Summary
이 프로토콜은 성인과 노인의 골격 근육에서 분리 및 근원 세포의 전구 세포의 문화의 강력한 재현하고 간단한 방법을 설명합니다. 여기에 사용되는 근육은 발과 다리 근육을 포함한다. 이 방법은 기능 연구를위한 주요 근육 아세포의 풍부한 인구의 분리를 할 수 있습니다.
Abstract
골격 근육 항상성은 근육 성장 (비대), 위축 및 재생에 따라 달라집니다. 노화 동안 여러 질환, 근육 낭비가 발생합니다. 근육 질량 및 기능의 상실은 근육 섬유 계 위축증, 섬유 형 스위칭 위성 세포, 근육 모세포, 기타 병태 생리 학적 과정의 기능 장애와 관련된 결함이 근육 재생과 관련된다. 이러한 변화는 세포의 변화뿐만 아니라 지역 및 전신 틈새 시장과 연결되어 있습니다. 근육 노화 가장 일반적으로 사용되는 설치류 모델 이외에도,이 근육 항상성을 연구 할 필요가있다 의한 윤리적 의미로 주로 체외 배양 이루어져 인체 모델을 사용 낭비. 인간의 근육 조직 전구 세포 (MPC와)과 근육 생성의 주요 근육 아세포의 광범위한 사용에도 불구하고, 분자 메커니즘은 나이 관련 뮤스의 다양한 측면을 규제 연구하는 인간의 기본 근육 모세포와 myotube 문화를 사용하는 방법에 대한 제한적인 데이터를이CLE 낭비, 쥐의 근육에서 제안 노화의 메커니즘의 검증을 돕는. 성인 및 노인에서 고립 된 인간의 MPC와, 기본 근육 아세포 및 myotubes의 사용은 근육 성장, 위축 및 재생과 관련된 프로세스의 분자 메커니즘의 생리 관련 모델을 제공합니다. 효소 소화를 사용하여 인간의 근육 샘플에서 근육 아세포 및 myotubes - 여기에서 우리는 세부 사항에 격리와 인간의 MPC와 그들의 자손의 유지 관리를 위해 강력한 저렴 재현하고 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 성인과 노인에서 주요 근육 아세포는 체외 문화 노화를 받아야하는 통로 수를 결정했다. 마지막으로, 이러한 근육 아세포를 형질 감염 할 수있는 능력 및 증식 및 분화 능력을 특성화하고 근육 생성 및 근육 체외 낭비 분자 메커니즘의 기능 시험을 수행하기위한 적합성을 제시하는 능력을 나타낸다.
Introduction
나약함에서 골격 근육 질량과 기능 결과의 질환 - 연령 관련 진보적 인 손실, 노인의 삶의 질에 강도 감소의 감소. 골격근은 약 40 %의 체질량 하나를 차지한다. 인해 지방 섬유증의 침투에 개별 근섬유 근육 품질 저하 점진적인 위축 노화 및 질병 중 1, 2, 3, 4, 5, 6을 발생한다. 최근에는 특히 설치류에서 발생하는 근육 섬유 손실은 인간 7에서 발생하지 않을 수 골격근의 노화 종 특이 차이가 발생하는 것이 제안되었다. 그럼에도 불구하고, 세 포유류의 나머지 근육 섬유 손상 및 장애의 재생에 대한 감수성을 증가 특징
근육 항상성의 연구를 가능하게하는 가장 확립 된 세포주는 뮤린 C2C12 세포주 (21)이다. 연구의 상당량은 뮤린 차 아세포 (22)를 사용했다. 이러한 배양 뮤린 및 척추 근육 생성뿐만 아니라 근육의 재생, myotube / 근섬유 위축, 근육 질환 중에 발생, 23, 24, 25, 26 노화 비대증 공정의 상당한 이해를 이끌어왔다. 최근에, 몇몇 그룹은 근육 생성 근육 노화를 연구 인간의 기본 아세포를 사용하여 설명했다. 그러나 레가와 합의가 부족하다성인 및 노인 인간 27, 28, 29, 30, 31의 근 아세포로부터 단리 주 간의 차이 DS. 전신 및 지역 환경, 노화와 질병 6, 32, 33, 34, 개발 과정에서 발생하는 특징 차이에도 불구하고 체외 근원 세포와 myotube 문화는 근육 발달, 성장과 위축과 관련된 분자 메커니즘을 연구하기위한 가장 접근 도구 남아있다. 또한 이러한 연구는 단지 강력한를 제공 할뿐만 아니라 시험관 도구 비교적 빠르고 저렴하고 높은 처리량. 또한, 인간의 근육의 연구와 관련된 윤리적 의미는 유전자 발현의 조작과 관련된 기능 실험을 위해 의미 여기서 우리는 성인 및 노인의 근육에서 주요 근육 아세포 또는 MPC와의 강력한 저렴하고 재현성 절연을위한 간단한 실험 프로토콜을 표시하고 체외 배양 (그림 1)의 표준화 된 조건을 설명합니다. 근육의 차 문화는 일반적으로 근육 아세포 외에 섬유 아세포를 포함, 우리는 개선 된 순도 및 기본 근육 아세포의 품질에 목표로 예비 도금 공정을 사용하는 것이 좋습니다. 요약하면, 우리는 효율적이고 재현 가능한 분리, 문화, 성인 및 노인의 골격근에서 농축 및 기능 MPC와 / 주요 근육 아세포의 기능 연구를 허용하는 프로토콜을 설립했다.
