Summary
Мы представляем простой метод для построения 3D-систем культивирования нематод под названием NGT-3D и NGB-3D. Они могут быть использованы для изучения нематод пригодности и поведения в местах обитания, которые более похожи на натуральные Caenorhabditis Элеганс места обитания , чем стандартные 2D - лаборатория C. Элеганс культуры пластин.
Protocol
1. Подготовка решения для NGT-3D и NGB-3D
- Подготовьте следующие стерильные растворы: 1 л раствора 0,1454 М NaCl, 1 л 1 М CaCl 2, 1 л 1 М MgSO 4, лизогении Бульон (LB), 1 л 1 М KPO 4 буфера (108,3 г KH 2 PO 4 и 35,6 г K 2 HPO 4, и заполняют H 2 O до 1 л). Производство NGM с помощью этих решений можно найти в предыдущем протоколе 10.
- Автоклавы растворы при температуре 121 ° С, 15 мин.
- Приготовьте 50 мл стерильного 5 мг / мл раствора холестерина. В коническую пробирку емкостью 50 мл, смешивают 0,25 г холестерина и 50 мл 99,99% этанола и хорошо перемешать. Не автоклав. Стерилизацию раствора холестерина с использованием 50 мл шприц с шприцевой фильтр 0,45 мкм. Это также приведет к удалению любого нерастворенного холестерина.
- (Необязательно) Подготовьте 10 мл 150 мМ 2'-дезокси-5-фторуридиновые (FudR) акций. В конической трубе 15 мл, смешать 0.3693 гФУДР и 10 мл дистиллированной воды. Встряхнуть хорошо.
2. Подготовка культуре бактерий для NGT-3D и NGB-3D
- Привить 10 мл LB бульона с бактериями. Стандартные бактерии , используемые для кормления C. Элеганс является штамм E.coli OP50.
- Культура бактериальная инокуляция при 37 ° C в инкубаторном шейкере в течение ночи.
- При подготовке к последовательным разбавлением, аликвотные 9 мл раствора NaCl в стерильные 15 мл конические пробирки. Например, аликвоту 9 мл в общей сложности 7 трубок , чтобы сделать 10 -7 разведения штамма OP50 E.coli.
- С помощью стерильной 1000 мкл пипетку, пипеткой 1 мл бактериальной культуры или разбавленный бактериальной культуры в стерильную новую пробирку с 9 мл раствора NaCl и вихревые смесь по 10 мл хорошо. Повторите, пока желаемый бактериальный разбавление не будет достигнута.
Примечание: Заданная бактериальной разбавление зависит от типа и состояния бактерий, а также точных условий эксперимента.Например, 10 -6 - 10 -8 разбавление штамма OP50 кишечной палочки было достаточным для получения от 1 - 200 бактериальных колоний на 6,5 мл НЗТ-3D трубки. Черви надежно разработаны и воспроизводится нормально , если количество колоний было старше 60 лет , которые произошли в разведении 10 -6 - 10 -7. Для NGB-3D, используйте разбавление 10 -8.
3. Создание NGT-3D и NGB-3D (200 мл)
- После приготовления бактериальной культуры, смесь 0,6 г NaCl, 1 г гранулированного агара и 0,5 г пептона в 500 мл колбе. Вставьте магнитной мешалкой в колбу.
- Добавить 195 мл дистиллированной воды и покрывают горлышко колбы с алюминиевой фольгой.
- Автоклавы 121 ° С в течение 15 мин.
- Горячую автоклавного колбы на мешалке, и перемешивают при умеренной скорости в течение по крайней мере 2 часов. Охлаждают колбу до 40 ° С. Обязательно остыла как продолжение здесь при высоких температурах может привести к помутнению готового агара.Тем не менее, более низкие температуры могут привести к преждевременному отвердевания агар.
- (Необязательно) Чтобы ускорить процесс охлаждения, колбу помещают в 40 ° С на водяной бане 15 мин перед помещением на мешалке.
