Préparation et culture de cellules Myogenic Précurseurs / myoblastes primaires de muscle squelettique des adultes et les humains âgés

Summary

Ce protocole décrit une méthode robuste, reproductible et simple d'isolement et de culture de cellules myoblastes progénitrices du muscle squelettique des adultes et des personnes âgées. Les muscles utilisés ici comprennent les muscles du pied et de la jambe. Cette approche permet l'isolement d'une population enrichie de myoblastes primaires pour des études fonctionnelles.

Abstract

Skeletal muscle homéostasie dépend de la croissance musculaire (hypertrophie), l'atrophie et la régénération. Au cours du vieillissement et dans plusieurs maladies, la fonte musculaire se produit. La perte de masse musculaire et la fonction est associée avec le type de fibre de l'atrophie musculaire, une commutation de type de fibre, défectueuse régénération musculaire associée à un dysfonctionnement des cellules satellites, les cellules souches musculaires et d'autres processus physiopathologiques. Ces changements sont associés à des changements dans intracellulaire ainsi que des niches locales et systémiques. En plus des modèles de rongeurs les plus couramment utilisés du vieillissement musculaire, il est nécessaire d'étudier l' homéostasie musculaire et de perdre l' aide de modèles humains qui, en raison des implications éthiques, consistant essentiellement en des cultures in vitro. Malgré la large utilisation de cellules humaines myogéniques progénitrices (PPM) et les myoblastes primaires myogenèse, il existe des données limitées sur l'utilisation de myoblastes primaires et myotubes cultures humaines pour étudier les mécanismes moléculaires régulant les différents aspects de Mus associée à l'âgeatrophie cle, aider à la validation des mécanismes du vieillissement proposé chez le rongeur musculaire. L'utilisation de PPMs humaines, myoblastes primaires et myotubes isolés à partir des adultes, personnes âgées, fournit un modèle physiologiquement pertinente des mécanismes moléculaires des processus associés à la croissance musculaire, l'atrophie et la régénération. Ici, nous décrivons en détail un protocole robuste, peu coûteuse, reproductible et efficace pour l'isolement et le maintien de l'homme PPM et leur descendance - myoblastes et les myotubes des muscles à partir d'échantillons humains en utilisant une digestion enzymatique. En outre, nous avons déterminé le nombre de passage au cours de laquelle les myoblastes primaires des adultes et les personnes âgées subissent la sénescence dans une culture in vitro. Enfin, on montre la possibilité de transfecter ces myoblastes et la capacité à caractériser leur capacité proliférative et de la différenciation et de proposer leur aptitude à effectuer des études fonctionnelles des mécanismes moléculaires de la myogenèse et l' atrophie musculaire in vitro.

Introduction

perte maladies et liée à l'âge progressif du muscle squelettique de masse et de la fonction des résultats de la fragilité, le déclin de la force et la diminution de la qualité de vie des personnes âgées. Représente le muscle squelettique pour environ 40% de masse corporelle ^1. Au cours du vieillissement et de la maladie, l' atrophie progressive des fibres musculaires et de la réduction de la qualité des muscles individuels en raison de l'infiltration de la graisse et de la fibrose se produit ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Récemment, il a été proposé que des différences spécifiques à l' espèce dans le vieillissement du muscle squelettique se produisent, en particulier que la perte des fibres musculaires survenant chez les rongeurs, ne peut se produire chez les humains ^7. Néanmoins, les fibres musculaires restantes des mammifères âgés sont caractérisés par une sensibilité accrue aux dommages et de troubles de la régénération Adulte réparation musculaire et l' entretien est médiée par les cellules satellites ^{9, 10.} Sur les blessures musculaires et d'autres indices pertinents, les cellules satellites sont activées et proliférer. Un sous-ensemble des cellules revient à l'état de repos et le reste progresse dans les myoblastes (cellules progénitrices Myogenic - PPM). Ceux - ci contribuent à la réparation de l'myofibre ¹¹ existant. La fonctionnalité des cellules satellites détermine le succès de la régénération musculaire et les changements dans la disponibilité des cellules satellites avec le vieillissement ont été démontrées ^{12, 13, 14, 15.} En outre, les cellules satellites du muscle de vieux humains et les rongeurs présentent un commutateur de profil de transcription et de réduire le potentiel de régénération ^{16, 17, 18, 19.} On a également montré les cellules satellites du muscle de souris âgées et chez l' homme résultant de subir sénescence dans leur ²⁰ fonctionnalité réduite.

