbare isolatie van primaire myoblasten of MTR, van de spier van volwassenen en ouderen en beschrijven gestandaardiseerde omstandigheden in vitro kweek (figuur 1). Als primaire culturen uit de spieren bevatten meestal fibroblasten naast myoblasten, adviseren wij een preplating stap met het oog op een betere zuiverheid en kwaliteit van de primaire myoblasten. Om samen te vatten, hebben we een protocol waardoor een efficiënte en reproduceerbare isolement, cultuur en functionele studies van verrijkte en functionele MTR / primaire myoblasten van skeletspieren van volwassen en ouderen vastgesteld.
Protocol
Alle experimenten met menselijk weefsel hierin beschreven werd vooraf goedgekeurd door de Universiteit van Liverpool University Hospital Aintree Ziekenhuis en Zuid-West-Wales Research Ethics Committee (Goedkeuring nr: 13 / WA / 0374) en de experimenten werden uitgevoerd volgens de leidraad voor goede praktijk. De universiteit van Liverpool trad op als ethiek sponsoren voor deze studie. Alle donateurs hebben toestemming gegeven voor de inschrijving van deze studie. De spieren werden geïsoleerd uit mensen (BMI <25): volwassene: 30 ± 2,8 jaar oud en ouder: 69 ± 5 jaar oud.
1. Voorbereiding van Cultuur
- Coating van cultuur oppervlakken met laminine
- Bereid een werkoplossing van 10 ug / ml laminine in 1x DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline).
- Pipetteer een minimale hoeveelheid laminine oplossing van het oppervlak waarop cellen zullen worden uitgeplaat (tabel 1) volledig omsluit. Incubate tHij kweekschaal ten minste 30 min in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 incubator voor het uitplaten van de cellen. Behandel laminine voorzichtig, het vermijden van het gebruik van vortex. De werkoplossing van 10 ug / ml laminine verdund in DPBS kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C en hergebruikt meerdere malen.
- Gebruik een 60 mm (20 cm 2) petrischaaltje of 2 putten in een 6-wells plaat (2 x 10 cm2) per ~ 18-19 mg skeletspieren cellen (5,50 x 10 4 cellen in totaal) plaat. Voer celtelling te allen tijde bij uitplaten cellen voor functionele studies.
LET OP: De monsters werden oorspronkelijk verkregen van voet operaties (extensor digitorum brevis, tibialis anterior of ontvoerder halluces spieren) van de vrouwelijke patiënten (volwassenen: 30 ± 2,8 jaar oud, leeftijd: 69 ± 5 jaar oud, BMI <25).
- Bereiding van enzymatische oplossing
- Bereid 250 mM CaCl2 werkende oplossing: 277 mg op voorraad CaCl2 in 10 ml 1x DPBS. Filter de zolutie met een 0,2 pm membraan filter en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid een werkoplossing van 1,5 U / ml collagenase D, 2,4 U / ml Dispase II en 2,5 mM CaCl2 in serumvrij DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium) (tabel 2).
- Meng goed en filteren de enzymatische oplossing door een 0,2 um filter membraan voor sterilisatie. Bereid de enzymatische oplossing vooraf en ontdooide (-20 ° C) in porties voor toekomstig gebruik.
2. Tissue Spijsvertering: mechanische en enzymatische dissociatie
- Na monstername, houden de spieren bij 4 ° C in DPBS tot spijsvertering. Bereid een minimum volume van 2 ml collagenase-dispase-CaCl2 oplossing per 18-19 mg spierweefsel en verwarm tot 37 ° C voordat weefsel dissociatie.
- Dompel het spierbiopt kort in 70% ethanol, wassen met vers DPBS en plaats het weefsel op een nieuwe petrischaal met 1 ml enzymatischeoplossing.
- Gooi zoveel fibrotische en vetweefsel mogelijk en scheur de spier snel maar voorzichtig in kleine maar onderscheiden stukjes (ongeveer> 0,5 mm 2) met een steriele schaar of een chirurgisch scalpel (blade No. 10).
- Breng het monster in een 50 ml buis met de resterende 1 ml van de collagenase-dispase-CaCl2.
- Incubeer het weefsel bij 37 ° C tot 30 - 40 min. Verplaats het spierweefsel door voorzichtig schudden van de buis elke 5-10 min.
- Coat de pipetten met media om de hechting van de afgegeven cellen aan het plastic wanden van de pipetten voorkomen. Voeg 2 volumina steriel groeimedium, bijvoorbeeld 4 ml DMEM 20% FBS (foetaal runderserum), 1% L-glutamine en 1% P / S (penicilline-streptomycine), om de destructie te stoppen.
