Summary
Vi presenterar en enkel metod för att skapa 3D-nematod odlingssystem kallas NGT-3D och NGB-3D. Dessa kan användas för att studera nematod fitness och beteenden i livsmiljöer som är mer liknar naturliga Caenorhabditis elegans miljöer än de vanliga 2D laboratorie C. elegans odlingsplattor.
Protocol
1. Förbered lösningar för NGT-3D och NGB-3D
- Förbered följande sterila lösningar: 1 L av 0,1454 M NaCl-lösning, 1 liter 1 M CaCl2, 1 liter 1 M MgSO 4, lysogeni Broth (LB), 1 liter 1 M KPO4-buffert (108,3 g KH 2 PO 4 och 35,6 g av K 2 HPO 4, och fylla H2O till 1 L). Produktion av NGM att använda dessa lösningar kan hittas i en tidigare protokoll 10.
- Autoklav lösningar vid 121 ° C, 15 min.
- Förbered 50 ml av en steril 5 mg / ml kolesterol-lösning. I ett 50 ml koniskt rör, blanda 0,25 g kolesterol och 50 ml 99,99% etanol och blanda väl. Autoklavera inte. Sterilisera kolesterol lösningen med en 50 ml spruta med en 0,45 fim sprutfilter. Detta kommer också att ta bort eventuella olösta kolesterol.
- (Tillval) Bered 10 ml av en 150 mM 2'-deoxi-5-fluorouridin (FUdR) lager. I en 15 ml koniskt rör, blanda 0,3693 gav FUdR och 10 ml destillerat vatten. Skaka väl.
2. Förbered bakteriekultur för NGT-3D och NGB-3D
- Ympa 10 ml LB-buljong med bakterier. Standard bakterier som används för C. elegans utfodring är E. coli stam OP50.
- Kultur den bakteriella inokulationen vid 37 ° C i en skakinkubator över natten.
- Som en förberedelse för en serieutspädning lika stora 9 ml av NaCl-lösning till sterila 15 ml koniska rör. Till exempel för att portion 9 ml i totalt 7 rör göra en 10 -7 utspädning av OP50 stammen E. coli.
- Med hjälp av en steril 1000 l pipett, pipett 1 ml av bakteriekultur eller utspädd bakteriekultur i den sterila nytt rör med 9 ml NaCl-lösning och skaka 10 ml blandning väl. Upprepa tills önskad bakteriell spädning uppnås.
OBS: Den önskade bakterie utspädning beror på vilken typ och tillstånd av bakterier samt de exakta experimentella betingelser.Till exempel, en 10 -6 - 10 -8 utspädning av OP50 stammen E. coli var tillräcklig för att ge från 1 - 200 bakteriekolonier per 6,5 ml NGT-3D röret. Maskar utvecklas på ett tillförlitligt och reproduceras normalt när antalet kolonier var över 60, som inträffade vid en utspädning av 10 -6 - 10 -7. För NGB-3D, använd en utspädning om 10 -8.
3. Göra NGT-3D och NGB-3D (200 ml)
- Efter beredning av bakteriekultur, blanda 0,6 g NaCl, 1 g granulerad agar och 0,5 g pepton i en 500 ml kolv. Sätt en magnetisk omrörarstav i kolven.
- Lägg 195 ml destillerat vatten och täcka mynningen av kolven med aluminiumfolie.
- Autoklav 121 ° C under 15 min.
- Placera den varma autoklaveras kolven på en uppståndelse tallrik och rör om vid en måttlig hastighet under åtminstone två timmar. Kyl kolven till 40 ° C. Var noga med att svalna tillräckligt som fortsätter härifrån vid höga temperaturer kan leda till grumling av den färdiga agar.Emellertid kan lägre temperaturer resultera i för tidig härdning av agar.
- (Valfritt) För att påskynda kylprocessen, placera kolven i ett 40 ° C vattenbad 15 minuter innan de placeras på en omrörningsplatta.
