Summary
我々はNGT-3DとNGB-3Dと呼ばれる3D線虫の栽培システムを構築するための簡単な方法を提示します。これらは、標準的な2D実験室のC.エレガンス培養プレートより自然な線虫（Caenorhabditis elegans）の生息地に類似している生息地における線虫のフィットネスや行動を研究するために使用することができます。
Protocol
1. NGT-3DとNGB-3Dのためのソリューションを準備
- 0.1454 M NaCl溶液1 L、1 MのCaCl 2、1MのMgSO 4、溶原性ブロス（LB）、KH 2の1 M KPO 4緩衝液（108.3グラムの1 Lの1 Lの1 L：以下の無菌溶液を準備しますK 2 HPO 4のPO 4 35.6 gであり、1 LにH 2 Oを充填します）。これらのソリューションを使用してNGMの生産は以前のプロトコル10で見つけることができます。
- 121℃、15分のオートクレーブソリューション。
- 無菌の5mg / mlのコレステロール溶液50mlを準備します。 50ミリリットルの円錐管では、コレステロールの0.25グラムと99.99％のエタノール50mlを混合し、よく混ぜます。 オートクレーブしないでください 。 0.45μmのシリンジフィルターで50mlの注射器を用いてコレステロール溶液を滅菌します。これはまた、任意の溶解していないコレステロールを除去します。
- 2'-デオキシ-5-フルオロ（FUDR）株式の150 mMのの10ミリリットルを用意（オプション）。 15ミリリットルコニカルチューブでは、0.3693グラムを混ぜますFUDRおよび蒸留水10mlを。よくまぜろ。
2. NGT-3DとNGB-3Dのための細菌培養を準備
- 細菌と10mlのLBブロスに接種。 C.エレガンス供給のために使用される標準的な細菌は、 大腸菌株OP50です。
- 文化一晩振とう培養器で37℃で細菌接種。
- 連続希釈の準備のために、滅菌した15ミリリットルコニカルチューブにNaCl溶液のアリコート9ミリリットル。例えば、7チューブの合計に一定分量9mlをOP50株大腸菌の10 -7希釈を行います。
- NaCl溶液の9ミリリットルで、無菌の新しいチューブに無菌千μlのピペット、ピペット1mlの細菌培養物または希釈した細菌培養物を使用して、よく10ミリリットルの混合物をボルテックス。目的の細菌の希釈が達成されるまで繰り返します。
注：希望の細菌希釈タイプと条件細菌のと同様に、正確な実験条件に依存します。例えば、10 -6 - 6.5ミリリットルNGT-3Dのチューブ当たり200細菌コロニー- OP50株大腸菌の10 -8希釈は1から生成するのに十分でした。 10 -7 -コロニーの数は60を超えていたとき、ワームは、10 -6の希釈で発生し、確実に開発され、正常に再生しました。 NGB-3Dの場合は、10 -8の希釈を使用します。
3.メイキングNGT-3DとNGB-3D（200ミリリットル）
- 細菌培養物を準備した後、0.6グラムのNaCl、1グラムの造粒寒天、および500mlのフラスコ内の0.5グラムペプトンを混ぜます。フラスコに磁気攪拌棒を挿入します。
- 195ミリリットルに蒸留水を加え、アルミホイルでフラスコの口をカバーしています。
- 15分間121℃でオートクレーブ。
- 撹拌プレート上にホットオートクレーブ処理フラスコを置き、少なくとも2時間、中程度の速度で攪拌します。 40℃にフラスコを冷却します。完成した寒天の曇りにつながる可能性があり、ここで、高温でから継続して十分に冷却するようにしてください。しかしながら、より低い温度は、寒天の早期硬化をもたらすことができます。
- 撹拌プレート上に配置する前に、40℃の水浴で15分間でフラスコを置き、冷却プロセスをスピードアップする（オプション）。