- Pipet op en neer meerdere malen met een 5 ml pipet om de afgifte van de cellen hulp van de spiervezels.
NB: Het monster wordt meestal volledig gescheiden vanwege zijn kleine omvang. HHof toevoegde, als fragmenten van de spieren nog steeds, moet een tweede incubatie met de resterende stukken van spieren en met verse enzymatische oplossing. - Filter de spier oplossing door een 70 um cel zeef in een 50 ml conische buis. Was de resterende cellen met meer media en filter door de zeef.
- Centrifugeer bij 443 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren. Gooi supernatant zorgvuldig.
- Los het pellet in F-12 media (Ham's F-12 Nutrient Mix), 20% FBS, 10% HS (paardenserum), 1% P / S, 1% α-glutamine en 2,5 ng / ml FGF-b ( recombinant menselijke basische fibroblastgroeifactor). Hier, gebruik 4 ml media per 60 mm petrischaal.
3. Seeding van Cellen
- Verzamel de kweekvat vooraf bekleed met 10 ug / ml laminine uit de incubator (paragraaf 1.1).
- Verwijder voorzichtig de overmaat aan laminine uit de cultuur schotel, en te voorkomen dat het oppervlak aan te raken (of het zal de eiwitstructuur storen). Wassende cultuur schotel met DPBS (optioneel).
- Plaat de cellen direct aan de laminine beklede vat en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Visualiseer de cellen onder de heldere-veld microscoop (100X totale vergroting) de volgende dag. Kleine ronde cellen aan het oppervlak en de resterende resten zijn te zien in het kweekmedium.
- Afdrukmateriaal met nieuwe F-12 medium aangevuld met 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamine en 2,5 ng / ml FGF-b.
4. Cultuur en passage van Cellen
- Verander het medium elke 2-3 d en splitsing van de cellen zodra groepen cellen zijn zichtbaar onder de microscoop (100X totale vergroting, bijvoorbeeld in figuur 2, cellen van ouderen, passage 0, na 7 d) om spontaan te voorkomen differentiatie.
- Bij de eerste passage (P1), veranderen de media om high-glucose DMEM aangevuld met 20% FBS, 10% HS, 1%P / S, 1% α-glutamine. Gebruik geen FGF-b van dit punt, zoals FGF is een krachtig mitogeen en belangrijke factor bij het begin van de kweek, maar kan fibroblast overgroei promoten bij langere gebruikt in kweek.
- Voor cel passage:
- Verwijder het medium en was de cellen tweemaal met DPBS.
- Voeg een minimumvolume van 0,25% EDTA-trypsine aan het oppervlak van de cellen omvatten. Rock voorzichtig om ervoor te zorgen alle cellen worden gedekt door het detachement oplossing, incubeer gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur, en verwijder deze.
- Incubeer de cellen in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 3-5 min. Tik voorzichtig en controleer of onder de heldere licht microscoop (100X totale vergroting) dat de cellen worden afgerond, maar niet volledig los van het oppervlak. Als er geen verandering waargenomen in de cellen, incubeer gedurende 5 min.
- Voeg 5 ml groeimedium (hoog-glucose DMEM aangevuld met 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamine) om de cellen te verzamelen, menggoed en breng de cellen met de nieuwe media in een T75 kolf. Was de resterende cellen deze stap te herhalen met een andere 5 ml groeimedium (10 ml in totaal voor een T75 kolf).
- Aan (bij voorkeur bij de eerste passage) preplate incuberen van de cellen in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 40 minuten. Verzamel de bovenstaande vloeistof met de cellen die niet in een nieuwe T75 kolf niet bevestigen en te broeden. Dit zou de cultuur verrijken myoblasten, zoals de meeste van de fibroblasten in de eerste kolf moet hebben gehecht.
- Verander het medium elke 2-3 d en splitsing van de cellen 1-4 zodra ze 70% confluentie gedurende maximaal rendement te bereiken.
- Voor differentiatie, zodra de cellen bereikt 70-80% samenvloeiing, verandert het kweekmedium om Differentiatie Medium (DM): high-glucose DMEM aangevuld met 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutamine. De cellen worden gedifferentieerd binnen 5 - 7 dagen, afhankelijk van de kwaliteit en zuiverheid van de myoblast cultuur.
5. Transfecties Protocol
- Seed 50.000 cellen / putje in een 12-wells plaat MF 20, ouderdom en levensvatbaarheid assays. Kweekcellen op dekglaasjes of in een schotel gecoat met laminine. Voor Ki67 kleuring zaad 25.000 cellen / putje in een 12-wells plaat.