- När temperaturen hos den agarmedium når 40 ° C, tillsätt 200 | il 1 M CaCl2, 200 | il 5 mg / ml kolesterol-lösning, 200 | il 1 M MgSO 4 och 5 ml 1 M KPO4-buffert som lösningen fortsätter att röra om till slutkoncentrationer av 1 mM CaCl2, 5 | ig / ml kolesterol, 1 mM MgSO 4, 1 mM KPO4.
- (Tillval) För NGT-3D livslängd analys till 80 pl 150 mM FUdR till en slutlig koncentration av 120 iM 12.
- Tillsätt 6 ml av 10 ml utspädd bakteriekultur från steg 2,4 i kolven direkt.
- (Tillval) För NGT-3D, ta bort 6 ml agarmedium före steg 3,6 och hålla den varm separat. Detta media kommer att användas för bakterierna friatoppskikt.
- Med hjälp av sterila förfaranden, fördela materialet i en steril odlingskammare. Se till att luckan i kammaren sluter tätt.
- (Valfritt) För att förhindra bakteriekolonier bildas på den övre ytan av agar, göra ett lager av bakteriefria agar media från steg 3.6.1 ovanpå innan media från steg 3,7 fullständigt hårdnar. Detta kommer att skapa en bakteriefri zon vid toppen av NGT-3D.
- För NGT-3D, häll 6,5 ml medium i 8 ml genomskinlig plast provrör för att göra en bakterie agarskikt och noggrant fördela 200 il av bakteriefria medier på toppen av halvhärdade 3D-media för att göra en tunn bakterie- fritt skikt ovanpå.
- För NGB-3D, häll 65 ml av media i den 25 cm 2 klar plast cellodlingsflaska. Detta belopp ska fylla kroppen av 25 cm 2 cellodling flaska.
- Lämnar kamrarna vertikalt vid rumstemperatur i en vecka för att medge bakteriekolonier att växatill en betydande storlek av minst 1 mm i diameter.
- (Tillval) För livslängd analys i NGT-3D, för att täcka kammare med aluminiumfolie förhindra ljus nedbrytning av FUdR.
4. Mät Fitness av Worm Population på NGT-3D (relativ Brood Storlek Assay)
- Välj en L4 scenen mask med hjälp av en platinatråd plocka och överföring på en bakteriefritt NGM platta. Låt masken att röra sig fritt runt i några minuter för att avlägsna bakterier kopplade till kroppen.
- Upprepa steg 4,1 och se till att masken är fri från bakterier. Generellt två upprepningar av 4,1 är tillräckligt.
- Placera försiktigt ren masken på ytan av 3D-media med en platinatråd plockning. Masken bör så småningom in i agar i 3D agar matrisen.
- Stäng locket löst låta någon luft att komma in i röret, men förhindrar torkning av agar media.
- Inkubera i 96 h vid 20 ° C.
- Efter 4 dagar, stänga locken tätt och placeraNGT-3D odlingskammare i en 88 ° C vattenbad för att smälta agar. Värmen dödar maskar men deras kroppar förblir intakta.
OBS: Om du använder 8 ml rör för NGT-3D, 20 - är vanligtvis tillräcklig 30 min inkubation. - Med hjälp av en glaspipett, överföra smälta media på en 9 cm plast petriskål. Plastpipetter rekommenderas inte, eftersom maskar ofta kan hålla sig till dem.
- Med användning av ett transmissionsstereo dissektionsmikroskop, räkna antalet maskar vid L3, L4, och vuxna stadier. Räkna inte maskar som är L2 scenen och yngre, som F1 och F2 generationer kan förväxlas här. Sålunda är denna analys en relativ assay kull storlek snarare än en total kull storleksanalys.