Protocol
여기에 설명 된 인체 조직을 포함하는 모든 실험은 리버풀의 대학, 대학 병원 도날드 병원과 사우스 웨스트 웨일즈 연구 윤리위원회의 사전 승인되지 않았다 (승인 번호 : 13 / WA / 0374) 및 실험은 좋은 연습 지침에 따라 수행 하였다. 윤리는이 연구를 위해 후원으로 리버풀의 대학은 행동했다. 모든 기부자는이 연구의 등록에 대한 동의서를 부여했다. 근육이 사람들로부터 분리 하였다 (BMI <25) : 성인 : 30 ± 2.8 세 세 : 69 ± 5 세.
문화 1. 준비
- 문화의 코팅 라미닌과 표면
- 1X DPBS에서 라미닌의 10 μg의 / ㎖ (둘 베코 인산염 완충 생리 식염수)의 작업 솔루션을 준비합니다.
- 완전 세포 (표 1) 도금 될 예정에있는 표면을 덮도록 라미닌 용액 최소량 피펫. t을 품어세포 도금 전에 가습 37 ° C에서 그 배양 접시에 적어도 30 분, 5 % CO 2 인큐베이터. 와류의 사용을 피하고, 신중 라미닌 핸들. DPBS에 희석하여 10 μg의 / ㎖의 라미닌 작동 용액은 39 ° C에서 저장 될 수 있고, 여러 번 재 - 사용된다.
- 6 웰 플레이트에서 60mm (20cm 2) 페트리 접시 또는 2 우물을 사용 (2 × 10cm 2) ~ (18) 당 - 골격 근육의 19 mg의 세포 (총 5.50 × 10 4 셀) 판입니다. 기능 연구에 세포를 도금 할 때 항상 휴대 계산을 수행합니다.
참고 : 샘플은 원래 여성 환자 (30 ± 2.8 세, 나이 : 69 ± 5 세, BMI <25 성인)의 발 수술 (신근 심지 브레비스, 전 경골근 또는 외전 halluces 근육)에서 얻었다.
- 효소 용액의 제조
- 10 ㎖ 1X DPBS에 재고 CaCl2를 277 mg을 250 mM의 CaCl2를 작업 솔루션을 준비합니다. 소위 필터4 ℃에서 0.2 μm의 필터 멤브레인 및 저장과 lution.
- 콜라게나 D의 1.5 U / mL로, 스파 아제 (Dispase) II 2.4 U / mL의 무 혈청 DMEM에 2.5 mM의 염화칼슘 2 (둘 베코의 수정 이글의 중간) (표 2)의 작업 솔루션을 준비합니다.
- 잘 혼합하고 살균을위한 0.2 μm의 필터 멤브레인을 통해 효소 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. 사전에 효소 솔루션을 준비하고 아래로 동결 (-20 ° C) 나중에 사용하기 위해 분취한다.
2. 조직 소화 : 기계 및 효소 해리
- 샘플 수집에 따라, 소화 될 때까지 DPBS 4 ° C에서 근육을 유지합니다. (18) 당 콜라게나-CaCl2를 디스 파제 용액 2ml를 최소 부피 준비 - 근육 조직의 19 mg의 조직을 분리하기 전에 37 ℃로 가온.
- 신선한 DPBS로 세척, 간단히 70 % 에탄올에 근육 생검을 담그고 효소의 1 mL의 새로운 배양 접시에 조직을 배치해결책.
- 가능한 한 많은 섬유 성 지방 조직을 취소하고 작지만 구별 조각으로 빠르게 조심스럽게 근육을 눈물 (약> 0.5 mm 2) 멸균 가위 또는 수술 용 메스 (블레이드 제 10 호)과 함께.
- 콜라게나 제 - 디스 파제-CaCl2를 나머지 1 mL로 한 50㎖ 튜브에 시료를 옮긴다.