- Когда температура агаровой среде достигает 40 ° С, добавляют 200 мкл 1 М CaCl 2, 200 мкл 5 мг / мл раствора холестерина, 200 мкл 1 М MgSO 4 и 5 мл 1 М KPO 4 буфера , как раствор продолжает перемешивать до конечной концентрации 1 мМ CaCl 2, 5 мкг / мл холестерина, 1 мМ MgSO 4, 1 мМ KPO 4.
- (Необязательно) Для НЗТ-3D анализа продолжительности жизни добавляют 80 мкл 150 мМ FUdR до конечной концентрации 120 мкМ 12.
- Добавить 6 мл 10 мл разбавленных бактериальной культуры, полученной на стадии 2.4, в колбу непосредственно.
- (Необязательно) Для NGT-3D, снимите 6 мл агара сред перед стадией 3.6 и держать его теплым отдельно. Этот носитель будет использоваться для бактерий, свободныхверхний слой.
- Использование стерильных процедур выдачи носителя в стерильной культуральной камере. Убедитесь, что крышка камеры закрывается плотно.
- (Необязательно) Чтобы предотвратить бактериальные колонии от формирования на верхней поверхности агара, чтобы слой без бактерий агаре с этапа 3.6.1 на верхней перед СМИ со стадии 3.7 полностью затвердевает. Это создаст зону без бактерий в верхней части NGT-3D.
- Для NGT-3D, залить 6,5 мл носителя в 8 мл из прозрачного пластика пробирки, чтобы сделать слой бактерий агар, и тщательно дозировать 200 мкл бактерий свободные средства массовой информации на вершине полузависимыми закаленной 3D средах, чтобы сделать тонкую bacteria- свободный слой сверху.
- Для NGB-3D, залить 65 мл носителя в 25 см 2 ясно пластиковой бутылки клеточной культуры. Эта сумма должна заполнить тело бутылки культуры 2 клетки 25 см.
- Оставьте камеры по вертикали при комнатной температуре в течение одной недели, чтобы позволить колонии бактерий растидо значительных размеров диаметром не менее 1 мм.
- (Необязательно) Для анализа продолжительности жизни в NGT-3D, крышка камеры с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить легкую деградацию ФУДР.
4. Мера Фитнес червячных населения на NGT-3D (Относительная Brood Размер пробирной)
- Выберите каскад червя L4 при помощи платиновой проволоки выбрать и передачи на бактерии свободной NGM пластины. Разрешить червь свободно передвигаться в течение нескольких минут, чтобы удалить бактерии, прикрепленные к его телу.
- Повторите шаг 4.1 и убедитесь, что червь свободен от бактерий. Как правило, два повторы 4.1 достаточно.
- Аккуратно положите чистую червяка на поверхности 3D-среды с платиновой проволоки забрать. Червяк должен в конечном итоге ввести агар в матрицу 3D агар.
- Закройте крышку свободно позволяет некоторое количество воздуха, чтобы попасть в трубу, но предотвращая высыхание агаре.
- Инкубировать в течение 96 часов при температуре 20 ° С.
- Через 4 дня, закройте крышки плотно и местоNGT-3D культуры камера в C водяной бане в 88 °, чтобы расплавить агар. Жара убивает червей, но их тела остаются нетронутыми.
Примечание: Используя 8 мл пробирки для NGT-3D, 20 - 30 мин инкубации обычно достаточно. - С помощью стеклянной пипетки, передавать Расплавленный носитель на 9 см пластиковую чашку Петри. Пластиковые пипетки не рекомендуется, так как черви могут часто прилипают к ним.
- Использование стерео передачи рассекает микроскопом, подсчитать количество червей на L3, L4 и взрослых этапах. Не рассчитывайте червей, которые являются этапом L2 и моложе, как можно спутать здесь поколений F1 и F2. Таким образом, этот анализ является относительным анализ размера выводка, а не общий анализ размера выводка.
