Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

Summary

Questo protocollo descrive un metodo affidabile, riproducibile e semplice di isolamento e la coltura di cellule progenitrici dei mioblasti dal muscolo scheletrico di adulti e persone anziane. I muscoli usati qui sono i muscoli della gamba e del piede. Questo approccio consente l'isolamento di una popolazione arricchita di mioblasti primari per studi funzionali.

Abstract

Scheletrico omeostasi muscolare dipende la crescita muscolare (ipertrofia), l'atrofia e la rigenerazione. Durante l'invecchiamento e in diverse patologie, atrofia muscolare si verifica. La perdita di massa muscolare e la funzione è associata con tipo di fibra muscolare atrofia, commutazione tipo di fibra, la rigenerazione muscolare difettoso associata a disfunzione delle cellule satelliti, le cellule staminali del muscolo, e altri processi fisiopatologici. Questi cambiamenti sono associati a cambiamenti in intracellulare nonché nicchie locali e sistemiche. Oltre ai modelli di roditori più comunemente utilizzati dell'invecchiamento muscolare, vi è la necessità di studiare l'omeostasi muscolare e sprecare utilizzando modelli umani, che a causa di implicazioni etiche, costituiti prevalentemente da colture in vitro. Nonostante l'ampio uso di cellule umane miogenici progenitrici (PPM) e mioblasti primari in miogenesi, ci sono dati limitati sull'utilizzo di mioblasti primari e myotube culture umane per studiare i meccanismi molecolari che regolano i diversi aspetti di Mus età-associateCLE spreco, aiutando la validazione di meccanismi di invecchiamento proposto nei muscoli dei roditori. L'uso di PPM umani, mioblasti primari e miotubi isolati da adulti e di età compresa tra persone, fornisce un modello fisiologicamente rilevanti dei meccanismi molecolari di processi associati con la crescita muscolare, l'atrofia e la rigenerazione. Qui si descrive nel dettaglio un robusto, poco costoso, riproducibile ed efficiente protocollo per l'isolamento e la manutenzione di PPM umani e la loro progenie - mioblasti e miotubi da campioni muscolo umano utilizzando la digestione enzimatica. Inoltre, abbiamo determinato il numero di passaggio in cui mioblasti primari da adulti e persone anziane subiscono la senescenza in una cultura in vitro. Infine, mostriamo la capacità di trasfezione questi mioblasti e la capacità di caratterizzare la loro capacità proliferativa e differenziazione e proporre loro idoneità per effettuare studi funzionali dei meccanismi molecolari di miogenesi e deperimento muscolare in vitro.

Introduction

Da malattia e legate all'età perdita progressiva di massa e della funzione dei risultati muscolo scheletrico nella fragilità, il calo della forza e la diminuzione della qualità della vita delle persone anziane. Rappresenta muscolo scheletrico per circa il 40% della massa del corpo ^1. Durante l'invecchiamento e la malattia, atrofia progressiva dei singoli miofibre e riduzione della qualità muscolare a causa dell'infiltrazione di grassi e fibrosi si verifica ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Recentemente, è stato proposto che le differenze specie-specifici nell'invecchiamento del muscolo scheletrico si verificano, in particolare che la perdita delle fibre muscolari che si verificano nei roditori, non si può verificare nell'uomo ^7. Tuttavia, i rimanenti fibre muscolari di mammiferi invecchiati sono caratterizzati da una maggiore suscettibilità al danno e rigenerazione compromessa Adulti riparazione e manutenzione dei muscoli è mediata da cellule satelliti ^{9, 10.} Su lesioni muscolari e altri spunti rilevanti, le cellule satelliti si attivano e proliferano. Un sottoinsieme delle cellule ritorna allo stato di riposo e il resto progredisce in mioblasti (cellule miogeniche progenitrici - PPM). Questi contribuiscono a riparare della myofiber esistente ^11. La funzionalità delle cellule satelliti determina il successo di rigenerazione muscolare e le variazioni nella disponibilità delle cellule satellite con l'invecchiamento è stato dimostrato ^{12, 13, 14, 15.} Inoltre, cellule satelliti del muscolo di vecchi esseri umani e roditori mostrano un interruttore profilo trascrizionale e ridotto potenziale rigenerativo ^{16, 17, 18, 19.} Cellule satelliti di muscolo da vecchi topi e gli esseri umani hanno anche dimostrato di subire senescenza con conseguente loro ridotta funzionalità ^20.