- 40 분 - 30까지 37 ° C에서 조직을 품어. 10 분 - 부드럽게 튜브 매 5 교반하여 근육 조직을 이동합니다.
- 코팅 매체를 사용하여 피펫을 피펫의 플라스틱의 벽에 방출 세포의 부착을 방지한다. 소화를 중지 예를 들어 멸균 성장 매체의 2 권, DMEM 20 % FBS (태아 소 혈청), 1 % L- 글루타민 및 1 % P / S (페니실린 - 스트렙토 마이신)의 4 mL로 추가합니다.
- 피펫 위로 5 mL를 피펫으로 아래로 여러 번 근육 섬유 세포의 방출을 도와줍니다.
참고 : 샘플은 일반적으로 완전히 작은 크기로 인해 해리된다. However, 근육의 조각이 남아있는 경우, 근육의 나머지 조각과 신선한 효소 솔루션과 함께 두 번째 배양을 사용합니다. - 50 ML 원뿔 튜브를 통해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 근육의 솔루션을 필터링합니다. 스트레이너를 통해 더 많은 미디어와 필터가 남아있는 세포를 씻으십시오.
- 세포 펠렛을 실온에서 5 분 동안 443 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 버린다.
- F-12 미디어 (햄의 F-12 영양소 믹스), 20 % FBS,에 펠렛을 녹이고 10 % HS (말 혈청), 1 % P / S, 1 % α-글루타민과 2.5 NG / FGF-B의 ㎖ ( 재조합 인간 염기성 섬유 아세포 성장 인자). 여기, 60mm 페트리 접시 당 미디어의 4 mL로 사용합니다.
세포의 3 시드
- 이전에 인큐베이터 (섹션 1.1)에서 10 μg의 / ML의 라미닌으로 코팅 된 배양 용기를 수집합니다.
- 조심스럽게 배양 접시에서 라미닌의 초과를 제거하고 표면에 닿지 않도록 (또는 단백질의 구조를 방해합니다). 빨래(선택 사항) DPBS로 배양 접시.
- 라미닌 코팅 용기에 직접 세포를 플레이트 및 가습 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양한다.
- 밝은 필드 현미경 (100X 종합 배율) 다음날 하에서 세포를 시각화. 라운드 작은 세포 표면에 부착되고 남은 찌꺼기는 배양 배지에서 볼 수있다.
- 20 % FBS, 10 % HS, 1 % P / S, 1 % α-글루타민과 2.5 NG / FGF-B mL의 보완 신선한 F-12 미디어 매체를 변경합니다.
4. 문화와 세포의과 Passaging
- 3 D 자발적 피하기 위하여 셀 그룹 (7 D 후, 100 배의 총 배율이,도 2의 예를, 노인에서 세포 통로 0) 현미경으로 볼 수 자마자 셀 분할 - 미디어마다이 변경 분화.
- 제 1 통로 (P1)에, 20 % FBS, 10 % HS 1 % 보완 하이 글루코스 DMEM 용지로 바꾸P / S, 1 % α - 글루타민. FGF는 문화의 시작 부분에 강력한 미토 겐 중요한 요소로,이 시점에서 FGF-B를 사용하지 마십시오,하지만 문화에서 이상 사용하는 경우는 섬유 아세포의 증식을 촉진 할 수 있습니다.
- 세포의 계대의 경우 :
- 용지를 제거하고 DPBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 세포의 표면을 커버하는 0.25 %의 EDTA-트립신 최소 볼륨. 모든 셀이 박리 액에 의해 커버되도록, 실온에서 10 초 동안 부화 및 제거 부드럽게 흔들.
- 가습 37 °의 C에서 세포를 품어, 3, 5 % CO 2 배양기 - 5 분. 가볍게 누르고 세포가 둥근하지만 완전히 표면에서 분리되지 않도록 밝은 빛 현미경 (100X 총 배율)에서 확인하십시오. 변화가 세포에서 관찰되지 않는 경우, 추가 5 분 동안 배양한다.
- 5 ㎖의 성장 매체 세포를 수집하는 (고 글루코스 DMEM은 20 % FBS, 10 % HS 1 % P / S, 1 % 글루타민 α 보완)를 첨가, 혼합잘와 T75 플라스크에 새로운 미디어 세포를 전송합니다. 성장 매체의 또 다른 5 mL를이 단계 (하나 T75 플라스크에 대한 총 10 ㎖)을 반복 남아있는 세포를 씻으십시오.