5. Bild och Record Worm Beteende på NGB-3D
- Välj en L4 scenen mask med hjälp av en platinatråd välja och ta bort alla bakterier som fastnat på ytan genom att överföra till ett bakteriefritt NGM platta och gör det möjligt att röra sig fritt för några minuter.
- Upprepa steg 5,1 för att säkerställa att worm är fri från bakterier.
- Placera försiktigt ren masken på mitten av agarytan av NGB-3D nära flaskans hals med en platinatråd plockning. Masken bör så småningom in i agar i 3D agar matrisen.
- Stäng locket löst låta någon luft att komma in i röret, samtidigt förhindra torkning av agar media.
- Bild eller spela in masken enligt en överförings stereo dissekera mikroskop. Justera fokus som masken rör sig genom 3D-matrisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruktionen av NGT-3D är en enkel och okomplicerad protokoll som resulterar i en agar-fyllda provröret med små bakteriekolonier fördelade genom hela agar (Figur 1A). Maskar kan röra sig fritt genom agar matris, hitta och konsumera bakteriekolonier. För att bekräfta om C. elegans kan föröka sig och växa normalt i NGT-3D, jämförde vi fertilitet och larvutveckling i 3D med standard 2D NGM plattor. I den relativa kull storleksanalys, vuxen C. elegans hermafroditer i NGT-3D återge lika bra som hermafroditer i standard 2D NGM plattor när bakteriekolonier är rikligt med minst 60 kolonier (Figur 1B). Dessutom larvutveckling i NGT-3D fortsätter också normalt när det finns gott om bakteriekolonier med de flesta av maskar i vuxen tillstånd efter 96 timmar (Figur 1C). Om emellertid bakteriekolonier är glesi 3D-matrisen, både relativ grubbla storlek (Figur 1B, vänster bar) och larvutveckling (Figur 1C, vänstra bar) negativt.
För att testa om boning i 3D har någon effekt på den långsiktiga fysiologi masken, genomförde vi en livslängd analys som jämför NGT-3D och NGM plattor. Den genomsnittliga livslängden för maskar på NGT-3D var 15,6 ± 3,6 dagar jämfört med 14,8 ± 3,1 dagar för standard NGM tallrikar. Livslängden kurvor för maskar som lever på NGT-3D och NGM var nästan identiska. Således verkar det som om maskar överleva lika bra i 3D och 2D villkor.
Tillverkning av NGB-3D är inte heller svårt och bör resultera i en klar, agar-fyllda odlingsflaska som den som ses i figur 2A. För att enkelt se bakteriekolonier, har vi uttryckt deoxyviolacein, en mörklila bakteriellt metabolit 11, i OP50stammen E. coli (figurerna 2A, 2B, stam tillgänglig på begäran). Levande maskar kan avbildas under ett transmissions stereo-dissektionsmikroskop (figur 2B, Supplemental Movie 1).
Lagring av NGT-3D och NGB-3D vid rumstemperatur är tillräcklig för att bibehålla båda dessa kulturkammare i upp till en månad. Uttorkning av agar inte är ett bekymmer för antingen NGT-3D eller NGB-3D om en plug-typ eller av skruvtyp lock som passar röret eller flaskan anbringas.