La lignée cellulaire la plus établie permettant l'étude de l' homéostasie musculaire est C2C12 murin lignée cellulaire ^21. Une quantité importante d'études ont également utilisé des myoblastes primaires murins ^22. Ces cultures ont conduit à une compréhension importante de murin et des vertébrés myogenesis ainsi que la régénération musculaire, myotubes / myofibre atrophie, et les processus d'hypertrophie se produisant pendant la maladie du muscle et le vieillissement ^{23, 24, 25, 26.} Plus récemment, plusieurs groupes ont décrit l'utilisation de myoblastes primaires humains pour étudier la myogenèse et le vieillissement musculaire. Cependant, il y a absence de consensus avec regards aux différences entre les myoblastes primaires isolées à partir du muscle des adultes et les humains âgés de ^{27, 28, 29, 30, 31.} En dépit des différences caractérisées dans l'environnement systémique et locale se produisant au cours du développement, le vieillissement et la maladie ^{6, 32, 33, 34,} in vitro myoblastes et myotubes cultures restent les outils les plus accessibles pour l' étude des mécanismes moléculaires associés au développement musculaire, la croissance et l' atrophie. En outre, ces études fournissent non seulement un solide, mais aussi relativement rapide, peu coûteux et à haut débit dans l' outil vitro. En outre, les implications éthiques associés à l'étude des muscles humains signifient que pour des expériences fonctionnelles impliquant des manipulations de l'expression génique

Ici, nous montrons un protocole expérimental simple pour l' isolation robuste, peu coûteux et reproductible des myoblastes primaires, ou PPM, du muscle des adultes et des personnes âgées et de décrire des conditions normalisées de la culture in vitro (Figure 1). Comme les cultures primaires de muscle contiennent habituellement des fibroblastes en plus de myoblastes, nous recommandons une étape de prédépôt visant à améliorer la pureté et la qualité des myoblastes primaires. Pour résumer, nous avons établi un protocole permettant l'isolement efficace et reproductible, la culture et les études fonctionnelles de enrichies et fonctionnelles MPCs / myoblastes primaires du muscle squelettique des adultes et des personnes âgées.

Protocol

Toutes les expériences impliquant le tissu humain décrit ici a été approuvée à l'avance par l'Université de Liverpool, Hôpital Aintree University Hospital et Comité d'éthique du Sud-Ouest du Pays de Galles de la recherche (Approbation No: 13 / WA / 0374) et les expériences ont été réalisées selon les bonnes pratiques. L'Université de Liverpool a agi comme l'éthique commanditaire pour cette étude. Tous les donateurs ont donné leur consentement éclairé pour l'inscription de cette étude. Les muscles ont été isolés de personnes (IMC <25): adulte: 30 ± 2,8 ans et les personnes âgées: âgé de 69 ± 5 ans.

1. Préparation de la culture

1. Revêtement de la culture avec des surfaces laminine
   1. Préparer une solution de travail de 10 pg / ml de laminine dans 1 x DPBS (Phosphate Buffered Saline de Dulbecco).
   2. Pipeter une quantité minimale de solution de laminine pour couvrir complètement la surface sur laquelle les cellules vont être plaqués (tableau 1). Incuber til boîte de culture d' au moins 30 min dans un humidifiée à 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur avant l' étalement des cellules. Manipuler laminine soigneusement, en évitant l'utilisation de vortex. La solution de travail de 10 pg / ml de laminine dilué dans du DPBS peut être conservé à 4 ° C et réutilisée plusieurs fois.
   3. Utilisez un 60 mm (20 cm ²⁾ boîte de Pétri ou 2 puits dans une plaque à 6 puits (2 x 10 cm ²⁾ par ~ 18 - 19 mg de muscle squelettique à l' assiette des cellules (5,50 x 10 ⁴ cellules au total). Effectuer le comptage des cellules en tout temps lorsque étalement des cellules pour des études fonctionnelles.
      NOTE: Les échantillons ont été initialement obtenus à partir de chirurgies du pied (court extenseur des orteils, jambier antérieur ou hallux abducteurs muscles) des patientes (adultes: 30 ± 2,8 ans d'âge: âgé de 69 ± 5 ans IMC <25).
2. Préparation de la solution enzymatique
   1. Préparer 250 mM CaCl ₂ Solution de travail: 277 mg de stock CaCl ₂ dans 10 ml 1x DPBS. Filtrer la sorterésolu- avec une membrane de 0,2 um de filtre et conserver à 4 ° C.
   2. Préparer une solution de travail de 1,5 U / ml de collagénase D, 2,4 U / ml de dispase II et 2,5 mM de _CaCl2 dans un milieu DMEM sans sérum (Eagle modifié par Dulbecco Medium) (tableau 2).
   3. Bien mélanger et filtrer la solution enzymatique à travers une membrane filtrante de 0,2 pm pour la stérilisation. Préparer la solution enzymatique à l'avance et congeler vers le bas (-20 ° C) en aliquotes pour une utilisation future.