5. Изображение и запись Worm Поведение на NGB-3D
- Выберите каскад червя L4 с использованием платиновой проволоки выбрать и удалить любые бактерии, попавшие на поверхность путем переноса на бактерии свободной NGM пластины и позволяет ему свободно двигаться в течение нескольких минут.
- Повторите шаг 5.1, чтобы убедиться, шогт свободна от бактерий.
- Осторожно поместите чистый червяка на центр агаровой поверхности NGB-3D вблизи горлышка бутылки с платиновой проволоки забрать. Червяк должен в конечном итоге ввести агар в матрицу 3D агар.
- Закройте крышку свободно позволяет некоторое количество воздуха, чтобы попасть в трубу, предотвращая высыхание агаре.
- Изображение или запись червя под стерео передачи рассекает микроскопом. Отрегулируйте фокус, как червь движется через 3D-матрицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конструкция NGT-3D является простой и прямой протокол , который приводит к агаровой заполненной пробирки с небольшими бактериальных колоний , разнесенных по всей агар (Рис . 1А) Черви могут свободно перемещаться по агара матрице, находя и отнимает много бактериальных колоний. Для того, чтобы подтвердить , может ли C. Элеганс воспроизводить и нормально расти в NGT-3D, мы сравнили плодородие и развития личинок в 3D со стандартными пластинами 2D NGM. В анализе относительного размера выводка, взрослые C. Элеганс гермафродиты в NGT-3D воспроизводят точно так же , как гермафродитов в стандартных пластин 2D NGM , когда бактериальные колонии многочисленны, по меньшей мере 60 колоний (Рисунок 1В). Кроме того, развитие личинок в NGT-3D также протекает нормально , когда есть много бактериальных колоний с большинством червей во взрослом состоянии после 96 часов (Рисунок 1C). Однако, если бактериальные колонии немногочисленныв 3D - матрице, как относительный размер выводка (рис 1B, слева бар) и личиночное развитие (рис 1C, слева бар) отрицательно влияет.
Чтобы проверить, есть ли жилье в 3D эффекта на долгосрочной физиологии червя, мы провели анализ продолжительности жизни по сравнению NGT-3D и NGM пластины. Средняя продолжительность жизни червей на NGT-3D составила 15,6 ± 3,6 дней по сравнению с 14,8 ± 3,1 дней для стандартных пластин NGM. Кривые продолжительности жизни для червей, живущих на NGT-3D и NGM были почти идентичны. Таким образом, кажется, что черви выживают одинаково хорошо в 3D и 2D условиях.
Изготовления NGB-3D также не сложно и должно привести к четкой, агар заполненные культуры бутылки как , что видно на рисунке 2А. Для того, чтобы легко просматривать бактериальные колонии, мы выразили deoxyviolacein, темно - фиолетовый бактериального метаболита 11, в OP50штамм E. coli (Фигуры 2А, 2В; напряжение по запросу). Живые черви могут быть отображены под передачи стерео-рассекает микроскоп (рис 2B, дополнительная Movie 1).
Хранение NGT-3D и NGB-3D при комнатной температуре достаточно для поддержания обоих этих камер культуры до 1 месяца. Десикация агар не является проблемой ни для NGT-3D или NGB-3D, если плагин типа или винтового типа колпачок, который подходит трубку или бутылку наносится.