La linea cellulare più affermati che consente lo studio dell'omeostasi muscolo è linea di cellule murine C2C12 ^21. Una quantità significativa di studi hanno utilizzato anche mioblasti primari murini ^22. Queste culture hanno portato ad una notevole comprensione di murine e vertebrati miogenesi così come la rigenerazione muscolare, myotube / myofiber atrofia, e dei processi che si verificano durante ipertrofia malattia muscolare e invecchiamento ^{23, 24, 25, 26.} Più recentemente, diversi gruppi hanno descritto utilizzando mioblasti primari umani per studiare miogenesi e invecchiamento muscolare. Tuttavia, vi è la mancanza di consenso con regards alle differenze tra mioblasti primari isolati dal muscolo di adulti e umani invecchiati ^{27, 28, 29, 30, 31.} Nonostante le differenze caratterizzato nell'ambiente sistemica e locale che si verificano durante lo sviluppo, l'invecchiamento e la malattia ^{6, 32, 33, 34,} in vitro mioblasti e miotubi culture rimangono strumenti più accessibili per lo studio dei meccanismi molecolari associati allo sviluppo muscolare, la crescita e atrofia. Inoltre, questi studi forniscono non solo un robusto, ma anche una relativamente rapida, poco costoso e di alta produttività in vitro strumento. Inoltre, implicazioni etiche associate a studi di muscoli umani significa che per gli esperimenti funzionali che coinvolgono le manipolazioni di espressione genica

Qui, vi mostriamo un semplice protocollo sperimentale per robusto, poco costoso, e riproducibile isolamento di mioblasti primari, o PPM, dal muscolo di adulti e anziani e descrivere le condizioni standardizzate di coltura in vitro (Figura 1). Come colture primarie di muscolo di solito contengono fibroblasti in aggiunta a mioblasti, si consiglia un passo preplating che mira a migliorare la purezza e la qualità dei mioblasti primari. Per riassumere, abbiamo stabilito un protocollo che consente l'isolamento efficace e riproducibile, la cultura e gli studi funzionali arricchiti e funzionali PPM / mioblasti primari da muscoli scheletrici di adulti e persone anziane.

Protocol

Tutti sperimentazione che coinvolge il tessuto umano qui descritto è stato approvato in anticipo da Università di Liverpool, University Hospital Aintree Hospital e Galles Comitato Etico di ricerca South West (N. di omologazione: 13 / WA / 0374) e gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le buone prassi di orientamento. L'Università di Liverpool ha agito come l'etica sponsor per questo studio. Tutti i donatori hanno dato il consenso informato per l'iscrizione di questo studio. I muscoli sono stati isolati da persone (BMI <25): adulti: 30 ± 2,8 anni di età e di età: 69 ± 5 anni.

1. Preparazione per la Cultura

1. Rivestimenti della cultura superfici con laminina
   1. Preparare una soluzione di lavoro di 10 mg / ml di laminina a 1x DPBS (Dulbecco Phosphate Buffered Saline).
   2. Pipettare una quantità minima di soluzione laminina a coprire completamente la superficie su cui le cellule stanno per essere placcato (Tabella 1). incubare tsi coltura piatto almeno 30 minuti in un umidificata 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore prima placcatura le cellule. Maniglia laminina attenzione, evitando l'uso di vortice. La soluzione di lavoro di 10 mg / mL laminina diluito in DPBS può essere conservato a 4 ° C e riutilizzato più volte.
   3. Utilizzare un 60 mm (20 cm ²⁾ Petri o 2 pozzi in un 6-pozzetti (2 x 10 cm ²⁾ per ~ 18 - 19 mg di muscolo scheletrico al piatto cellule (5,50 x 10 ⁴ cellule in totale). Effettuare il conteggio delle cellule in ogni momento in cui placcatura cellule per studi funzionali.
      NOTA: I campioni sono stati originariamente ottenuti da interventi chirurgici del piede (estensore delle dita brevis, tibiale anteriore o alluci abduttori muscoli) dei pazienti di sesso femminile (adulti: 30 ± 2,8 anni vecchio, invecchiato: 69 ± 5 anni, BMI <25).
2. Preparazione della soluzione enzimatica
   1. Preparare 250 mm CaCl soluzione ₂ di lavoro: 277 mg di magazzino CaCl ₂ in 10 ml 1x DPBS. Filtrare la cosìluzione con una membrana 0,2 micron filtro e conservare a 4 ° C.
   2. Preparare una soluzione di lavoro di 1,5 U / ml di collagenasi D, 2,4 U / mL di dispasi II e 2.5 mM CaCl ₂ in DMEM privo di siero (Dulbecco Modified Eagle Medium) (Tabella 2).
   3. Mescolare bene e filtrare la soluzione attraverso una membrana enzimatica 0,2 micron filtro per la sterilizzazione. Preparare la soluzione enzimatica in anticipo e congelare basso (-20 ° C) in aliquote per uso futuro.