- 寒天培地の温度が40℃に達したとき、溶液を攪拌し続けるように、200μlの1 MのCaCl 2、5 mg / mlでのコレステロール溶液200μl、200μlの1 MのMgSO 4および5 mlの1 M KPO 4緩衝液を加えます1mMのCaCl 2を、5μg/ mlのコレステロール、1mMのMgSO 4を、1 mMのKPO 4の最終濃度まで。
- NGT-3Dの寿命アッセイのために（オプション）120μM12の最終濃度に150mMのFUDRの80μlを添加します。
- 直接フラスコにステップ2.4からの細菌培養物を希釈した10ミリリットルの6ミリリットルを追加します。
- （オプション）NGT-3Dの場合は、ステップ3.6前の寒天培地の6ミリリットルを削除し、別にそれを暖かく保ちます。このメディアが使用されます細菌フリー上層。
- 滅菌手順を使用して、無菌培養室にメディアを分配します。チャンバーのカバーがしっかりと閉じていることを確認します。
- ステップ3.7からのメディアが完全に硬化する前に、上のステップ3.6.1から細菌を含まない寒天培地の層を作る、寒天の上面に形成されるの細菌コロニーを防止するために、（オプション）。これはNGT-3Dの上部にある細菌フリーゾーンを作成します。
- NGT-3Dの場合は、細菌の寒天層を作り、そして慎重に薄いbacteria-を作るために半硬化3Dメディアの上に細菌を含まない培地200μlのを分配するために8ミリリットル透明なプラスチック製試験管に6.5ミリリットルのメディアを注ぎます上部の自由層。
- NGB-3Dの場合は、25cm 2の透明なプラスチックの細胞培養瓶にメディアの65ミリリットルを注ぎます。この量は、25cm 2の細胞培養ボトルのボディを埋める必要があります。
- 細菌コロニーが成長できるようにするために、室温で1週間垂直室を残します少なくとも直径1mmのかなりの大きさ。
- （オプション）NGT-3Dで寿命アッセイのために、FUDRの光劣化を防止するために、アルミホイルでチャンバーをカバーしています。
NGT-3D（相対同腹サイズアッセイ）上でワームの人口の4メジャーフィットネス
- ピックや細菌フリーNGMプレート上の転送白金線を使用して、L4段ワームを選びます。ワームは自由に体に付着した細菌を除去するために、数分間に移動できるようにします。
- ステップ4.1を繰り返して、このワームは細菌から自由であることを確認してください。一般的に、4.1の2反復が十分にあります。
- 慎重に白金線ピックで3Dメディアの表面にきれいなワームを置きます。ワームは、最終的には3D寒天マトリックス中に寒天を入力する必要があります。
- ゆるくいくつかの空気がチューブに入るためにできるようにカバーを閉じますが、寒天培地の乾燥を防止します。
- 20℃で96時間インキュベートします。
- 4日後、しっかりと蓋を閉じて置きます88℃の水浴にNGT-3D培養チャンバは、寒天を融解します。熱は虫を殺すが、自分の体はそのまま残ります。
注：NGT-3Dのための8ミリリットルのチューブを使用して、20から30分間のインキュベーションは、通常は十分です。 - ガラスピペットを使用して9センチプラスチックシャーレ上に溶融したメディアを転送します。ワームは、多くの場合、それらに固執することができますようにプラスチックピペットは、お勧めされていません。
- 送信立体解剖顕微鏡を用いて、L3、L4でワーム、および成体段階の数を数えます。 F1及びF2世代はここで混乱することができますように、L2ステージと若いワームをカウントしないでください。したがって、このアッセイは、相対的なひなサイズ分析ではなく、合計ひなサイズのアッセイです。
5.イメージとNGB-3Dでの録音ワームの動作
- 白金線を使用して、L4段ワームをピックし、細菌フリーNGMプレートに移し、それが自由に数分間移動させることにより、表面に付着した細菌を除去します。
- インクルードをめざし確実にする手順を繰り返し5.1rmが細菌から自由です。