Рисунок 1: Развитие, плодовитость и продолжительность жизни C. Элеганс , культивируемых в NGT-3D сравнима с таковой стандартного 2D NGM. (А) Изображения NGT-3D нескольких разбавлении бактерий. Левая иправо содержит 5 х 10 -7 размывание а, а середина 1 х 10 -7 разведения. (В) Относительный размер выводка дикого типа червей в NGT-3D до менее 60 OP50 колоний (п = 24), больше или равно 60 колоний (п = 14), или на 2D - NGM пластин (п = 29). Отрезки ошибок указывают на стандартные ошибки. (C) Процент червей F1 поколения в L3, L4 или взрослой стадии развития в NGT-3D с менее чем 60 OP50 колоний, больше или равно 60 колоний, или на 2D NGM пластин. (D) Выживание кривая дикого типа C. Элеганс в NGT-3D или NGM пластин. NS указывает, существенно не отличается рассчитывается лог-рангового. Эта цифра была изменена с Ли 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Визуализация C. Элеганс в 3D с использованием NGB-3D. (A, B) Изображение NGB-3D; (C) Изображения взрослых C. Элеганс вблизи колонии штамма OP50 кишечной палочки , выражающие темно - фиолетовый пигмент deoxyviolacein. Шкала бар составляет 500 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Дополнительное Фильм 1: Взрослый C. Элеганс подойти к E.coli , OP50-violace в колонии в NGB-3D. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Лаборатория выращивания C. Элеганс с использованием классических медиа пластин роста нематода имеет решающее значение для сотен важных открытий , что исследования в C. Элеганс предоставил. Здесь мы представляем новые методы для выращивания C. Элеганс в среде , которая более точно отражает их естественные трехмерные среды обитания. Хотя другие методы были использованы для наблюдения C. Элеганс в 3D 13, это первый протокол , который позволяет выращивать червей в твердой матрице 3D. Эти два метода, показанные здесь, NGT-3D и NGB-3D, позволяют ученым задавать вопросы физической подготовки, развития и роста в 3D культивирования, а также изображения и записывать червей в 3D. Хотя NGT-3D и NGB-3D имеют некоторые отличия от стандартных пластин 2D NGM, они похожи на этот оригинальный метод и только корректируется, чтобы добавить культивирование червя в оси. Таким образом, мы видим, что развитие, рождаемость и продолжительность жизни проходят нормально в наших условиях.цель состояла в том, чтобы создать протокол, что любая лаборатория может использовать для своих исследований. Эти методы очень просты, легко воспроизводимым при очень низкой стоимости, а также позволяют корректировку протоколов с учетом конкретных экспериментов пользователей.
Хотя все шаги в протоколе имеют важное значение, важным шагом в создании NGT-3D и NGB-3D является температура охлаждения агара после автоклавирования в шагах от 3,4 до 3,6 протокола. Если температура охлаждения слишком низка (несколько градусов ниже 40 ° С), агар начнет затвердевать и добавленные растворы не будут должным образом смешивать в агар. Тем не менее, если охлаждение недостаточно (несколько градусов выше 40 ° С), добавленные бактерии могут погибнуть, и добавили раствор холестерина может привести к затемнению агар визуализации агар бесполезным для экспериментов. Кроме того, область предостережения на шаге 4.6. При плавлении NGT-3D агар в водяной бане, убедитесь, чтобы закрыть крышки плотно, чтобы помочь в плавлении. Тем не менее, тепло может привести к томуколпачки до опасно "поп" прочь и стать снарядом. В целях безопасности лучше всего, чтобы покрыть ванну воды. Многие части протокола вполне адаптированы к пользователю. Например, мы использовали четкую пластиковую пробирку для NGT-3D и 25 см 2 ясную бутылку культуры клеток (имеет в общей сложности 65 мл) для NGB-3D. Другие типы прозрачных трубок или бутылок, доступных пользователю также должен работать. Кроме того, рост бактерий регулируется. Штамм E.coli OP50 обычно занимает около недели , чтобы расти , по крайней мере , 1 мм, который был предпочтительным для наших экспериментов. По нашему опыту, немного короче и даже намного более длительное время для роста бактерий, кажется, не влияют на рост червя или фертильность. Регулировка концентрации агара, тем не менее, будет влиять на движение червя. Более низкие концентрации агара приводят к червям, показывая плавательном как движение, и более высокие концентрации могут ингибировать общее движение.