2. Digestion tissulaire: mécanique et Enzymatic Dissociation

1. Après la collecte de l'échantillon, garder le muscle à 4 ° C dans du DPBS jusqu'à la digestion. Préparer un volume de 2 mL de collagénase-dispase-solution de CaCl ₂ par 18 - 19 mg de tissu musculaire et le chauffer à 37 ° C avant la dissociation du tissu.
2. Immerger la biopsie musculaire brièvement dans 70% d'éthanol, laver avec du DPBS frais et placer le tissu sur une nouvelle boîte de Pétri avec 1 ml de enzymatiqueSolution.
3. Jeter autant de tissu fibrotique et de graisse que possible et déchirer le muscle rapidement mais doucement en petits mais distinguables pièces (environ> 0,5 mm ²⁾ avec des ciseaux stériles ou un scalpel chirurgical (lame n ° 10).
4. Transférer l'échantillon dans un tube de 50 ml avec les 1 ml restants de la collagénase-dispase-CaCl _2.
5. Laisser incuber le tissu à 37 ° C jusqu'à 30 - 40 min. Déplacer le tissu musculaire en agitant doucement le tube tous les 5 - 10 min.
6. Enduire les pipettes avec les médias afin d'éviter l'adhérence des cellules libérées aux parois en plastique des pipettes. Ajouter 2 volumes de milieu de croissance stérile, par exemple, 4 ml de DMEM 20% de FBS (sérum bovin fœtal), 1% de L-glutamine et 1% de P / S (pénicilline-streptomycine), pour arrêter la digestion.
7. Pipet monter et descendre plusieurs fois avec une pipette 5 ml pour aider à la libération des cellules des fibres musculaires.
   NOTE: L'échantillon est généralement complètement dissocié en raison de sa petite taille. Houtefois, si des fragments de muscle restent encore, utiliser une seconde incubation avec les morceaux restants de muscle et avec une solution enzymatique fraîche.
8. Filtrer la solution à travers une cellule musculaire crépine de 70 um sur un tube de 50 ml conique. Laver les cellules restantes avec plus de médias et le filtre à travers le tamis.
9. Centrifuger à 443 g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un culot des cellules. Rejeter le surnageant avec précaution.
10. Dissoudre le culot dans F-12 médias (F-12 Nutrient Mix de Ham), 20% de FBS, 10% HS (sérum de cheval), 1% P / S, 1% α-glutamine et 2,5 ng / ml de FGF-b ( humaine recombinante du facteur de croissance des fibroblastes basique). Ici, utiliser 4 ml de milieu par 60 mm boîte de Pétri.

3. Ensemencement des cellules

1. Recueillir le récipient de culture préalablement revêtue de 10 pg / ml de laminine de l'incubateur (section 1.1).
2. Retirez délicatement l'excès de laminine de la boîte de culture, et éviter de toucher la surface (ou il va perturber la structure de la protéine). lavagela boîte de culture avec du DPBS (facultatif).
3. Plaquer les cellules directement sur le récipient de laminine revêtue et incuber pendant 24 h dans un humidifiée à 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur.
4. Visualisez les cellules sous le microscope à champ lumineux (100X grossissement total) le jour suivant. Petites cellules rondes attachées à la surface et les débris restants peuvent être vus dans les milieux de culture.
5. Changer les médias à frais F-12 médias complémenté avec 20% de FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamine et 2,5 ng / ml de FGF-b.