2. Tessuto Digestione: meccanica ed enzimatica dissociazione

1. Dopo la raccolta dei campioni, mantenere il muscolo a 4 ° C in DPBS fino digestione. Preparare un volume minimo di 2 ml di collagenasi-dispasi-soluzione di CaCl ₂ a 18 - 19 mg di tessuto muscolare e riscaldarlo a 37 ° C prima della dissociazione tissutale.
2. Immergere la biopsia muscolare per breve tempo nel 70% di etanolo, lavare con DPBS freschi e posizionare il tessuto su una nuova piastra di Petri con 1 ml di enzimaticasoluzione.
3. Eliminare il più tessuto fibrotico e di grasso possibile e strappare il muscolo rapidamente ma delicatamente in piccoli ma distinguibili pezzi (circa> 0,5 mm ²⁾ con le forbici sterili o un bisturi chirurgico (lama n ° 10).
4. Trasferire il campione in un tubo da 50 ml con il restante 1 ml di collagenasi-dispasi-CaCl _2.
5. Incubare il tessuto a 37 ° C fino a 30 - 40 min. Spostare il tessuto muscolare agitando delicatamente il tubo ogni 5 - 10 minuti.
6. Rivestire le pipette con i media al fine di evitare l'adesione delle cellule rilasciate alle pareti di plastica delle pipette. Aggiungere 2 volumi di terreno di coltura sterile, ad esempio, 4 ml di DMEM 20% FBS (siero fetale bovino), 1% L-glutammina e l'1% P / S (penicillina-streptomicina), per fermare la digestione.
7. Pipettare su e giù più volte con un mL pipetta 5 per aiutare il rilascio delle cellule dalle fibre muscolari.
   NOTA: Il campione è di solito completamente dissociato a causa delle sue piccole dimensioni. However, se rimangono frammenti di muscolo, utilizzare una seconda incubazione con i restanti pezzi di muscolo e con soluzione fresca enzimatica.
8. Filtrare la soluzione muscolare attraverso un colino cella di 70 micron su una provetta da 50 ml. Lavare le rimanenti cellule con più mezzi di comunicazione e il filtro attraverso il filtro.
9. Centrifugare a 443 xg per 5 minuti a temperatura ambiente per agglomerare le cellule. Scartare con attenzione il surnatante.
10. Sciogliere il pellet in F-12 mezzi (di Ham F-12 Nutrient Mix), il 20% FBS, 10% HS (cavallo Siero), 1% P / S, 1% α-glutammina e 2,5 ng / mL di FGF-b ( ricombinante umano fibroblasti di base Growth Factor). Qui, utilizzare 4 ml di media per 60 millimetri Petri.

3. Semina di cellule

1. Raccogliere il recipiente di coltura precedentemente rivestito con 10 mg / ml laminina dal termostato (punto 1.1).
2. Rimuovere con cura l'eccesso di laminina dalla capsula di Petri, ed evitare di toccare la superficie (o sarà disturbare la struttura delle proteine). lavaggiopiatto cultura con DPBS (opzionale).
3. Piastra le cellule direttamente sulla nave rivestito laminina e incubare per 24 h in un umidificata 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
4. Visualizza le cellule sotto il microscopio in campo chiaro (ingrandimento 100X totale) il giorno seguente. Rotondo piccole cellule attaccate alla superficie ei detriti rimanenti possono essere visti nei mezzi di coltura.
5. Cambiare la media per freschi F-12 supporti integrati con il 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutammina e 2,5 ng / mL di FGF-b.