- (제 1 통로에서 바람직) preplate 위해서는 40 분 동안, 5 % CO 2 인큐베이터 가습 37 ° C에서 세포를 배양한다. 새로운 T75 플라스크에 그들을 연결하고 부화하지 않은 세포 상층 액을 수집합니다. 섬유 아세포의 대부분이 첫 번째 플라스크에 부착해야 이것은, 근육 아세포의 문화를 풍부하게한다.
- 3 일 그들은 최대 수율 70 % 포화 상태에 도달하자마자 4 셀 1 분할 - 미디어마다 2를 변경합니다.
- 2 % HS 1 % P / S, 1 % α 글루타민 보완 하이 글루코스 DMEM을 : 분화 매체 (DM)에 배양액을 변경, 80 % 컨 플루 - 분화, 세포 일단 70 이르렀다. 7 D를 근육 모세포 (C)의 품질 및 순도에 따라 - 세포 5에서 구별되어야ulture.
5. 형질 프로토콜
- 씨앗 50,000 세포 / 웰의 MF (20), 노화 및 생존 분석을위한 12 웰 플레이트. 커버 전표 또는 라미닌으로 코팅 된 접시에 배양 세포. 사료된다 염색의 경우, 12 웰 플레이트에 / 잘 25,000 세포를 시드.
- 형질 들어, 1 ㎖의 전체 부피로 형질 감염 시약 5 μL, 마이크로 RNA 모방 제어 또는 억제제는 100nm 마이크로 RNA를 모방하거나 웰당 마이크로 RNA 억제제 100 nM 내지 100 nM의를 사용하여 제조자의 절차를 따른다.
- 형질 전환 후 차별화 보통 6 시간으로 변경 (높은 혈당 DMEM 2 % HS, 1 % P / S, 1 % α-글루타민 보완). 증식 실험을 위해, 형질 전환 후 세포에게 2 일 얼룩; 노화에 대한, 형질 전환 후 7 일 이내; 및 MF20 염색 용, 칠일 형질 전환 후.
세포의 면역 염색 (6)
- 사료된다, MyoD 및 MF (20) 면역 염색
- 준비 블록 1 (10% HS 0.1 % PBS에 트리톤-X) 및 PBS) 솔루션의 2 (10 % HS 0.05 % 트리톤-X를 차단합니다. 12 웰 플레이트에 잘 당 시약 500 μL를 사용합니다.
참고 : 배양 단계 쉐이커를 사용하여 다음 단계를 수행합니다. - 세포에서 용지를 제거합니다.
- PBS로 세포를 씻어.
- 로커에 10 분간 냉 메탄올로 세포를 고정한다.
- 세포에서 메탄올을 제거하고 5 분마다 PBS로 3 배 씻어.
- 1 시간 동안 실온에서 로커에 셀을 블록 1 솔루션을 추가하고 품어.
- 일차 항체 솔루션을 추가 사료된다 염색을 위해, 사료된다에 토끼 단클론 항체를 사용 (1 : 블록 1,000 희석 2); MyoD를 들어, MyoD1 (D8G3) XP 토끼 단클론 항체를 사용 (1 : 블록 100 희석 2); MF (20) 염색, 사용 MYH1E (MF 20) 차 항체 (DSHB, 1 : 블록 1,000 희석 2).
- 로커에 O 1 시간 (RT) / N (4 °에 C)에 대한 일차 항체와 세포를 품어.
- STO 경우 여러 번 재사용 될 수있다 (주 AB 모아서빨간색) 4 ° C에서.
- 세포를 PBS, 5 분마다와 배 헹군다.
- 적절한 이차 항체를 추가 사료된다 또는 MyoD 염색, 염소 항 - 토끼 IgG를 (H + 1) 차 항체에 대한 알렉사 플 루어 488 켤레 (1 : PBS에서 1000 희석) (: PBS에서 1000 희석 1) MF (20) 염색, 염소 항 - 마우스 IgG (H + 1) 차 항체, 알렉사 형석 488 공액합니다.
- 세포를 포함하는 판을 싸서 실온에서 로커에 어둠 속에서 2 시간 동안 차 항체를 품어.
- 세포를 5 분마다 PBS로 3 배 헹군다.
- 세포에 : (PBS 1,000 희석 1) 5 RT에서 로커에 품어 - 10 분 DAPI 솔루션을 추가합니다.
- 세포를 5 분마다 PBS로 3 배 헹군다.
- 신선한 PBS 1 ML을 추가합니다.
- 장착 용액 커버 슬립에 세포를 장착 또는 증발을 방지하기 위해 파라 필름 PBS에 세포를 포함하는 플레이트를 밀봉.
- 4 ℃에서 보관하십시오.
- 함께 세포를 시각화형광 현미경 가능한 한 빨리 (늦어도 2보다 주).