4. Culture et repiquage de cellules

1. Changer les médias tous les 2 - 3 d et de diviser les cellules dès que des groupes de cellules sont visibles au microscope (100X grossissement total, par exemple dans la figure 2, les cellules de personnes âgées, passage 0, après 7 d) afin d'éviter spontanée différenciation.
2. Au premier passage (P1), changer les médias à haute teneur en glucose DMEM complété avec 20% de FBS, 10% HS, 1%P / S, 1% d'α-glutamine. Évitez d'utiliser FGF-b à partir de ce point, comme FGF est un mitogene puissant et facteur important au début de la culture, mais il peut favoriser la prolifération des fibroblastes si elle est utilisée plus dans la culture.
3. Pour repiquage de cellules:
   1. Retirez le support et laver les cellules deux fois avec DPBS.
   2. Ajouter un volume minimum de 0,25% de trypsine-EDTA pour recouvrir la surface des cellules. Roche doucement pour assurer que toutes les cellules sont couvertes par la solution de détachement, incuber pendant 10 secondes à la température ambiante, et le retirer.
   3. Incuber les cellules dans un humidifiée à 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur pendant 3 à 5 min. Appuyez doucement et vérifier sous le microscope de lumière vive (100X grossissement total) que les cellules sont arrondies, mais pas complètement détachés de la surface. Si aucune modification n'a observé dans les cellules, incuber pendant 5 minutes supplémentaires.
   4. Ajouter 5 ml de milieu de croissance (haute glucose DMEM complété par 20% de FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamine) pour recueillir les cellules, mélangerbien et transférer les cellules avec les nouveaux médias dans un flacon T75. Laver les cellules restantes répéter cette étape avec un autre 5 ml de milieu de croissance (10 ml au total pour un flacon T75).
   5. À preplate ( de préférence au premier passage), incuber les cellules dans un humidifiée à 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur pendant 40 min. Recueillir le surnageant avec les cellules qui ne se fixent et incuber dans un nouveau flacon T75. Cela devrait enrichir la culture dans les myoblastes, comme la plupart des fibroblastes auraient fixé dans le premier ballon.
4. Changer les médias tous les 2 - 3 d et de diviser les cellules 1 à 4 dès qu'ils atteignent 70% de confluence pour un rendement maximal.
5. Pour une différenciation, une fois que les cellules ont atteint 70 - 80% de confluence, de changer le milieu de culture au milieu de différenciation (DM):-DMEM riche en glucose complété avec 2% de HS, 1% P / S, 1% d'α-glutamine. Les cellules doivent être différenciées sous 5 - 7 jours en fonction de la qualité et de la pureté de la c myoblastesulture.

5. transfections Protocole

1. Seed 50.000 cellules / puits dans une plaque de 12 puits pour MF 20, sénescence et de viabilité des essais. les cellules de culture sur des lamelles ou dans un plat recouvert de laminine. Pour Ki67 coloration, ensemencer 25.000 cellules / puits dans une plaque de 12 puits.
2. Pour les transfections, suivez la procédure du fabricant en utilisant 5 ul de réactif de transfection, 100 nM de contrôle microRNA miment ou d'un inhibiteur, 100 nM de microRNA mimique ou 100 nM d'inhibiteur de microARN par puits, avec un volume total de 1 ml.
3. Changement de milieu de Différenciation 6 h après la transfection (haute glucose DMEM complété avec 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutamine). Pour les expériences de prolifération, colorer les cellules 2 jours après transfection; pour la sénescence, 7 jours après transfection; et MF20 coloration, sept jours après la transfection.

6. immunocoloration des cellules

1. Ki67, MyoD et MF 20 immunocoloration
   1. Préparer le bloc 1 (10% HS et 0,1% de Triton-X dans du PBS) et le bloc 2 (10% HS et 0,05% de Triton-X dans des solutions PBS). Utiliser 500 pi de réactif par puits pour une plaque de 12 puits.
      REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes à l'aide d'un agitateur pendant les étapes d'incubation.
   2. Retirez le support à partir des cellules.
   3. Rincer les cellules avec du PBS.
   4. Fixer les cellules avec du methanol froid pendant 10 min sur un agitateur.
   5. Éliminer le méthanol à partir des cellules et de rinçage 3 fois avec du PBS pendant 5 min à chaque fois.
   6. Ajouter le bloc 1 solution et incuber les cellules sur une bascule à température ambiante pendant 1 h.
   7. Ajouter une solution d'anticorps primaire: pour Ki67 coloration, utilisez Lapin mAb à Ki67 (1: 1000 dilution dans le bloc 2); pour MyoD, utilisez MyoD1 (D8G3) mAb XP Rabbit (dilution 1: 100 dans le bloc 2); MF 20 coloration, l'utilisation MYH1E (MF 20) anticorps primaire (DSHB, 1: 1000 dilution dans le bloc 2).
   8. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire pendant 1 h (RT) à O / N (4 ° C) sur une bascule.
   9. Recueillir l'AB primaire (il peut être réutilisé plusieurs fois si storouge à 4 ° C).
   10. Rincer les cellules 3x avec PBS, 5 min à chaque fois.
   11. Ajouter l'anticorps secondaire approprié: pour Ki67 ou MyoD coloration de chèvre anti-lapin IgG (H + L) de l'anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488 (1: 1000 dilution dans du PBS); MF 20 coloration de chèvre anti-IgG de souris (H + L) d'un anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488 (1: 1000 dilution dans du PBS).
   12. Enveloppez la plaque contenant les cellules et incuber anticorps secondaire pendant 2 h dans l'obscurité sur une bascule à la température ambiante.
   13. Rincer les cellules 3x avec PBS pendant 5 min à chaque fois.
   14. Ajouter la solution DAPI (1: 1000 dilution dans du PBS) sur les cellules et incuber sur la bascule à la température ambiante pendant 5 - 10 min.
   15. Rincer les cellules 3x avec PBS pendant 5 min à chaque fois.
   16. Ajouter 1 mL de PBS frais.
   17. Monter les cellules sur les lamelles en solution de montage ou sceller la plaque contenant les cellules dans du PBS avec Parafilm pour éviter l'évaporation.
   18. Conserver à 4 ° C.
   19. Visualisez les cellules avecle microscope à fluorescence le plus tôt possible (au plus tard 2 semaines).
2. Essai de Viabilité
   1. Retirez le support à partir des cellules.
   2. Rincer les cellules dans du PBS.
   3. Ajouter 1: 1000 bromure d'éthidium et 1: 1000 orange acridine dilué dans du PBS.
      Attention: Prenez soin et de travailler dans les règlements sur la santé et la sécurité - le bromure d'éthidium est un agent cancérigène.
   4. Enrouler la plaque contenant les cellules dans une solution de coloration et laisser incuber à la température ambiante sur le basculeur pendant 5 min.
   5. Prenez des images des cellules avec le microscope à fluorescence: canal vert pour l'acridine orange; canal rouge pour le bromure d'éthidium.