- Voor transfecties Volg de procedure van de fabrikant uitgevoerd met 5 ul transfectiereagens, 100 nM controle microRNA nabootsen of remmer 100 nM microRNA nabootsen of 100 nM van microRNA inhibitor per putje met een totaal volume van 1 ml.
- Wijziging differentiatiemedium 6 uur na transfectie (hoog-glucose DMEM aangevuld met 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutamine). Proliferatie-experimenten, vlekken op de cellen 2 d na transfectie; voor veroudering, 7 dagen na transfectie; en MF20 kleuring, zeven dagen na transfectie.
6. Immunokleuring van de cellen
- Ki67, MyoD en MF 20 immunokleuring
- Bereid blok 1 (10% HS en 0,1% Triton-X in PBS) en blok 2 (10% HS en 0,05% Triton-X in PBS) oplossingen. Gebruik 500 ul per putje reagens voor een 12-wells plaat.
OPMERKING: Voer de volgende stappen met behulp van een shaker voor de incubatie stappen. - Verwijder de media uit de cellen.
- Spoel de cellen met PBS.
- Fixeer de cellen met koude methanol gedurende 10 minuten op een rocker.
- Verwijdert de methanol uit de cellen en spoel 3x met PBS gedurende 5 min per keer.
- blok voeg 1 oplossing en incubeer de cellen op een rocker bij KT gedurende 1 uur.
- Voeg primaire antilichaam oplossing: voor Ki67 kleuring, gebruiken Rabbit mAb om Ki67 (1: 1000 verdunning in blok 2); voor MyoD Gebruik MYOD1 (D8G3) XP Rabbit mAb (1: 100 verdunning in blok 2); voor MF 20 kleuring, gebruik MYH1E (MF 20) primair antilichaam (DSHB, 1: 1000 verdunning in blok 2).
- Incubeer de cellen met het primaire antilichaam gedurende 1 uur (KT) O / N (4 ° C) op een rocker.
- Verzamel de primaire AB (het kan worden hergebruikt meerdere keren storood bij 4 ° C).
- Spoel de cellen 3x met PBS, 5 minuten per keer.
- Voeg de juiste secundaire antilichaam: voor Ki67 of MyoD kleuring, geit anti-konijn IgG (H + L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 488 conjugaat (1: 1000 verdunning in PBS); MF 20 kleuring, geit anti-muis IgG (H + L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 488 conjugaat (1: 1000 verdunning in PBS).
- Wikkel de plaat met de cellen en incubeer secundair antilichaam gedurende 2 uur in het donker op een rocker bij RT.
- Spoel de cellen 3x met PBS gedurende 5 min per keer.
- Voeg DAPI oplossing (1: 1000 verdunning in PBS) op de cellen en incubeer op de wip bij kamertemperatuur 5-10 min.
- Spoel de cellen 3x met PBS gedurende 5 min per keer.
- Voeg 1 ml vers PBS.
- Monteer de cellen op de dekglaasjes in de montage oplossing of sluit de plaat met de cellen in PBS met Parafilm om verdamping te voorkomen.
- Bewaren bij 4 ° C.
- Visualiseer de cellen metde fluorescentiemicroscoop zo snel mogelijk (uiterlijk 2 weken).
- Bereid blok 1 (10% HS en 0,1% Triton-X in PBS) en blok 2 (10% HS en 0,05% Triton-X in PBS) oplossingen. Gebruik 500 ul per putje reagens voor een 12-wells plaat.
- levensvatbaarheid assay
- Verwijder de media uit de cellen.
- Spoel de cellen in PBS.
- Voeg 1: 1000 ethidiumbromide en 1: 1000 acridine oranje verdund in PBS.
Let op: Wees voorzichtig en werken binnen de gezondheids- en veiligheidsvoorschriften - ethidiumbromide is een kankerverwekkende stof. - Wikkel de plaat die de cellen in kleuroplossing en geïncubeerd bij kamertemperatuur op wip voor 5 min.
- Neem beelden van de cellen met de fluorescentiemicroscoop: groene kanaal voor acridine oranje; rode kanaal voor ethidiumbromide.