- 준비 블록 1 (10% HS 0.1 % PBS에 트리톤-X) 및 PBS) 솔루션의 2 (10 % HS 0.05 % 트리톤-X를 차단합니다. 12 웰 플레이트에 잘 당 시약 500 μL를 사용합니다.
- 생존 분석
- 세포에서 용지를 제거합니다.
- PBS에서 세포를 씻어.
- 1000 에티 디움 브로마이드와 1 : PBS에 희석 1,000 아 크리 딘 오렌지 하나를 추가합니다.
주의 :주의 보건 및 안전 규정 내에서 작동 - 에티 디움 브로마이드 발암 물질이다. - 염색 액에 세포를 포함하는 플레이트를 감싸고 5 분간 로커에 RT에서 배양한다.
- 형광 현미경으로 세포의 이미지를 가지고 : 아 크리 딘 오렌지 녹색 채널을; 에티 디움 브로마이드 빨간색 채널.
Representative Results
MPC와 / 주요 근육 아세포는 라미닌 - 코팅 된 표면 (그림 2) 상에 표시 24 시간 후 파종해야한다. 세포 (그림 1A를, B) 스핀들 형상을 채택해야하며, 통로 (4) 아직 MyoD을 표현한다. 섬유 아세포는 별 모양 형태와 MyoD (도 1B, C)의 발현의 부족에 의해 구별 될 수있다. 셀은 다음 날에 부착하면 미디어 bFGF를 신선한 배지로 교체한다. 문화 미디어는 모든 48 시간을 교체해야합니다.
대표 결과는 여기에 표시하고 고립과 문화 프로토콜을 지원하고 인간의 기본 근육 아세포의 기능 연구에 사용할 수있는 다른 기술을 보여주기 위해 우리의 실험실 (22)의 목표에서 데이터를 발표했다. 근원 세포 증식 stainin 사용하여 사료된다 면역 염색과 생존을 사용하여 공부하실 수 있습니다세포 생존 분석을위한 g (그림 3). 분화, 배양 배지는 차별화 매체로 변경해야합니다. Myotubes 5에 형성한다 - 7 일 이내 무거운 체인 플러스 (그림 3) 미오신합니다. 근육 아세포가 세 명 (그림 3)의 근육에서 분리 될 때 myotube 형성이 덜 효율적이 될 수도 있습니다. 노화 (SA-β 갈 락토시다 제) 염색은 배양에서 노화 세포의 비율을 설정하기 위해 (도 3)에서 수행 될 수있다. 우리는 더 이상 문화 (그림 3, 유로 4)와, 세 사람의 근육에서 분리 된 더 많은 근육 아세포는 노화를 보여줄 것을 관찰했다.
기능 연구를 들면, 유전자와 마이크로 RNA 발현은 발현 벡터, siRNA를, 마이크로 RNA의 모방과 antimiRs (그림 4)의 친 유성 형질 전환 시약 - 매개 전달을 사용하여 조작 할 수 있습니다. 이 40 수 있습니다 -유전자 / 마이크로 RNA 레벨 업되는 70 %의 형질 전환 효율 또는 생리 학적 범위 (그림 4; 22) 내에서 조정 다운.
| 배양 용기 | 약. 지역 (물론 당) | 10 μg의 / ML의 라미닌의 볼륨 |
| 35mm 요리 | 10cm 2 | 1 mL의 |
| 60mm 요리 | 20cm 2 | 2 mL의 |
| 100mm 요리 | 60cm 2 | 4 mL의 |
| 24 웰 플레이트 | 2cm 2 | 200 μL / 웰 |
| 12 웰 플레이트 | 4cm 2 | 500 μL / 웰 |
| 6 잘 판 | 10cm 2 | 1 mL의 /도 |
| T25 | 25cm 2 | 3 mL의 |
| T75 | 75cm 2 | 5 ㎖ |
표 1. 코팅 문화 표면에 대한 라미닌 DPBS 솔루션 (10 μg의 / ㎖)의 권장 최소 볼륨.
| 특정 활동 / 몰 질량 | 최종 농도 | 10 mL의 솔루션에 필요한 질량 또는 부피 | |
| 콜라게나 D | 0.15 U / mg의 | 10 ㎎ / ㎖ (150 U / ㎖) | 100 mg의 |
| 디스 파제 II | 0.5 U / mg의 | 4.8 ㎎ / ㎖ (2.4 U / mL) 중 | 48 mg의 |
| 250 mM의 염화칼슘 (2) | (110)0.98 g / 몰 | 2.5 밀리미터 | 100 μL |
표 근육 소화 2. 효소 준비.