4. Cultura e Passaging di cellule

1. Cambiare media ogni 2 - 3 d e dividere le cellule prima gruppi di cellule sono visibili al microscopio (ingrandimento 100X totale, ad esempio in figura 2, le cellule da persone anziane, passaggio 0, dopo 7 d) per evitare spontaneo differenziazione.
2. Al primo passaggio (P1), cambiare il supporto di DMEM ad alto glucosio integrato con 20% FBS, 10% HS, 1%P / S, 1% α-glutammina. Evitare l'uso di FGF-b da questo punto, come FGF è un potente mitogeno e fattore importante all'inizio della coltura, ma può promuovere fibroblasti crescita eccessiva se usato più in coltura.
3. Per passaging cellule:
   1. Rimuovere il supporto e lavare le cellule due volte con DPBS.
   2. Aggiungere un volume minimo di 0,25% EDTA-tripsina per coprire la superficie delle cellule. Oscillare delicatamente per garantire tutte le celle sono coperti dalla soluzione distacco, incubare per 10 secondi a temperatura ambiente, e rimuoverlo.
   3. Incubare le cellule in un umidificata 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore 3 - 5 min. Toccare delicatamente e controllare sotto il microscopio ottico luminoso (ingrandimento 100X totale) che le cellule sono arrotondati ma non completamente staccati dalla superficie. Se nessun cambiamento viene osservato nelle cellule, incubare per ulteriori 5 minuti.
   4. Aggiungere 5 ml di crescita (DMEM ad alto glucosio completato con il 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutammina) per raccogliere le cellule, mescolarebene e trasferire le cellule con i nuovi media in un pallone T75. Lavare le rimanenti cellule ripetendo questa operazione con altri 5 ml di crescita medio (10 ml in totale per una fiasca T75).
   5. Per preplate (preferibile al primo passaggio), incubare le cellule in un umidificata 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per 40 min. Raccogliere il surnatante con le cellule che non si attaccano e incubare loro in un pallone nuovo T75. Questo dovrebbe arricchire la cultura in mioblasti, come la maggior parte dei fibroblasti avrebbe dovuto divisoria nella prima beuta.
4. Modificare i media ogni 2 - 3 D e dividere le celle da 1 a 4, non appena raggiungono il 70% di confluenza per una resa massima.
5. Per differenziazione, una volta che le cellule raggiunto 70 - 80% di confluenza, cambiare il terreno di coltura per la differenziazione Medium (DM): DMEM ad alto glucosio integrato con il 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutammina. Le cellule devono essere differenziate entro 5 - 7 d seconda della qualità e purezza dei mioblasti cultura.

5. trasfezioni protocollo

1. Seed 50.000 cellule / pozzetto in una piastra 12 pozzetti per analisi MF 20, senescenza e la vitalità. cellule di coltura su vetrini o in un piatto rivestito di laminina. Per Ki67 colorazione, semi di 25.000 cellule / pozzetto in un 12-pozzetti.
2. Per trasfezioni, seguire la procedura del produttore con 5 ml di reagente di trasfezione, 100 nM di controllo microRNA imitano o inibitore, 100 nM di microRNA mimica o 100 nM di inibitore microRNA per bene, con un volume totale di 1 ml.
3. Passare alla differenziazione media 6 ore dopo la trasfezione (DMEM ad alto glucosio integrato con il 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutammina). Per gli esperimenti di proliferazione, macchiare le cellule 2 d dopo la trasfezione; per senescenza, 7 d dopo la trasfezione; e per MF20 colorazione, sette giorni dopo la trasfezione.

6. Immunocolorazione delle Cellule

1. Ki67, MyoD e MF 20 immunostaining
   1. Preparare blocco 1 (10% HS e 0,1% Triton-X in PBS) e blocco 2 (10% HS e 0,05% Triton-X) soluzioni PBS. Utilizzare 500 ml di reagente per bene per un 12-pozzetti.
      NOTA: Effettuare le seguenti operazioni utilizzando uno shaker per le fasi di incubazione.
   2. Rimuovere i supporti dalle cellule.
   3. Lavare le cellule con PBS.
   4. Fissare le cellule con metanolo freddo per 10 minuti su un agitatore meccanico.
   5. Rimuovere il metanolo dalle cellule e lavare 3x con PBS per 5 minuti ogni volta.
   6. Aggiungere blocco 1 soluzione e incubare le cellule su un bilanciere a RT per 1 h.
   7. Aggiungere la soluzione anticorpo primario: per Ki67 colorazione, utilizzare Coniglio mAb a Ki67 (1: 1000 diluizione nel blocco 2); per MyoD, utilizzare MyoD1 (D8G3) mAb XP Coniglio (diluizione 1: 100 nel blocco 2); MF 20 colorazione, uso MYH1E (MF 20) anticorpo primario (DSHB, 1: 1000 diluizione nel blocco 2).
   8. Incubare le cellule con l'anticorpo primario per 1 h (RT) a O / N (4 ° C) su una sedia a dondolo.
   9. Raccogliere il AB primario (può essere riutilizzata più volte se storosso a 4 ° C).
   10. Lavare le cellule 3 volte con PBS, 5 min ogni volta.
   11. Aggiungere l'anticorpo secondario appropriato: per Ki67 o MyoD colorazione, di capra anti-coniglio IgG (H + L) anticorpo secondario, Alexa Fluor 488 coniugato (1: 1000 diluizione in PBS); MF 20 colorazione, di capra anti-topo IgG (H + L) anticorpo secondario, Alexa Fluor 488 coniugato (1: 1000 diluizione in PBS).
   12. Avvolgere la piastra contenente le cellule e incubare anticorpo secondario per 2 h al buio su un bilanciere a RT.
   13. Lavare le cellule 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta.
   14. Aggiungere la soluzione DAPI (1: 1000 in PBS diluizione) sulle cellule e incubare sul bilanciere a temperatura ambiente per 5 - 10 min.
   15. Lavare le cellule 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta.
   16. Aggiungere 1 ml di PBS fresco.
   17. Montare le cellule sui vetrini in soluzione di montaggio o sigillare la piastra contenente le cellule in PBS con Parafilm per evitare l'evaporazione.
   18. Conservare a 4 ° C.
   19. Visualizza le cellule conmicroscopio a fluorescenza appena possibile (non più tardi di 2 settimane).
2. test di vitalità
   1. Rimuovere i supporti dalle cellule.
   2. Lavare le cellule in PBS.
   3. Aggiungere 1: 1.000 etidio bromuro e 1: 1,000 arancio di acridina diluito in PBS.
      Attenzione: Fare attenzione e lavorare all'interno di norme di salute e sicurezza - bromuro di etidio è un agente cancerogeno.
   4. Avvolgere il piatto contenente le cellule in soluzione colorante e incubare a RT sul bilanciere per 5 min.
   5. Prendere immagini delle cellule con il microscopio a fluorescenza: canale verde per acridina arancio; canale rosso per bromuro di etidio.