Figur 1: Utveckling, fertilitet och livslängd C. elegans som odlas i NGT-3D är jämförbar med den hos standard 2D NGM. (A) Bilder från NGT-3D vid flera utspädningar av bakterier. vänster ochhöger innehåller en 5 x 10 -7 utspädning, och i mitten är en 1 x 10 -7 utspädning. (B) Relativ kull storlek vildtyp maskar i NGT-3D till färre än 60 OP50 kolonier (n = 24), större eller lika med 60 kolonier (n = 14), eller på 2D NGM plattor (n = 29). Felstaplar indikerar standardfel. (C) Procent av F1-generationen maskar i L3, L4 eller en vuxen utvecklingsstadium i NGT-3D med färre än 60 OP50 kolonier, som är större än eller lika med 60 kolonier, eller på 2D NGM plattor. (D) överlevnadskurvan av vild-typ C. elegans i NGT-3D eller NGM plattor. NS indikerar ingen signifikant skillnad beräknas genom log-rank test. Denna siffra har ändrats från Lee 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Imaging C. elegans i 3D med hjälp av NGB-3D. (A, B) Bilder från NGB-3D; (C) Bilder av vuxna C. elegans i närheten av en koloni av OP50 stammen E. coli som uttrycker mörklila pigment deoxyviolacein. Skala bar är 500 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Movie 1: Vuxen C. elegans närma sig en E. coli OP50-violace i kolonin i NGB-3D. Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laboratoriet odling av C. elegans med hjälp av klassiska nematod tillväxtmedieplattorna var avgörande för de hundratals viktiga upptäckter som forskning i C. elegans har gett. Här presenterar vi nya metoder för att odla C. elegans i en miljö som bättre speglar deras naturliga tredimensionella miljöer. Även om andra metoder har använts för att observera C. elegans i 3D 13, är detta det första protokollet som tillåter odling av maskar i en fast 3D matris. De två metoderna som visas här, NGT-3D och NGB-3D, hjälper forskarna att ställa frågorna om lämplighet, utveckling och tillväxt i 3D-odling, samt bild- och registrera maskar i 3D. Även NGT-3D och NGB-3D har vissa skillnader i standard 2D NGM plattor, de liknar denna ursprungliga metoden och endast justeras för att lägga mask odling i z-axeln. Således finner vi att utveckling, fertilitet och livslängd fortsätta normalt i våra villkor. DeMålet var att skapa ett protokoll som varje laboratorium kan använda för sin forskning. Dessa metoder är mycket enkel, lätt reproducerbar på en mycket låg kostnad, och möjliggöra justering av protokoll för att passa användarnas specifika experiment.
Även om alla stegen i protokollet är viktiga, är det kritiska steget i att göra NGT-3D och NGB-3D kyltemperaturen av agar efter autoklavering i steg 3.4 till 3.6 i protokollet. Om temperaturen svalnar alltför låga (flera grader under 40 ° C), kommer agar börja härda och de tillsatta lösningarna kommer inte blandas ordentligt i agar. Om kylningen är otillräcklig (flera grader över 40 ° C), kan de tillsatta bakterierna dör och den extra kolesterol lösning kan imma agar gör agar oanvändbar för experiment. Dessutom är ett område med försiktighet i steg 4,6. När smälta NGT-3D agar i vattenbadet, se till att stänga locken tätt för att underlätta smältningen. Emellertid kan värmen orsaka attcaps till farligt "pop" off och bli en projektil. Av säkerhetsskäl är det bäst att täcka vattenbadet. Många delar av protokollet är helt anpassningsbara för användaren. Till exempel har vi använt en klar plast provrör för NGT-3D och en 25 cm 2 klar cellodlingsflaska (rymmer totalt 65 ml) för NGB-3D. Andra typer av klara rör eller flaskor tillgängliga för användaren bör också fungera. Dessutom är bakterietillväxt justerbar. E. coli stam OP50 tar i allmänhet ungefär en vecka för att växa till minst 1 mm, vilket föredrogs för våra experiment. I vår erfarenhet, gör något kortare och ännu mycket längre tillväxttider för bakterierna inte tycks påverka mask tillväxt eller fertilitet. Justering av agarkoncentration emellertid kommer att påverka snäck rörelse. Lägre koncentrationer av agar resultera i maskar visar en swimming-liknande rörelse, och högre koncentrationer kan hämma totala rörelse.