의정서의 단계를 요약 그림 1. 그래픽 개요입니다. 위 또는 수술 메스 (I)와 인간의 근육 조직 검사의 해리. 40 분 (II) - (30) 37 ℃에서의 효소 용액과 함께 인큐베이션. 원심 분리 튜브에 70 ㎛의 멤브레인 필터를 통해 용액을 성장 배지를 첨가하고, 여과를 통해 소화 단부 (III). 5 분 (IV) 443 XG에 원심 분리. 상층 액을 버리고 2.5 NG / mL의 FGF (V)를 포함 성장 배지에 재현 탁. (10)로 코팅 접시에 세포를 도금81; g / 라미닌, 24 시간 (VI) 후 용지를 변경 용액. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다른 구절에서 성인 및 노인 인간의 근육에서 분리 2. 근육 아세포 그림. 를했다. (: 세 30 ± 2.8 세, 69 ± 5 세, BMI <25 성인) 이미지는 신근 심지 브레비스, 여성 환자의 정강 뼈 앞쪽 또는 납치범 halluces 근육에서 분리 된 근육 아세포를 나타냅니다. 통로 0과 도금되는 5 일 후, 세포는 여전히 라운드 작은, 그러나 눈에 보이는 밝은 빛 현미경 (A) 아래에 있습니다. 통로 (2) (A)에 도시 한 바와 같이 근육 아세포는, 장척 형상을 채용한다. MyoD는 섬유 아 세포에서 근육 아세포에서 발현되지 않지만, (B). MyoD 양성 세포의 정량화가 표시됩니다; 오차 막대는 표준 편차를 보여; N = 3 (B). 근원 세포 및 섬유 아세포의 형태 (C) 사이의 차이를 보여주는 대표적인 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 인간의 기본 근육 아세포는 다른 염색 기법을 사용하여 특징이 될 수 있습니다. 세포의 생존 능력은 세포 생존 분석을위한 염색을 사용하여 시각화 할 수 있으며, 확산 사료된다 면역 염색을 사용하여 평가 될 수 있으며, 분화가 MF20을 사용하여 평가 될 수있다 (마이 오신 중쇄) 면역과 노화 노화 관련 베타 갈 락토시다 제를 사용하여 시각화 할 수있다 (SA-β-갈 락토시다 ) 염색. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 인간의 기본 근육 아세포는 체외에서 근육 항상성의 기능 연구에 사용할 수 있습니다. A. MF20 (마이 오신 중쇄) myotube 크기와 수에은 miR-378의 과발현 또는 억제의 효과를 보여주는 성인 인간에서 차별화 된 기본 myotubes의 면역 염색. 인간의 기본 근육 아세포에서은 miR-378의 과발현 또는 억제 다음은 miR-378과 IGF1R, 검증은 miR-378 표적 유전자의 상대적 발현을 보여주는 B. qPCR에. RNU-6 및 β-2 마이크로 글로불린에 대하여 식을 각각 나타낸다. 오차 막대는 SEM을 보여; N = 3, * - P <0.05, 학생 T 테스트.JPG "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기, 우리는 신전 digitorium 브레비스, 정강 뼈 앞쪽 또는 외전 halluces 근육에서 성인과 나이 든 사람에서 근육 전구 세포 / 차 근육 아세포를 분리하는 간단하고 강력한, 저렴 재현하고 효율적인 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 FACS- 또는 MACS-정렬과 같은보다 정교한 방법이 실제 가능 여부 없습니다 특히, 성인 및 노인 인간에서 인간의 기본 근육 아세포를 이용하여 연구를 허용하는 것을 목표로하고있다.
이 논문에 제시된 분리 방법은 약 2 시간이 소요됩니다. 근육 분리 동안 근육은 오염을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 세척 하였다. 근육의 분해 효소를하기에 앞서 작지만 표시 조각으로 근육을 절단하고, 너무 닦지에서 세포의 손상을 방지하는 것이 중요하다. 근섬유의 해리 위성 세포 및 근육 조직 전구 세포의 분리에 소화 결과. 골격 근육의 ~ 20 ㎎, 하나의 60mm에 대한 우리의 경우(20cm 2) 배양 접시의 세포를 수확하기 위해 가장 적합한 표면의 영역이었다. 세포가 작은 표면이 세포사 및 응집을 증가 보여준 반면에 도금 큰 표면 상에 도금 된 세포는 감소 된 증식을 보였다.