Representative Results

PPM / mioblasti primari dovrebbero essere visibili 24 ore dopo la semina sulla superficie laminina rivestite (Figura 2). Le cellule dovrebbero adottare una forma fuso-like e dovrebbero esprimere MyoD ancora in passaggio 4 (Figura 1A, B). I fibroblasti si distinguono per la loro morfologia stella-like e la mancanza di espressione di MyoD (Figura 1B, C). Una volta che le cellule sono attaccate il giorno successivo, i media dovrebbero essere sostituiti con mezzi bFGF freschi. I terreni di coltura deve essere sostituito ogni 48 ore.

I risultati rappresentativi qui riportate e pubblicate i dati dal nostro laboratorio ²² scopo di sostenere il nostro protocollo isolamento e la coltura e dimostrare le diverse tecniche che possono essere utilizzate per studi funzionali di mioblasti primari umani. Mioblasti proliferazione può essere studiato con Ki67 immunoistochimica e la vitalità usando staining per test di vitalità cellulare (Figura 3). Per la differenziazione, il mezzo di coltura deve essere modificato in mezzi di differenziazione. Miotubi dovrebbero formano in 5 - 7 d ed essere miosina catena pesante positivo (Figura 3). Si noti che la formazione myotube può essere meno efficiente quando mioblasti sono isolate dal muscolo di anziani (Figura 3). Senescenza (SA-β-galattosidasi) colorazione può essere eseguita anche per stabilire la percentuale di cellule senescenti nella cultura (Figura 3). Abbiamo osservato che con le culture più lunghi (Figura 3, passaggio 4), più mioblasti isolati dal muscolo di persone di età mostrano senescenza.

Per gli studi funzionali, espressione genica e microRNA può essere manipolato tramite consegna lipofila transfezione reagenti-mediata di vettori di espressione, siRNA, imita e antimiRs microRNA (Figura 4). Ciò consente 40 -70% l'efficienza di trasfezione con i livelli del gene / microRNA essere up- o down-regolato entro un range fisiologico (figura 4; ^22).

recipiente di coltura	Circa. Area (per bene)	Volume di 10 mg / ml laminina
piatto 35 millimetri	10 cm 2	1 mL
piatto 60 millimetri	20 cm 2	2 ml
piatto 100 millimetri	60 cm 2	4 mL
24-pozzetti	2 cm 2	200 l / pozzetto
12-pozzetti	4 cm 2	500 l / pozzetto
6-pozzetti	10 cm 2	1 ml / pozzetto
T25	25 cm 2	3 mL
T75	75 cm 2	5 mL

Tabella 1. I volumi minimo raccomandato di laminina-DPBS soluzione (10 mg / ml) per il rivestimento cultura di superficie.

	Attività specifica / Massa molare	Concentrazione finale	Messa o volume necessario per 10 mL di soluzione
collagenasi D	0,15 U / mg	10 mg / ml (1,5 U / mL)	100 mg
dispasi II	0.5 U / mg	4,8 mg / ml (2,4 U / mL)	48 mg
250 mm CaCl 2	110.98 G / mol	2,5 mm	100 ml

Tabella 2. Enzima Preparazione per Muscle digestione.