Representative Results
Mediterrane partnerlanden / primaire myoblasten moet zichtbaar 24 uur na zaaien op de met laminine gecoate oppervlak (figuur 2) zijn. De cellen moeten een spindel-achtige vorm aannemen en moet MyoD nog steeds uit te drukken in doorgang 4 (Figuur 1A, B). Fibroblasten kunnen worden onderscheiden door hun stervormige morfologie en gebrek aan expressie van MyoD (Figuur 1B, C). Wanneer de cellen eenmaal zijn bevestigd op de volgende dag worden media worden vervangen door verse media bFGF. De kweekmedia worden elke 48 uur vervangen.
De representatieve resultaten hier getoonde en gepubliceerde gegevens uit ons laboratorium 22 doel om ons het kweken protocol ondersteunen en tonen de verschillende technieken die kunnen worden gebruikt voor functionele studies van humane primaire myoblasten. Myoblast proliferatie kunnen worden bestudeerd met behulp van Ki67 immunokleuring en de levensvatbaarheid gebruik staining cellevensvatbaarheid test (figuur 3). Differentiatie moet de kweekmedia worden gewijzigd om differentiatie media. Myotubes moet vormen in 5-7 en d zijn myosine zware keten positief (figuur 3). Merk op dat de vorming myotube minder efficiënt kunnen zijn bij myoblasten worden geïsoleerd uit de spier van ouderen (figuur 3). Veroudering (SA-β-galactosidase) kleuring kan ook worden uitgevoerd om het percentage verouderde cellen in de cultuur te creëren (Figuur 3). We zagen dat langere kweken (figuur 3, passage 4), meer myoblasten geïsoleerd uit de spier van ouderen tonen senescentie.
Voor functionele studies, kunnen genen en microRNA expressie worden gemanipuleerd met lipofiele transfectiereagens-gemedieerde afgifte van expressievectoren siRNAs, microRNA imiteert en antimiRs (figuur 4). Dit maakt 40 -70% transfectie-efficiëntie met gen / microRNA niveaus die op- of neerwaarts gereguleerd binnen een fysiologisch bereik (figuur 4; 22).
| kweekvat | Ong. Area (per putje) | Volume van 10 ug / ml laminine |
| 35 mm schotel | 10 cm 2 | 1 mL |
| 60 mm schotel | 20 cm 2 | 2 mL |
| 100 mm schotel | 60 cm 2 | 4 mL |
| 24-well plaat | 2 cm 2 | 200 ul / putje |
| 12-well plaat | 4 cm 2 | 500 ul / putje |
| 6-well plaat | 10 cm 2 | 1 ml / well |
| T25 | 25 cm 2 | 3 mL |
| T75 | 75 cm 2 | 5 mL |
Tabel 1. Aanbevolen minimale volumes van laminine-DPBS oplossing (10 ug / ml) Coating kweekoppervlak.
| Specifieke activiteit / Mol massa | eindconcentratie | Massa of volume nodig voor 10 ml oplossing | |
| collagenase D | 0,15 U / mg | 10 mg / ml (1,5 U / ml) | 100 mg |
| Dispase II | 0,5 U / mg | 4,8 mg / ml (2,4 U / ml) | 48 mg |
| 250 mM CaCl2 | 1100,98 g / mol | 2,5 mM | 100 gl |
Tabel 2. Enzym Voorbereiding voor Muscle spijsvertering.
Figuur 1. Grafische Abstract samenvatting van de stappen van het protocol. Dissociatie van de menselijke spierbiopt met een schaar of een chirurgische scalpel (I). Incubatie met de enzymatische oplossing bij 37 ° C gedurende 30 - 40 min (II). Einde van de digestie door middel van het toevoegen van groeimedium en filtreren van de oplossing door een 70 urn membraanfilter in een centrifugebuis (III). Centrifugatie bij 443 xg gedurende 5 minuten (IV). Gooi de supernatant en resuspenderen in kweekmedium bevattende 2,5 ng / ml FGF (V). Plating de cellen op een schaal bekleed met 1081, g / ml laminine en veranderen van de media na 24 h (VI). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. myoblasten Geïsoleerd van Spier van Adult en Oude Mensen bij Verschillende Passages. A. Afbeeldingen vertegenwoordigen myoblasten geïsoleerd van extensor digitorum brevis, tibialis anterior of ontvoerder halluces spieren van vrouwelijke patiënten (volwassenen: 30 ± 2,8 jaar oud, leeftijd: 69 ± 5 jaar oud, BMI <25). Bij passage 0 en na 5 dagen worden geplateerd, cellen nog rond en klein, maar toegankelijk onder de heldere lichtmicroscoop (A). Myoblasten zal dan vast een langgerekte vorm, zoals getoond bij passage 2 (A). MyoD uitgedrukt in myoblasten maar niet in fibroblasten (B). Kwantificering van MyoD-positieve cellen getoond; fout balken geven de standaardafwijking; n = 3 (B). Representatief beeld tonen de verschillen tussen myoblast en fibroblast morfologie (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Human Primary myoblasten kan worden gekarakteriseerd met behulp van verschillende technieken kleuring. Levensvatbaarheid van de cellen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van kleuring voor levensvatbaarheid van de cel assays, kan proliferatie worden beoordeeld met behulp van Ki67 immunokleuring, kan onderscheid worden beoordeeld met behulp van MF20 (myosine zware keten) immunokleuring en veroudering kan worden gevisualiseerd met behulp van senescence geassocieerd beta galactosidase (SA-β-galactosidase ) kleuring. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Human Primary myoblasten kan worden gebruikt voor functionele studies van Muscle Homeostasis In Vitro. A. MF20 (myosine zware keten) immunokleuring van gedifferentieerde primaire myotubes van volwassen mensen die de effecten van overexpressie of remming van miR-378 op myotube grootte en het aantal. B. qPCR toont relatieve expressie van miR-378 en IGF1R, gevalideerde miR-378 target-gen, na miR-378 overexpressie of remming in menselijke primaire myoblasten. Expressie ten opzichte RnU-6 en β-2-microglobuline, respectievelijk weergegeven. Fout balken geven SEM; n = 3, * - p <0,05, Student t-test.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier presenteren we een eenvoudige, robuuste, goedkope, reproduceerbare en efficiënte wijze om spier- progenitorcellen / primaire myoblasten van volwassen en oudere mensen uit extensor digitorium brevis, tibialis anterior of abductor halluces spieren. Dit protocol beoogt studies laten met menselijke primaire myoblasten van volwassen en oudere mensen, vooral wanneer meer geavanceerde methoden, zoals FACS- of MACS-sortering, niet mogelijk of niet praktisch.
De isolatiemethode in dit manuscript duurt ongeveer 2 uur. Tijdens spier isolatie, spier werd gewassen in 70% ethanol om besmetting te voorkomen. Vóór dissociatie van de spier enzymatische, is het belangrijk om de spier in kleine maar zichtbare deeltjes en voorkomen celbeschadiging door teveel hakken. De vertering leidt tot de dissociatie van spiervezels en de afgifte van satellietcellen en myogene voorlopercellen. In ons geval voor ~ 20 mg skeletspier, een 60 mm(20 cm 2) Petrischaal het meest geschikt oppervlak voor het oogsten van de cellen. Cellen uitgeplaat op een groter oppervlak toonde verminderde proliferatie, terwijl cellen uitgeplaat op een kleiner oppervlak toonde verhoogde celdood en agglutinatie.
Wanneer de cellen werden de cellen gekweekt en uitgebreid op laminine bedekte platen. Het gebruik van niet-gecoate oppervlakken neiging om het succes van de isolatie verminderen. Daarom kunnen cellen bij voorkeur worden geoogst van een vooraf gecoate oppervlak onmiddellijk na isolatie. -Fibroblasten verrijkte culturen plaats overheersen dan myoblasten afgeleide cellen als de cellen na isolatie direct geoogst op een niet-gecoat oppervlak. Naast laminine, kan het gebruik van andere celhechting oplossingen zoals Matrigel en collageen gebaseerde reagentia worden gebruikt. Bekledingsoplossingen omvatten groeifactoren en andere verbindingen die celgroei bevordert, maar deze kunnen de cel verlopen en dus de experimentele resultaten veranderen. Inonze ervaring, 10 ug / ml laminine is de optimale concentratie en passende coating reagens voor satellietcellen en myoblasten hechting en proliferatie wanneer het ieder groeifactor of andere aanvullingen. Bovendien laminine is van nature aanwezig in de basale lamina, direct gekoppeld aan de sarcolemma, die een belangrijke functie in de satelliet celhechting en migratie speelt door de skeletspieren vezel.
De aanvulling van het kweekmedium kan ook een nadelige invloed op het gedrag van de primaire myoblasten. Bijvoorbeeld groeifactor groepen, zoals FGF en IGF hebben pleiotrope effecten op primaire myoblasten kweken met FGF-2 het regelen zowel mitogene en geprogrammeerde celdood reactie 31. Daarom moet strikt controle van de kweekomstandigheden, vooral omdat de verschillen in het gedrag van primaire myoblasten geïsoleerd uit spier van volwassenen en ouderen zijn zeer waarschijnlijk te wijten aan de zuiverheid of de culturen en de waarschijnlijkheid van fibroblasten overschrijding van de myoblasten in cultuur tijdens de lange termijn culturen 35. Wij hebben 1 uur pre-plating van de cellen tijdens de eerste splitsing op een niet-beklede oppervlak om de besmetting van de kweken met fibroblasten verminderen.