분리 후, 세포 배양 및 라미닌 커버 플레이트 상에 전개. 비 코팅 된 표면의 사용은 분리의 성공을 감소시키는 경향이 있었다. 이 때문에, 세포는 바람직하게는 직접 차단 후 사전에 피복 된 표면에 채취 할 수있다. 세포를 직접 분리 한 후 비 코팅면에 수확되는 경우 섬유 아세포 - 농후 배양 아세포 유래의 세포보다 우세 할 것이다. 그렇다 라미닌에서 이러한 마트 리겔 콜라겐 계 시약과 같은 다른 세포 부착 솔루션의 사용이 이용 될 수있다. 코팅 용액은 세포 성장을 촉진 성장 인자 및 다른 화합물을 포함 할 수 있지만 이러한 셀 동작하므로 실험 결과를 변경할 수있다. 에서그것은 임의의 성장 인자 또는 다른 보수 부족으로 경험 10 μg의 / ㎖의 라미닌 최적 농도 및 위성 세포 근원 세포 부착 및 증식을위한 적절한 시약을 도포한다. 또한, 라미닌 직접 골격근 섬유를 통해 위성 세포 부착 및 이주에 중요한 기능을 재생하는 sarcolemma에 연결된 기저판에 자연적으로 존재한다.
배양 배지의 보충은 기본 근원 세포의 거동에 불리한 영향을 미칠 수있다. 이러한 FGFs 또는 IGF-I과 IGF-II와 같은 예를 들어 성장 인자 그룹 들어, FGF-2 분열 및 프로그래밍 된 세포 사멸에 대한 응답 (31) 모두를 제어하여, 차 근원 세포 배양에서다면 발현 성 효과를 갖는다. 성인 및 노인의 근육 아세포로부터 단리 기본 동작의 차이 때문에 순도 O로 할 가능성이 매우 높다 특히 때문에 엄격 배양 조건을 제어하는 것이 필요하다문화 및 장기 문화 35시 문화에서 근육 아세포를 초과하는 섬유 아 세포의 가능성 바. 우리는 섬유 아세포와 배양 물의 오염을 감소시키기 위해 비 - 코팅 표면 상 분리 제 중에 셀 1 시간 예비 도금을 사용 하였다.
우리는 설명 방법은 성인 및 노인 모두 인간 근육에서 근육 조직 선조 세포를 분리에 적합하다. 근육 조직 세포를 높은 비율로 나타낸 (도 1 MF20 면역 염색하여 가시화 MyoD 발현 및 근육 조직 특성 및 2) 및 프로세스의 기능 연구를위한 시험 관내 모델로서 사용될 수있는 바와 같이, 격리 된 셀은 셀의 대표 근원 성 집단으로 구성 근육 항상성과 관련.
이전의 연구는 인간의 기본 아세포의 분리 및 특성의 차이, 또는 이들의 부족으로부터 특징했다성인 및 노인 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3, 6, 37, 38. 노인 및 / 또는 비 기능적 MPC와 인간의 존재는, (22) 6 (20)을 보여왔다. 그러나, 갓 고립 된 인간의 MPC와의 행동에 차이는 27을 표시 없습니다. 우리 프로토콜은 노인의 근육으로부터 격리 기본 아세포 증식의 감소 또는 노화 전위 적어도 부분적으로 자신의 표현형을 유지 차 아세포의 분리를 허용하고 이들의 사용을 허용(22) 노화하는 동안 근육 항상성의 분자 메커니즘의 기능 연구를위한 세포.
여기에 설명 된 방법을 사용하여 격리 된 기본 아세포는 근육 조직 분화 과정뿐만 아니라 이러한 에이징 동안 인간 근육 조직 전구 세포에서 발생하는 유전자 발현의 변화와 같은 세포 내 변화를 조사하기 위해 사용될 수있다. 그러나 장기간의 체외 배양시 세포에서 발생하는 변화는 노화 중에 발생하는 표현형과 유전자형 변화를 분석 할 때 고려 될 필요가있다. 우리는이 목적을 위해 갓 고립 된 세포를 사용하는 것이 좋습니다.
또한, 여기에 설명 된 기본 근원 세포 배양 방법은 강력한 시험 관내 기능 연구를 허용 팽창 및 일차 인간 근육 아세포의 비교적 장기 배양이 가능. 우리는 이전에 제안 된 방법을 사용하여 격리 된 근육 조직 전구 세포가 발현 프로파일 링 및 푸 모두에 사용될 수 있음을 보여 주었다근육 22 노화와 관련된 프로세스 nctional 연구. 이 방법은 성인 오래된 설치류의 근육에 적용하고 노화 및 기능 연구 (22) 중 유전 적, 후생 유전 학적 변화를 프로파일 링에 사용할 수있는 근육 아세포의 풍부한 문화 격리 수 있습니다. 이 방법의 제한은 어느 정도의 사용을 포함하는보다 복잡한 문서의 방법 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42 사용하여 수득 할 수있는 셀이 아닌 위성 세포의 순수 인구의 혼합 집단, 43.