Figura 1. grafica astratta Riassumendo i passaggi del protocollo. La dissociazione della biopsia muscolo umano con le forbici o con un bisturi chirurgico (I). L'incubazione con la soluzione enzimatica a 37 ° C per 30 - 40 min (II). Fine della digestione attraverso l'aggiunta di mezzi di crescita e filtrando la soluzione attraverso un filtro a membrana 70 micron in un tubo da centrifuga (III). Centrifugazione a 443 xg per 5 min (IV). Scartare il surnatante e risospendere in terreni di crescita contenente 2,5 ng / mL FGF (V). Placcatura le cellule su un piatto rivestito con 1081; g / mL di laminina e cambiando i media dopo 24 ore (VI). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. mioblasti isolati dal muscolo di adulti e umani invecchiati in vari passaggi. A. Immagini rappresentano mioblasti isolati da estensore delle dita brevis, tibiale anteriore o abduttori alluci muscoli dei pazienti di sesso femminile (adulti: 30 ± 2,8 anni vecchio, invecchiato: 69 ± 5 anni, BMI <25). Al passaggio 0 e dopo 5 giorni di essere placcato, le cellule sono ancora rotondo e piccolo, ma visibile al microscopio luce (A). Mioblasti saranno poi adottare una forma allungata, come mostrato al passaggio 2 (A). MyoD è espresso in mioblasti ma non nei fibroblasti (B). è mostrato Quantificazione di cellule MyoD-positivo; le barre di errore indicano la deviazione standard; n = 3 (B). Immagine rappresentativa dimostrare le differenze tra mioblasti e fibroblasti morfologia (C). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. umani mioblasti primari possono essere caratterizzati con diverse tecniche di colorazione. Vitalità delle cellule può essere osservata con colorazione per le analisi di vitalità cellulare, la proliferazione può essere valutata utilizzando Ki67 immunoistochimica, la differenziazione può essere valutata utilizzando MF20 (catena miosina pesante) immunostaining e senescenza può essere osservata con la senescenza associato beta galattosidasi (SA-β-galattosidasi ) colorazione. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. umani mioblasti primari possono essere utilizzati per studi funzionali di Muscle omeostasi in vitro. A. MF20 (miosina catena pesante) immunocolorazione di miotubi primari differenziati da esseri umani adulti che mostrano gli effetti della sovraespressione o inibizione di miR-378 su myotube dimensioni e numero. B. qPCR mostrando espressione relativa di miR-378 e IGF1R, convalidato miR-378 gene bersaglio, seguendo miR-378 sovraespressione o inibizione nei mioblasti primari umani. Espressione rispetto al Rnu-6 e β-2-microglobulina, rispettivamente, è mostrato. Le barre di errore mostrano SEM; n = 3, * - p <0.05, test t di Student.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Qui, vi presentiamo un metodo semplice, robusto, poco costoso, riproducibile ed efficiente di isolare le cellule progenitrici del muscolo / mioblasti primari da adulti di età compresa tra gli esseri umani e da estensore digitorium brevis, tibiale anteriore o alluci rapitore muscoli. Questo protocollo ha lo scopo di consentire studi utilizzando mioblasti primari umani da adulti di età compresa tra gli esseri umani e, in particolare quando i metodi più sofisticati, come FACS- o MACS-ordinamento, non è possibile o non è pratico.

Il metodo di isolamento presentato in questo manoscritto richiede circa 2 ore. Durante isolamento muscolari, è stato lavato in etanolo al 70% per evitare la contaminazione. Prima enzimatica dissociazione del muscolo, è importante tagliare il muscolo in piccoli ma visibili pezzi, ed evitare danni cellulari da troppo macinazione. I risultati digestione nella dissociazione miofibre e il rilascio di cellule satelliti e cellule precursori miogeniche. Nel nostro caso per ~ 20 mg di muscolo scheletrico, un 60 mm(20 cm ²⁾ Petri piatto era la superficie più appropriato per la raccolta delle cellule. Le cellule placcato su una superficie più grande ha mostrato la proliferazione ridotta, mentre le cellule placcato su una superficie più piccola ha mostrato un aumento della morte cellulare e agglutinazione.