Representative Results

MPCs / myoblastes primaires doivent être visibles 24 h après l' ensemencement sur la surface de la laminine-enduit (Figure 2). Les cellules doivent adopter une forme de broche-like et devraient exprimer MyoD encore dans le passage 4 (figure 1A, B). Fibroblastes se distinguent par leur morphologie en étoile et le manque d'expression de MyoD (figure 1B, C). Une fois que les cellules sont fixées le jour suivant, les médias devraient être remplacés par les médias bFGF frais. Les milieux de culture doivent être remplacées toutes les 48 h.

Les résultats représentatifs présentés ici et les données publiées de notre laboratoire ²² but de soutenir notre protocole d'isolement et de la culture et de démontrer les différentes techniques qui peuvent être utilisées pour des études fonctionnelles de myoblastes primaires humains. Myoblastes prolifération peut être étudiée en utilisant Ki67 immunocoloration et la viabilité en utilisant staining pour le dosage de la viabilité cellulaire (figure 3). Pour la différenciation, le milieu de culture doit être changé aux médias de différenciation. Myotubes devraient se former dans 5-7 d et être la myosine chaîne lourde positive (Figure 3). A noter que la formation de myotubes peut être moins efficace lorsque les myoblastes sont isolées à partir du muscle de personnes âgées (figure 3). Sénescence (SA-β-galactosidase) , la coloration peut aussi être effectuée afin de déterminer le pourcentage de cellules sénescentes dans la culture (figure 3). Nous avons constaté que des cultures plus longues (figure 3, 4) de passage, de plus myoblastes isolés à partir du muscle de personnes âgées présentent sénescence.

Pour les études fonctionnelles, gènes et microRNA expression peut être manipulée en utilisant la livraison transfection lipophile réactifs médiée par des vecteurs d'expression, siRNA, imite et antimiRs microARN (figure 4). Cela permet une 40 -70% d' efficacité de transfection avec des niveaux gène / microARN étant en amont ou régulé à la baisse dans une fourchette physiologique (Figure 4; ^22).

Récipient de culture	Environ. Zone (par puits)	Volume de 10 pg / ml de laminine
Boîte de 35 mm	10 cm 2	1 ml
Boîte de 60 mm	20 cm 2	2 ml
Boîte de 100 mm	60 cm 2	4 ml
plaque de 24 puits	2 cm 2	200 ul / puits
plaque 12 puits	4 cm 2	500 ul / puits
plaque de 6 puits	10 cm 2	1 ml / puits
T25	25 cm 2	3 ml
T75	75 cm 2	5 ml

Tableau 1. Volumes minimum recommandé de Solution laminine-DPBS (10 pg / mL) pour revêtement Culture Surface.

	Activité spécifique / masse Molar	La concentration finale	Masse ou volume nécessaire pour 10 ml de solution
collagénase D	0,15 U / mg	10 mg / ml (1,5 U / ml)	100 mg
dispase II	0,5 U / mg	4,8 mg / ml (2,4 U / ml)	48 mg
250 mM de CaCl2	1100,98 g / mol	2,5 mM	100 ul

Tableau 2. Enzyme Préparation musculaire Digestion.