De werkwijze beschrijven we is geschikt voor het isoleren myogene progenitor cellen van de spieren van zowel volwassen en oudere mensen. De geïsoleerde cel bestaat uit een representatieve myogene celpopulatie zoals aangegeven door een hoog percentage van myogene cellen (MyoD expressie en myogene eigenschappen gevisualiseerd door MF20 immunokleuring in figuren 1 en 2) en kan worden gebruikt als een in vitro model voor functionele studies van processen geassocieerd met spier homeostase.
Eerdere studies hebben het isolement en de verschillen in eigenschappen, of het gebrek daaraan, van humane primaire myoblasten van gekenmerktvolwassenen en ouderen 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38. Het bestaan van geriatrische en / of niet-functionele humane MTR aangetoond 6, 20, 22. Echter geen verschil in het gedrag van vers geïsoleerde humane MTR is ook aangetoond 27. Ons protocol maakt de isolatie van primaire myoblasten die ten minste gedeeltelijk het fenotype behouden, zoals een verminderde proliferatieve potentiële of senescentie van primaire myoblasten geïsoleerd uit spieren van ouderen en maakt het gebruik van dezecellen voor functionele studies van de moleculaire mechanismen van spier homeostase gedurende het ouder 22.
De primaire myoblasten die als hier beschreven kan worden gebruikt niet alleen voor myogene differentiatie studies, maar ook voor intracellulaire veranderingen, zoals veranderingen in genexpressie voorkomt in de menselijke myogene precursorcellen tijdens veroudering te onderzoeken. Echter, veranderingen die optreden in cellen tijdens langdurige ex vivo kweken moeten worden overwogen bij het analyseren fenotypische en genotypische veranderingen tijdens veroudering. We raden het gebruik van vers geïsoleerde cellen voor dit doel.
Bovendien is de primaire myoblast kweekmethode beschreven maakt expansie en relatief lange termijn kweek van primaire humane myoblasten, waardoor krachtige in vitro functionele studies. We hebben eerder aangetoond dat myogene progenitorcellen geïsoleerd met behulp van onze werkwijze kan worden gebruikt voor expressie pro functional studies van processen die verband houden met veroudering spier 22. Deze methode is ook toepasbaar op de spieren van volwassen en oude knaagdieren en maakt isoleren van een verrijkte cultuur van myoblasten die kan worden gebruikt voor het profileren van genetische en epigenetische veranderingen tijdens veroudering en functionele studies 22. De beperkingen van deze werkwijze omvatten het gebruik van, in zekere mate, gemengde celpopulatie in plaats van een zuivere populatie van satelliet-cellen, die kunnen worden verkregen met behulp verfijndere gepubliceerde methoden 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43.
We presenteren een vereenvoudigde, betaalbare en reproduceerbare protocol voor de isolatie van primaire myoblasten cellen uit volwassen en oudermens. In onze ervaring, de beschikbare, meer geavanceerde methoden van isolatie en cultuur van humane primaire myoblasten (zoals MACS- of FACS gesorteerde satelliet-cellen) zijn ideaal voor sommige soorten van studies, zoals profilering transcriptomische of proteoom veranderingen in de cellen. Echter, deze methoden zijn duur, vereisen ten minste enige mate van deskundigheid en kan moeilijk zijn vanwege de lage proliferatieve percentage zuivere primaire myoblasten kweken en fibroblasten begroeiing myoblasten.