Al momento l'isolamento, le cellule sono state coltivate ed espanse su piastre laminina-coperto. L'uso di superfici non rivestite tende a diminuire il successo dell'isolamento. Per questo motivo, le cellule possono essere raccolte preferibilmente su una superficie pre-rivestita direttamente dopo l'isolamento. culture fibroblasti-arricchito predomineranno piuttosto che cellule mioblasti-derivate se le cellule sono raccolte su una superficie non rivestita direttamente dopo l'isolamento. Oltre laminina, l'uso di altre soluzioni di attaccamento cellulare come Matrigel e reagenti a base di collagene può essere utilizzato. soluzioni di rivestimento possono comprendere fattori di crescita e altri composti che promuovono la crescita cellulare, ma questi potrebbero alterare il comportamento delle cellule e quindi i risultati sperimentali. Innostra esperienza, 10 mg / mL laminina è la concentrazione ottimale e appropriato reagente di rivestimento per cellule satelliti e attaccamento mioblasti e la proliferazione in quanto manca qualsiasi fattore di crescita o di altri complementi. Inoltre, la laminina è naturalmente presente nella lamina basale, direttamente collegata al sarcolemma, che svolge una funzione chiave in attacco delle cellule satellite e la migrazione attraverso la fibra del muscolo scheletrico.

I supplementi di mezzi di coltura possono anche avere un effetto negativo sul comportamento del mioblasti primario. Per esempio crescita gruppi fattore, come FGF o IGF, avere effetti pleiotropici su colture di mioblasti primari, con FGF-2 che controlla sia la risposta morte cellulare programmata mitogenica e ^31. È pertanto necessario controllare rigorosamente le condizioni di coltura, soprattutto perché le differenze nel comportamento dei mioblasti primari isolati dal muscolo di adulti e stagionati persone sono molto probabilmente dovuta alla purezza of le culture e la probabilità di fibroblasti sovraccaricare il mioblasti nella cultura durante le culture a lungo termine ^35. Abbiamo usato 1 ora pre-placcatura delle cellule durante il primo frazionamento su una superficie non verniciata per ridurre la contaminazione delle colture con fibroblasti.

Il metodo che descriviamo è appropriato per isolare le cellule progenitrici miogeniche dai muscoli di adulti e gli esseri umani di età. La cella isolato costituito da una popolazione rappresentativa miogenico di cellule, come indicato da una elevata percentuale di cellule miogeniche (espressione MyoD e proprietà miogeniche visualizzati da MF20 immunostaining nelle figure 1 e 2) e può essere utilizzato come modello in vitro per studi funzionali dei processi associato omeostasi muscolare.

Studi precedenti hanno caratterizzato l'isolamento e le differenze nelle proprietà, o la sua mancanza, di mioblasti primari umani daadulti e le persone di età compresa tra ^{6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38.} L'esistenza di geriatrica e / o non funzionale PPM umana è stata dimostrata ^{6, 20, 22.} Tuttavia, nessuna differenza nel comportamento di PPM umani isolati a fresco è stato anche dimostrato ^27. Il nostro protocollo permette l'isolamento di mioblasti primari che conservano almeno parzialmente il loro fenotipo, come la riduzione proliferativo senescenza potenziale o di mioblasti primari isolati dal muscolo anziani e permette l'uso di questicellule per studi funzionali dei meccanismi molecolari di omeostasi muscolare durante l'invecchiamento ^22.

I mioblasti primari isolati con il metodo descritto qui può essere utilizzato non solo per gli studi differenziamento miogenico, ma anche per indagare i cambiamenti intracellulari, come i cambiamenti nell'espressione genica che si verificano nelle cellule precursori miogeniche umane durante l'invecchiamento. Tuttavia, i cambiamenti che si verificano nelle cellule durante prolungato ex vivo la cultura devono essere considerati quando si analizzano i cambiamenti fenotipici e genotipici che si verificano durante l'invecchiamento. Si consiglia di utilizzare le cellule appena isolate per questo scopo.

Inoltre, il metodo di coltura mioblasti primario descritto qui permette l'espansione e relativamente lungo termine cultura di mioblasti primari umani, consentendo robusti studi funzionali in vitro. Abbiamo precedentemente dimostrato che le cellule progenitrici miogeniche isolate con il nostro metodo possono essere utilizzati sia per profilo di espressione e fustudi nctional di processi associati con l'invecchiamento muscolare ^22. Questo metodo è applicabile anche ai muscoli adulti e vecchi roditori e consente l'isolamento di una cultura arricchita di mioblasti che può essere utilizzato per profilatura cambiamenti genetici ed epigenetici durante l'invecchiamento e studi funzionali ^22. Le limitazioni di questo metodo includono l'uso di un certo grado, popolazione mista di cellule piuttosto che una popolazione pura di cellule satelliti, che può essere ottenuta utilizzando metodi più sofisticati pubblicato ^{6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43.}

Vi presentiamo un protocollo semplificato, a prezzi accessibili, e riproducibile per l'isolamento delle cellule mioblasti primari da adulti e invecchiatogli esseri umani. Nella nostra esperienza, i metodi più sofisticati disponibili di isolamento e la coltura di mioblasti primari umani (come MACS- o FACS-ordinati cellule satelliti) sono ideali per alcuni tipi di studi, come profilatura modifiche trascrittomica e proteomica nelle cellule. Tuttavia, questi metodi sono costosi, richiedono almeno un certo livello di esperienza, e può risultare difficile a causa del basso tasso di proliferazione delle culture e dei fibroblasti overgrowing mioblasti mioblasti primari puri.