Figure 1. Résumé graphique Résumant les étapes du protocole. La dissociation de la biopsie musculaire humaine avec des ciseaux ou d'un scalpel chirurgical (I). Incubation avec de la solution enzymatique à 37 ° C pendant 30 - 40 min (II). Fin de la digestion par addition de milieu de croissance et en filtrant la solution à travers un filtre à membrane de 70 um dans un tube de centrifugeuse (III). Centrifugation à 443 g pendant 5 min (IV). Élimination du surnageant et remise en suspension dans un milieu de croissance contenant 2,5 ng / ml de FGF (V). Placage des cellules sur un plat recouvert de 1081: g / ml de laminine et en changeant les médias après 24 h (VI). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. myoblastes isolés du muscle des adultes et des êtres humains âgés à différents passages. A. Les images représentent des myoblastes isolés de extensor digitorum brevis, jambier antérieur ou abducteurs hallux muscles des patientes (adultes: 30 ± 2,8 ans d'âge: de 69 ± 5 ans IMC <25). Au passage 0 et après 5 jours d'être plaqué, les cellules sont toujours ronde et petite, mais visible sous le microscope de lumière (A). Myoblastes alors adopter une forme allongée, comme montré au passage 2 (A). MyoD est exprimé dans les myoblastes, mais non dans les fibroblastes (B). Quantification des cellules MyoD-positive est montrée; barres d'erreur indiquent l'écart type; n = 3 (B). Représentant l' image montrant les différences entre myoblastes et fibroblastes morphologie (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Human myoblastes primaires peuvent être caractérisés en utilisant différentes techniques de coloration. La viabilité des cellules peut être visualisé en utilisant une coloration pour les tests de viabilité cellulaire, la prolifération peut être évaluée en utilisant Ki67 immunocoloration, la différenciation peut être évaluée en utilisant MF20 (chaîne myosine lourde) immunocoloration et sénescence peuvent être visualisées en utilisant sénescence associée beta galactosidase (SA-β-galactosidase ) la coloration. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Droits de myoblastes primaires peut être utilisé pour des études fonctionnelles de Muscle homéostasie in vitro. A. MF20 (myosine chaîne lourde) immunocoloration des myotubes primaires différenciées de l' homme adulte montrant les effets de la surexpression ou l' inhibition de miR-378 sur myotubes taille et le nombre. B. qPCR montrant l' expression relative de miR-378 et IGF1R, validé miR-378 gène cible, à la suite de miR-378 ou l' inhibition de la surexpression dans des myoblastes primaires humains. L'expression par rapport à Rnu-6 et de β-2-microglobuline, respectivement, est représenté. Les barres d'erreur montrent SEM; n = 3, * - p <0,05, test de Student T.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ici, nous présentons une méthode simple, robuste, peu coûteuse, reproductible et efficace d'isoler les cellules progénitrices musculaires / myoblastes primaires d'adultes et âgés humains des extenseurs digitorium brevis, jambier antérieur ou hallux abducteurs muscles. Ce protocole a pour but de permettre des études utilisant des myoblastes primaires humains à partir des adultes et âgés de l'homme, en particulier lorsque des méthodes plus sophistiquées, telles que FACS- ou MACS-tri, ne sont pas possibles ou pas pratique.

La méthode d'isolement présenté dans ce manuscrit prend environ 2 heures. Au cours de l'isolement des muscles, le muscle a été lavé dans 70% d'éthanol afin d'éviter toute contamination. Avant enzymatique dissociation du muscle, il est important de couper le muscle en petits mais visibles morceaux, et d'éviter des dommages aux cellules de trop maniéré. Les résultats de la digestion de la dissociation des fibres musculaires et la libération de cellules satellites et cellules précurseurs myogéniques. Dans notre cas, pour ~ 20 mg de muscle squelettique, un 60 mm(20 cm ²⁾ , boîte de Pétri est la surface la plus appropriée pour récolter les cellules. Les cellules étalées sur une plus grande surface ont montré une prolifération réduite, tandis que les cellules étalées sur une surface plus petite a montré une augmentation de la mort cellulaire et l'agglutination.