Wij presenteren een reproduceerbare protocol dat toelaat de eenvoudige isolatie en kweek van primaire humane myoblasten voor functionele studies. Daarnaast stellen we het gebruik van laminine 42 en het beperkte gebruik van bFGF als belangrijkste factoren voor een succesvolle kweek 44. We stellen ook voor het vermijden van de stress gegenereerd door centrifugeren bij het splitsen van de cellen en een pre-plating stap bij de eerste passage 45. Om samen te vatten, we hebbengeoptimaliseerde efficiënt protocol voor het kweken van primaire myoblasten / MPL uit de spieren van volwassen en oude mensen die ook voor de spieren van knaagdieren en maakt expressie en functionele studies van spier homeostase.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 628160 | Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS. |
| Cell culture plates (6-well) | Sigma-Aldrich | CLS3516 | Corning Costar cell culture plates. 6-well, flat bottom (Individually wrapped) . |
| Cell culture plates (12-well) | Greiner bio-one | 657 160 | Cellstar Cell culture Multiwell Plates. |
| Culture flasks | Greiner Bio One | 690175 (25 cm2); 658175 (75 cm2). | Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks. |
| Standard Disposable Scalpel | Granton | 91310 | Sterile stainless steel blade, pattern: 10. |
| Pipettes | Greiner bio-one | 606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL) | Cellstar Serological Pipettes. |
| Pasteur plastic pipettes | Starlab | E1414-0311 | 3.0 mL Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped. |
| Syringe | BD | 300613 | 20 mL BD eccentric tip syringe. |
| 0.2 µm filters | Gilson | ALG422A | Sterile Syringe Filters CA 0.2 µm 33 mm Pk50. |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 11597522 | Cell culture strainer sterile individually packed 70 µm polypropylene. |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | Collagenase D; Activity: ≥0.15 U/mg |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 U/mg solid. |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1 mg/mL. |
| DMEM-high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose. With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate. |
| F-12 media | Gibco | 21765029 | Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine. |
| FGF-b | PetroTech | 100-18B | Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Fetal Bovine Serum. |
| Horse serum (HS) | Sigma-Aldrich | H1270 | Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered. |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered. |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered. |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red. |
| DPBS (cell culture) | Sigma-Aldrich | D8537 | Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| PBS (immunostaining) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Phosphate-buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4). |
| Methanol | Fisher | M/4000/PC17 | Methanol Analytical Reagent Grade |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 for molecular biology. |
| anti-MF 20 antibody | DSHB | MF20-c 2ea 211 µg/ml. | MYH1E (MF 20) Mouse mAb. |
| anti-MyoD antibody | Cell Signaling Technology | 13812P | MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb. |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | Rabbit mAb to Ki67 [SP6]. |
| Anti-mouse 488 secondary antibody | Invitrogen | A-11029 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
| Anti-rabbit 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) |
| Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | Senescence β-Galactosidase Staining kit. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 41639 | Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC). |
| Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A8097 | Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O. |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Lipofectamine 2000 Transfection Reagent |
| Scramble control for transfections | Qiagen | 1027271 | miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol) |
| Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay | Qiagen | 218300 | Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
| Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor | Qiagen | 219300 | Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
| Megafuge 2.0 R Centrifuge | Heraeus | 75003085 | n/a |
| Centrifuge rotor | Heraeus | 3360 | Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm. |
| Eclipse Ti-E Inverted Microscope System | Nikon | n/a | Eyepieces: CFI 10X/22; Total magnification: 100X (MF20, Live/dead and Ki67). |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Total magnification: 100X (Senescence β-Galactosidase Staining). |
| Axiovert 25 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: E-PL 10X/20. Total magnification: 100X (bright field). |
| Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope | Nikon | n/a | Eyepiece: CFWN 10X/20. Total magnification: 100X (bright field). |
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | Hydromount |
References
- Hughes, V. A., et al. Longitudinal muscle strength changes in older adults: influence of muscle mass, physical activity, and health. J Gerontol A Biol Sci. 56, B209-B217 (2001).
- Ryall, J. G., Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Cellular and molecular mechanisms underlying age-related skeletal muscle wasting and weakness. Biogerontology. 9, 213-228 (2008).
- Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 12, 143-152 (2010).
- Lexell, J., Taylor, C. C., Sjostrom, M. What is the cause of the ageing atrophy? Total number, size and proportion of different fiber types studied in whole vastus lateralis muscle from 15- to 83-year-old men. J Neurol Sci. 84, 275-294 (1988).
- Grounds, M. D. Reasons for the degeneration of ageing skeletal muscle: a central role for IGF-1 signalling. Biogerontology. 3, 19-24 (2002).
- Carlson, M. E., et al. Molecular aging and rejuvenation of human muscle stem cells. EMBO Mol Med. 1, 381-391 (2009).
- Brown, D. M., Goljanek-Whysall, K. microRNAs: Modulators of the underlying pathophysiology of sarcopenia? Ageing Res Rev. 24, 263-273 (2015).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contraction-induced injury: recovery of skeletal muscles in young and old mice. Am J Physiol. 258, C436-C442 (1990).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Intrinsic changes and extrinsic influences of myogenic stem cell function during aging. Stem cell Rev. 3, 226-237 (2007).
- Kadi, F., Charifi, N., Henriksson, J. The number of satellite cells in slow and fast fibres from human vastus lateralis muscle. Histochem Cell Biol. 126, 83-87 (2006).