Vi presentiamo un protocollo riproducibile che permette il semplice isolamento e la coltura di mioblasti primari umani per l'utilizzo in studi funzionali. Inoltre, proponiamo l'utilizzo di laminina ⁴² e l'uso limitato di bFGF come fattori chiave per una cultura di successo ^44. Si propone inoltre di evitare lo stress generato mediante centrifugazione quando spacca cellule e una fase di pre-placcatura al primo passaggio ^45. Per riassumere, abbiamoottimizzato un protocollo efficace per l'isolamento e la coltura di mioblasti primari / PPM dai muscoli di adulti di età compresa tra gli esseri umani e che è applicabile anche ai muscoli di roditori e permette l'espressione e studi funzionali di omeostasi muscolare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dishes	Greiner Bio One	628160	Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS.
Cell culture plates (6-well)	Sigma-Aldrich	CLS3516	Corning Costar cell culture plates. 6-well, flat bottom (Individually wrapped) .
Cell culture plates (12-well)	Greiner bio-one	657 160	Cellstar Cell culture Multiwell Plates.
Culture flasks	Greiner Bio One	690175 (25 cm2); 658175 (75 cm2).	Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks.
Standard Disposable Scalpel	Granton	91310	Sterile stainless steel blade, pattern: 10.
Pipettes	Greiner bio-one	606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL)	Cellstar Serological Pipettes.
Pasteur plastic pipettes	Starlab	E1414-0311	3.0 mL Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped.
Syringe	BD	300613	20 mL BD eccentric tip syringe.
0.2 µm filters	Gilson	ALG422A	Sterile Syringe Filters CA 0.2 µm 33 mm Pk50.
Cell strainers	Fisher Scientific	11597522	Cell culture strainer sterile individually packed 70 µm polypropylene.
Collagenase D	Roche	11088882001	Collagenase D; Activity: ≥0.15 U/mg
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693	Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 U/mg solid.
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709	Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1 mg/mL.
DMEM-high glucose	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose. With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate.
F-12 media	Gibco	21765029	Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine.
FGF-b	PetroTech	100-18B	Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Fetal Bovine Serum.
Horse serum (HS)	Sigma-Aldrich	H1270	Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered.
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered.
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered.
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered.
TrypLE Express	Gibco	12604-013	TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red.
DPBS (cell culture)	Sigma-Aldrich	D8537	Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride.
PBS (immunostaining)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	Phosphate-buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4).
Methanol	Fisher	M/4000/PC17	Methanol Analytical Reagent Grade
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 for molecular biology.
anti-MF 20 antibody	DSHB	MF20-c 2ea 211 µg/ml.	MYH1E (MF 20) Mouse mAb.
anti-MyoD antibody	Cell Signaling Technology	13812P	MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.
anti-Ki67 antibody	Abcam	ab16667	Rabbit mAb to Ki67 [SP6].
Anti-mouse 488 secondary antibody	Invitrogen	A-11029	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
Anti-rabbit 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11034	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
DAPI	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)
Senescence β-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860	Senescence β-Galactosidase Staining kit.
DMSO	Sigma-Aldrich	41639	Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC).
Acridine Orange	Sigma-Aldrich	A8097	Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O.
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	Lipofectamine 2000 Transfection Reagent
Scramble control for transfections	Qiagen	1027271	miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol)
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay	Qiagen	218300	Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor	Qiagen	219300	Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Megafuge 2.0 R Centrifuge	Heraeus	75003085	n/a
Centrifuge rotor	Heraeus	3360	Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm.
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System	Nikon	n/a	Eyepieces: CFI 10X/22; Total magnification: 100X (MF20, Live/dead and Ki67).
Axiovert 200 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Total magnification: 100X (Senescence β-Galactosidase Staining).
Axiovert 25 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: E-PL 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope	Nikon	n/a	Eyepiece: CFWN 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Hydromount	National Diagnostics	HS-106	Hydromount

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