Lors de l'isolement, les cellules ont été cultivées et développées sur des plaques recouvertes de laminine. L'utilisation de surfaces non revêtues a tendance à diminuer le succès de l'isolement. Pour cette raison, les cellules peuvent être récoltées de préférence sur une surface préalablement enduite juste après l'isolement. Les cultures de fibroblastes enrichi en prédomineront plutôt que des cellules myoblastes dérivées si les cellules sont récoltées sur une surface non revêtue directement après l'isolement. En dehors de la laminine, l'utilisation d'autres solutions de fixation cellulaire, tels que le Matrigel et les réactifs à base de collagène peut être utilisé. les solutions de revêtement peuvent comprendre des facteurs de croissance et d'autres composés qui favorisent la croissance cellulaire, mais ceux-ci peuvent modifier le comportement des cellules et par conséquent, les résultats expérimentaux. Dansnotre expérience, 10 pg / ml de laminine est la concentration optimale et le réactif de revêtement approprié pour les cellules satellites et l'attachement et la prolifération des myoblastes car il manque n'importe quel facteur de croissance ou d'autres compléments. En outre, la laminine est naturellement présent dans la couche basale, directement liée à la sarcolemme, qui joue un rôle clé dans la fixation des cellules par satellite et de la migration à travers la fibre musculaire squelettique.

Les suppléments de milieux de culture peuvent aussi avoir une influence néfaste sur le comportement du myoblastes primaire. Pour les groupes de facteurs de croissance, par exemple tels que FGF ou FGI, ont des effets pléiotropiques sur des cultures primaires de myoblastes, avec le FGF-2 contrôler à la fois la réponse de mort cellulaire programmée et mitogene ^31. Il est donc nécessaire de contrôler rigoureusement les conditions de culture, en particulier parce que les différences dans le comportement des myoblastes primaires isolées à partir de muscle des adultes, personnes âgées sont très susceptibles d'être dus à la pureté of les cultures et la probabilité de fibroblastes Dépassement du myoblastes en culture au cours des cultures à long terme ^35. Nous avons utilisé une heure de pré-plaquage des cellules au cours de la première division sur une surface non revêtue, afin de réduire la contamination des cultures avec des fibroblastes.

La méthode que nous décrivons est approprié pour isoler des cellules progénitrices myogéniques des muscles de l'adulte et l'homme âgés. La cellule isolée est constituée d'une population myogénique représentative de cellules comme indiqué par un pourcentage élevé de cellules myogéniques (expression MyoD et les propriétés myogéniques visualisées par MF20 immunocoloration sur les figures 1 et 2) et peuvent être utilisées comme modèle in vitro pour des études fonctionnelles des procédés associée à l'homéostasie musculaire.

Des études antérieures ont caractérisé l'isolement et des différences de propriétés, ou l'absence de celui-ci, des myoblastes primaires humains deadultes et les personnes âgées de ^{6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38.} L'existence de gériatrique et / ou non humain fonctionnel PM a été démontrée ^{6, 20, 22.} Cependant, aucune différence dans le comportement des humains fraîchement isolés MPC a également été démontré ^27. Notre protocole permet l'isolement des myoblastes primaires qui conservent au moins partiellement leur phénotype, comme la réduction de la prolifération ou la sénescence potentiel de myoblastes primaires isolées à partir du muscle de personnes âgées et permet l'utilisation de ceux-cicellules pour des études fonctionnelles des mécanismes moléculaires de l' homéostasie musculaire au cours du vieillissement ^22.

Les primaires myoblastes isolés en utilisant la méthode décrite ici peut être utilisé non seulement pour les études de différenciation myogénique mais aussi pour étudier les changements intracellulaires, tels que les changements dans l'expression des gènes qui se produisent dans les cellules précurseurs myogéniques humaines au cours du vieillissement. Cependant, les changements qui se produisent dans les cellules pendant la culture ex vivo prolongée doivent être pris en considération lors de l' analyse des changements se produisant génotypiques et phénotypiques au cours du vieillissement. Nous vous recommandons d'utiliser des cellules fraîchement isolées à cet effet.

En outre, la méthode de culture primaire de myoblastes décrite ici permet l'expansion et relativement culture à long terme de myoblastes primaires humains, ce qui permet des études fonctionnelles solides in vitro. Nous avons précédemment montré que les cellules souches isolées à l'aide de notre myogéniques méthode peut être utilisée à la fois pour le profilage d'expression et fuétudes nctional des processus associés aux muscles de vieillissement ^22. Cette méthode est également applicable aux muscles adultes et âgés rongeurs et permet l' isolement d'une culture de myoblastes enrichi qui peut être utilisé pour le profilage des modifications génétiques et épigénétiques au cours du vieillissement et des études fonctionnelles ^22. Les limites de cette méthode comprennent l'utilisation, dans une certaine mesure, la population mixte de cellules , plutôt qu'une population pure de cellules satellites, qui peut être obtenu en utilisant des méthodes plus sophistiquées publiées ^{6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43.}