Ett problemområde i NGB-3D var frågan om kondensoch vatten samlas. Som den varma vätskan agar hårdnar, oundvikligen en del kondens utvecklas över tiden, särskilt vid gränsytan av flaskan och agar. Detta kan innebära problem för masken, som visar simning beteenden i vätskor 14 och tillväxten av bakterier, som kan spridas över hela flaskan av vätskan. Förebyggande av kondensation är svårt. Två möjliga lösningar finns för detta. Först, ser vi till att masken enkelt kan komma in i agar genom att placera den i centrum av agarytan på flaskans hals. För det andra, vi avsiktligt hålla koncentrationen av bakterier med låg NGB-3D och därmed minska risken för att en koloni växer vid gränsytan mellan vätska och agar.
Ett annat bekymmer är avbildning av maskar i NGB-3D. För att öka tydligheten och kvaliteten på bilder av maskar i 3D, bör kolonier vara nära ytan men fortfarande helt inbäddad i agar. Vi försökte att växa endast inbäddade kolonier nära surface genom att placera ett tunt lager av bakterieinnehållande agar vid ytan, och de återstående media var bakteriefria. Dock frågan inte helt löst genom denna metod. I stället beslutade vi att producera många NGB-3D flaskor på en gång, och endast använda de som innehåller inbäddade kolonier nära ytan, vilket ökar risken för att en mask kommer att flytta till en koloni nära ytan. Ett alternativ vi har inte undersökt förändras de fasta media till en annan än den granulerade agar vi använder här matris. Avbildning maskar i z-axelriktningen kan också vara en utmaning. Vi gör detta genom att manuellt höja och sänka den grova fokus, men om en automatiserad tracking-program existerar för detta, kan det vara ganska bra.
Förhoppningen är att de tekniker som presenteras här för odling av C. elegans i 3D kommer att i stor utsträckning av nematoder biologer. Många frågor kvarstår om masken biologi, inklusive åldrande och beteenden i 3D, och om vad forskarna observera i2D är relevant för masken i 3D. Faktum är att en tidigare studie med NGT-3D visade påverkan på reproduktions lämplighet att 3D odling hade på en sensorisk mutant som återger normalt 2D villkor 9. Dessutom visade en studie förändrade rörelsebeteenden i 3D jämfört med 2D 15. Slutligen kan detta system användas för att börja svara på frågor av huruvida vissa villkor, mutanter eller manipulationer ger fitness fördelar till djuret i dess nativa 3D-miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett nytt Investigator Grant [2014R1A1A1005553] från National Research Foundation of Korea (NRF) till JIL; och en Yonsei University Future Leader Challenge Grant [2015-22-0133] till JIL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 224620 | |
| Sodium chloride | DAEJUNG | 7548-4400 | 58.44 MW |
| Agar, Granulated | Difco | 214530 | |
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Calcium chloride, dihydrate | Bio Basic | CD0050 | 2*H2O; 147.02 MW |
| Cholesterol | Bio Basic | CD0122 | 386.67 MW |
| Ethyl alcohol | B&J | RP090-1 | 99.99%; 46.07 MW |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Bio Basic | MN1988 | 120.37 MW |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous | Bio Basic | PB0445 | 136.09 MW |
| 2'-Deoxy-5-fluorouridine | Tokyo Chemical Industry | D2235 | 246.19 MW |
| Potassium phosphate, dibasic, anhydrous | Bio Basic | PB0447 | 174.18 MW |
| Multi-Purpose Test Tubes | Stockwell Scientific | ST.8570 | 8 ml |
| Test Tube Closures | Stockwell Scientific | ST.8575 | |
| Cell Culture Flask | SPL Lifescience | 70125 | 25 cm2 |
| Research Stereo Microscope | Nikon | SMZ18 | |
| High-Definition Color Camera Head | Nikon | DS-Fi2 | |
| PC-Based Control Unit | Nikon | DS-U3 | |
| NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software | Nikon | MQS32000 |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Cutter, A. D.
- Brenner, S.
- Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
- Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
- Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
- Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
- Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056 (2015).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
- Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484 (2013).
- Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
- Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564 (2015).