Одной из областей концерна в NGB-3D был вопрос о конденсациии вода накопления. Как затвердевает теплый жидкий агар, неизбежно некоторое сгущение развивается со временем, в частности, на границе раздела бутылки и агар. Это может создать проблемы для червя, который показывает плавание поведения в жидкостях 14 и рост бактерий, которые могут распространяться по всей бутылки жидкостью. Предотвращение конденсации трудно. Существуют две возможные средства для этого. Во-первых, мы уверены, что червь может легко войти в агар, поместив его в центре поверхности агара на горлышке бутылки. Во-вторых, мы намеренно поддерживать концентрацию бактерий в низких NGB-3D, тем самым уменьшая вероятность того, что колонии произрастает на границе раздела жидкости и агар.
Еще одной проблемой является визуализация червей в NGB-3D. Для повышения четкости и качества изображений червей в 3D, колонии должны быть близко к поверхности, но остаются полностью встроен в агар. Мы попытались вырастить только встроенные колонии вблизи surfaCE, помещая тонкий слой бактерий, содержащих агар на поверхности, а остальные носители были без бактерий. Тем не менее, этот вопрос не был полностью решена с помощью этого метода. Вместо этого мы решили произвести много NGB-3D бутылок в одно время, и использовать только те, которые содержат встроенные колонии близко к поверхности, тем самым увеличивая вероятность того, что червь будет двигаться в колонию вблизи поверхности. Одним из вариантов мы не исследовали меняется твердых средах с матрицей, кроме гранулированной агар мы здесь нанимать. Воображение червей в направлении оси Z. также может быть сложной задачей. Мы делаем это вручную поднимать и опускать грубый фокус, но если автоматизированная программа слежения существует для этого, может быть весьма полезным.
Есть надежда на то , что методы , представленные здесь , для выращивания C. Элеганс в 3D будет широко использоваться нематод биологов. Многие остаются вопросы о червячного биологии, включая старение и поведения в 3D, а также то, что ученые наблюдают ли в2D актуальна для червя в 3D. Действительно, предыдущее исследование с использованием NGT-3D показал влияние на репродуктивную пригодность , что 3D культивирование было на сенсорном мутанта, воспроизводящий обычно в 2D условиях 9. Кроме того, одно исследование показало , изменённые поведение движения в 3D по сравнению с 2D 15. Наконец, эта система может быть использована, чтобы начать отвечать на вопросы о том, определенные условия, мутанты или манипуляциях придают пригодности преимущества животному в его родной среде 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана новым Investigator Грант [2014R1A1A1005553] из Национального исследовательского фонда Кореи (NRF) к JIL; и Йонсей будущий лидер Вызова Грант [2015-22-0133] для JIL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 224620 | |
| Sodium chloride | DAEJUNG | 7548-4400 | 58.44 MW |
| Agar, Granulated | Difco | 214530 | |
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Calcium chloride, dihydrate | Bio Basic | CD0050 | 2*H2O; 147.02 MW |
| Cholesterol | Bio Basic | CD0122 | 386.67 MW |
| Ethyl alcohol | B&J | RP090-1 | 99.99%; 46.07 MW |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Bio Basic | MN1988 | 120.37 MW |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous | Bio Basic | PB0445 | 136.09 MW |
| 2'-Deoxy-5-fluorouridine | Tokyo Chemical Industry | D2235 | 246.19 MW |
| Potassium phosphate, dibasic, anhydrous | Bio Basic | PB0447 | 174.18 MW |
| Multi-Purpose Test Tubes | Stockwell Scientific | ST.8570 | 8 ml |
| Test Tube Closures | Stockwell Scientific | ST.8575 | |
| Cell Culture Flask | SPL Lifescience | 70125 | 25 cm2 |
| Research Stereo Microscope | Nikon | SMZ18 | |
| High-Definition Color Camera Head | Nikon | DS-Fi2 | |
| PC-Based Control Unit | Nikon | DS-U3 | |
| NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software | Nikon | MQS32000 |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
- Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
- Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
- Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
- Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056 (2015).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
- Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484 (2013).
- Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
- Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564 (2015).