Nous présentons un protocole simplifié, abordable et reproductible pour l'isolement des cellules myoblastes primaires de l'adulte et les personnes âgéeshumains. Dans notre expérience, les méthodes disponibles, plus sophistiquées de l'isolement et la culture des myoblastes primaires humains (tels que MACS ou FACS triés cellules satellites) sont idéales pour certains types d'études, telles que le profilage des changements transcriptomiques ou protéomiques dans les cellules. Cependant, ces méthodes sont coûteuses, exigent au moins un certain niveau d'expertise, et peut se révéler difficile en raison du faible taux de prolifération des cultures et des fibroblastes overgrowing myoblastes myoblastes primaires pures.

Nous présentons un protocole reproductible qui permet simple isolement et la culture des myoblastes primaires humains pour une utilisation dans des études fonctionnelles. En outre, nous proposons l'utilisation de la laminine ⁴² et l'utilisation limitée de bFGF en tant que facteurs clés pour une culture réussie ^44. Nous proposons également d' éviter le stress généré par centrifugation lors de la division des cellules et une étape de pré-plaquage au premier passage ^45. Pour résumer, nous avonsoptimisé un protocole efficace pour l'isolement et la culture des myoblastes primaires / PPM des muscles des adultes et des humains âgés qui est également applicable aux muscles des rongeurs et permet l'expression et des études fonctionnelles de l'homéostasie musculaire.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dishes	Greiner Bio One	628160	Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS.
Cell culture plates (6-well)	Sigma-Aldrich	CLS3516	Corning Costar cell culture plates. 6-well, flat bottom (Individually wrapped) .
Cell culture plates (12-well)	Greiner bio-one	657 160	Cellstar Cell culture Multiwell Plates.
Culture flasks	Greiner Bio One	690175 (25 cm2); 658175 (75 cm2).	Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks.
Standard Disposable Scalpel	Granton	91310	Sterile stainless steel blade, pattern: 10.
Pipettes	Greiner bio-one	606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL)	Cellstar Serological Pipettes.
Pasteur plastic pipettes	Starlab	E1414-0311	3.0 mL Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped.
Syringe	BD	300613	20 mL BD eccentric tip syringe.
0.2 µm filters	Gilson	ALG422A	Sterile Syringe Filters CA 0.2 µm 33 mm Pk50.
Cell strainers	Fisher Scientific	11597522	Cell culture strainer sterile individually packed 70 µm polypropylene.
Collagenase D	Roche	11088882001	Collagenase D; Activity: ≥0.15 U/mg
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693	Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 U/mg solid.
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709	Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1 mg/mL.
DMEM-high glucose	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose. With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate.
F-12 media	Gibco	21765029	Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine.
FGF-b	PetroTech	100-18B	Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Fetal Bovine Serum.
Horse serum (HS)	Sigma-Aldrich	H1270	Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered.
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered.
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered.
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered.
TrypLE Express	Gibco	12604-013	TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red.
DPBS (cell culture)	Sigma-Aldrich	D8537	Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride.
PBS (immunostaining)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	Phosphate-buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4).
Methanol	Fisher	M/4000/PC17	Methanol Analytical Reagent Grade
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 for molecular biology.
anti-MF 20 antibody	DSHB	MF20-c 2ea 211 µg/ml.	MYH1E (MF 20) Mouse mAb.
anti-MyoD antibody	Cell Signaling Technology	13812P	MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.
anti-Ki67 antibody	Abcam	ab16667	Rabbit mAb to Ki67 [SP6].
Anti-mouse 488 secondary antibody	Invitrogen	A-11029	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
Anti-rabbit 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11034	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
DAPI	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)
Senescence β-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860	Senescence β-Galactosidase Staining kit.
DMSO	Sigma-Aldrich	41639	Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC).
Acridine Orange	Sigma-Aldrich	A8097	Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O.
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	Lipofectamine 2000 Transfection Reagent
Scramble control for transfections	Qiagen	1027271	miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol)
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay	Qiagen	218300	Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor	Qiagen	219300	Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Megafuge 2.0 R Centrifuge	Heraeus	75003085	n/a
Centrifuge rotor	Heraeus	3360	Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm.
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System	Nikon	n/a	Eyepieces: CFI 10X/22; Total magnification: 100X (MF20, Live/dead and Ki67).
Axiovert 200 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Total magnification: 100X (Senescence β-Galactosidase Staining).
Axiovert 25 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: E-PL 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope	Nikon	n/a	Eyepiece: CFWN 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Hydromount	National Diagnostics	HS-106	Hydromount

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