우리는 성인 및 노인에서 주요 근육 아세포 세포의 분리에 대한 단순화 저렴하고 재현성 프로토콜을 제시인간. 우리의 경험에 의하면, (위성 세포를-분류 FACS 등 MACS- 또는) 분리 및 인간의 기본 근육 아세포의 배양 가능한,보다 정교한 방법은 세포에 transcriptomic 또는 단백체 변화를 프로파일 링과 같은 연구의 몇 가지 유형에 이상적이다. 그러나, 이러한 방법은 고가의 전문 적어도 어느 정도 필요로 인해 순수한 차 근원 세포 배양 및 근육 아세포를 overgrowing 섬유 아세포의 낮은 증식 속도 어려울 수있다.
우리는 기능 연구에 사용하기 위해 인간의 기본 근육 아세포의 단순한 격리와 문화를 허용하는 재생 가능한 프로토콜을 제시한다. 또한, 우리는 라미닌 (42)의 사용과 성공적인 문화 (44)에 대한 핵심 요소로의 bFGF의 제한된 사용을 제안한다. 또한 세포를 분리하고, 제 1 통로 (45)에 하나의 프리 - 도금 공정시 원심 분리에 의해 발생 된 응력을 피하고 제안한다. 우리가, 요약하면격리 또한 설치류의 근육에 적용하고 표현과 근육 항상성의 기능 연구를 가능하게 성인 및 노인 인간의 근육에서 주요 근육 아세포 / MPC와 문화에 대한 효율적인 프로토콜을 최적화.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 628160 | Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS. |
| Cell culture plates (6-well) | Sigma-Aldrich | CLS3516 | Corning Costar cell culture plates. 6-well, flat bottom (Individually wrapped) . |
| Cell culture plates (12-well) | Greiner bio-one | 657 160 | Cellstar Cell culture Multiwell Plates. |
| Culture flasks | Greiner Bio One | 690175 (25 cm2); 658175 (75 cm2). | Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks. |
| Standard Disposable Scalpel | Granton | 91310 | Sterile stainless steel blade, pattern: 10. |
| Pipettes | Greiner bio-one | 606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL) | Cellstar Serological Pipettes. |
| Pasteur plastic pipettes | Starlab | E1414-0311 | 3.0 mL Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped. |
| Syringe | BD | 300613 | 20 mL BD eccentric tip syringe. |
| 0.2 µm filters | Gilson | ALG422A | Sterile Syringe Filters CA 0.2 µm 33 mm Pk50. |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 11597522 | Cell culture strainer sterile individually packed 70 µm polypropylene. |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | Collagenase D; Activity: ≥0.15 U/mg |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 U/mg solid. |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1 mg/mL. |
| DMEM-high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose. With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate. |
| F-12 media | Gibco | 21765029 | Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine. |
| FGF-b | PetroTech | 100-18B | Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Fetal Bovine Serum. |
| Horse serum (HS) | Sigma-Aldrich | H1270 | Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered. |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered. |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered. |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red. |
| DPBS (cell culture) | Sigma-Aldrich | D8537 | Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| PBS (immunostaining) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Phosphate-buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4). |
| Methanol | Fisher | M/4000/PC17 | Methanol Analytical Reagent Grade |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 for molecular biology. |
| anti-MF 20 antibody | DSHB | MF20-c 2ea 211 µg/ml. | MYH1E (MF 20) Mouse mAb. |
| anti-MyoD antibody | Cell Signaling Technology | 13812P | MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb. |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | Rabbit mAb to Ki67 [SP6]. |
| Anti-mouse 488 secondary antibody | Invitrogen | A-11029 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
| Anti-rabbit 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) |
| Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | Senescence β-Galactosidase Staining kit. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 41639 | Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC). |
| Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A8097 | Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O. |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Lipofectamine 2000 Transfection Reagent |
| Scramble control for transfections | Qiagen | 1027271 | miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol) |
| Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay | Qiagen | 218300 | Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
| Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor | Qiagen | 219300 | Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
| Megafuge 2.0 R Centrifuge | Heraeus | 75003085 | n/a |
| Centrifuge rotor | Heraeus | 3360 | Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm. |
| Eclipse Ti-E Inverted Microscope System | Nikon | n/a | Eyepieces: CFI 10X/22; Total magnification: 100X (MF20, Live/dead and Ki67). |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Total magnification: 100X (Senescence β-Galactosidase Staining). |
| Axiovert 25 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: E-PL 10X/20. Total magnification: 100X (bright field). |
| Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope | Nikon | n/a | Eyepiece: CFWN 10X/20. Total magnification: 100X (bright field). |
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | Hydromount |
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