- Verdijk, L. B., et al. Satellite cell content is specifically reduced in type II skeletal muscle fibers in the elderly. Am J Physiol Endocrinol Metab. 292, E151-E157 (2007).
- Collins, C. A., Zammit, P. S., Ruiz, A. P., Morgan, J. E., Partridge, T. A. A population of myogenic stem cells that survives skeletal muscle aging. Stem cells. 25, 885-894 (2007).
- Bortoli, S., et al. Gene expression profiling of human satellite cells during muscular aging using cDNA arrays. Gene. 321, 145-154 (2003).
- Thalacker-Mercer, A. E., Dell'Italia, L. J., Cui, X., Cross, J. M., Bamman, M. M. Differential genomic responses in old vs. young humans despite similar levels of modest muscle damage after resistance loading. Physiol Genomics. 40, 141-149 (2010).
- Jejurikar, S. S., et al. Aging increases the susceptibility of skeletal muscle derived satellite cells to apoptosis. Exp Gerontol. 41, 828-836 (2006).
- McArdle, A., Dillmann, W. H., Mestril, R., Faulkner, J. A., Jackson, M. J. Overexpression of HSP70 in mouse skeletal muscle protects against muscle damage and age-related muscle dysfunction. FASEB J. 18, 355-357 (2004).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506, 316-321 (2014).
- Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. J Cell Biochem. 105, 663-669 (2008).
- Soriano-Arroquia, A., McCormick, R., Molloy, A. P., McArdle, A., Goljanek-Whysall, K. Age-related changes in miR-143-3p:Igfbp5 interactions affect muscle regeneration. ageing cell. 15, 361-369 (2016).
- Goljanek-Whysall, K., et al. Regulation of multiple target genes by miR-1 and miR-206 is pivotal for C2C12 myoblast differentiation. J Cell Sci. 125, 3590-3600 (2012).
- Georgantas, R. W., et al. Inhibition of myogenic microRNAs 1, 133, and 206 by inflammatory cytokines links inflammation and muscle degeneration in adult inflammatory myopathies. Arthritis Rheumatol. 66, 1022-1033 (2014).
- Sharples, A. P., Al-Shanti, N., Stewart, C. E. C2 and C2C12 murine skeletal myoblast models of atrophic and hypertrophic potential: relevance to disease and ageing? Journal of cellular physiology. 225, 240-250 (2010).
- Hidestrand, M., et al. Sca-1-expressing nonmyogenic cells contribute to fibrosis in aged skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 566-579 (2008).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. ageing cell. 12, 333-344 (2013).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. , (2015).
- Pietrangelo, T., et al. Molecular basis of the myogenic profile of aged human skeletal muscle satellite cells during differentiation. Exp Gerontol. 44, 523-531 (2009).
- Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp Cell Res. 174, 252-265 (1988).
- Woods, K., Marrone, A., Smith, J. Programmed cell death and senescence in skeletal muscle stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. , 331-335 (2000).
- Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490, 355-360 (2012).
- Cornelison, D. D., et al. Essential and separable roles for Syndecan-3 and Syndecan-4 in skeletal muscle development and regeneration. Genes & development. 18, 2231-2236 (2004).
- Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis. J Cell Biol. 190, 427-441 (2010).
- Schafer, R., et al. Age dependence of the human skeletal muscle stem cell in forming muscle tissue. Artificial organs. 30, 130-140 (2006).
- Castiglioni, A., et al. Isolation of progenitors that exhibit myogenic/osteogenic bipotency in vitro by fluorescence-activated cell sorting from human fetal muscle. Stem cell reports. 2, 92-106 (2014).
- Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: differential modulation of myoblast markers by TGF-beta2. J Cell Physiol. 196, 70-78 (2003).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PloS one. 4, e5846 (2009).
- Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 109, 735-744 (2001).
- Gaster, M., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. Proliferation conditions for human satellite cells. The fractional content of satellite cells. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 109, 726-734 (2001).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods Mol Biol. 798, 21-52 (2012).
- Chowdhury, S. R., et al. One-Step Purification of Human Skeletal Muscle Myoblasts and Subsequent Expansion Using Laminin-Coated Surface. Tissue engineering. Part C, Methods. 21, 1135-1142 (2015).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal muscle. 1, 34 (2011).
- Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. Fibro/adipogenic progenitors: a double-edged sword in skeletal muscle regeneration. Cell cycle. 9, 2045-2046 (2010).
- Ciofani, G., et al. Hypergravity effects on myoblast proliferation and differentiation. J Biosci Bioeng. 113, 258-261 (2012).