- 慎重に白金線ピックと瓶の首に近いNGB-3Dの寒天表面の中央にきれいなワームを配置します。ワームは、最終的には3D寒天マトリックス中に寒天を入力する必要があります。
- 寒天培地の乾燥を防止しながら、緩やかにいくつかの空気がチューブに入るためにできるようにカバーを閉じます。
- 画像または伝送ステレオ解剖顕微鏡下でワームを記録。ワームが3Dマトリックスを通って移動するようにフォーカスを調整します。
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Representative Results
NGT-3Dの建設は、寒天（ 図1A）全体に間隔をあけ小さな細菌コロニーを寒天で満たされた試験管になり、シンプルで簡単なプロトコルです。ワームは自由に細菌コロニーを発見し、消費し、寒天マトリックスを通って移動することができます。 C.エレガンスが再現し、NGT-3Dで正常に成長できるかどうかを確認するために、我々は標準的な2D NGMプレートで3Dで不妊治療や幼虫の発育を比較しました。相対ひなサイズのアッセイでは、成人のC.は NGT-3Dで雌雄同体はちょうど同様に細菌コロニーは、少なくとも60個のコロニー（ 図1B）と豊富で、標準的な2D NGMプレートで雌雄同体を再現エレガンス 。また、NGT-3Dで幼虫の開発も96時間（ 図1C）後の大人の状態でのワームの大半は細菌コロニーがたくさんあるときに通常進みます。しかし、細菌コロニーが疎である場合に3Dマトリックス中に、相対的なひなサイズ（ 図1B、左のバー）と幼虫の発育（ 図1C、左のバー）の両方がマイナスの影響を受けています。
3Dでの居住がワームの長期的な生理学上の任意の効果を持っているかどうかを検証するために、我々はNGT-3DとNGMプレートを比較寿命試験を行いました。 NGT-3Dにワームの平均寿命は、標準的なNGMプレートのための14.8±3.1日と比較して15.6±3.6日でした。 NGT-3DとNGMに住んでいるワームのための寿命曲線はほぼ同一でした。したがって、ワームは、3Dと2Dの条件で等しく良好に生き残るようです。
NGB-3Dを製造することも難しいことではありませんし、 図2Aに見られるような明確な、寒天を充填した培養瓶をもたらすべきです。簡単に細菌コロニーを表示するには、我々はOP50で、deoxyviolacein、濃い紅色細菌の代謝物11を表明しています大腸菌株（ 図2A、2B、リクエストに応じてご利用いただけ株）。ライブワーム送信立体解剖顕微鏡（ 図2B、 補足の動画1）の下で撮像することができます。
室温でNGT-3D及びNGB-3Dの記憶は、最大1ヶ月間、これらの培養チャンバの両方を維持するのに十分です。チューブまたはボトルに合うプラグ型又はスクリュー型キャップが適用される場合、寒天の乾燥はNGT-3DまたはNGB-3Dのいずれかのための問題ではありません。
図1：NGT-3D で栽培 C.エレガンス の開発、生殖能力と寿命は 標準2D NGMのそれに匹敵します。 （A）細菌のいくつかの希釈でNGT-3Dの画像。左と右の5×10 -7希釈が含まれており、中央が1×10 -7希釈です。 60個未満のOP50コロニーへ（B）NGT-3Dで野生型ワームの相対的なひなサイズ（N = 24）、より大きいまたは60個のコロニー（N = 14）に等しい、または2D NGMプレート上（N = 29）。エラーバーは標準誤差を示します。以上60コロニーに等しい、または2D NGMプレート上に60個未満のOP50コロニー、とNGT-3DでL3、L4、大人の発達段階でのF1世代のワーム（C）パーセント。 （D）NGT-3DまたはNGMプレートで野生型のC.エレガンスの生存曲線。 NSは、有意に異なったログランク検定により計算されていない示します。この図は、イ・9から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：NGB-3D を使用して3Dでの イメージング C.エレガンス 。 NGB-3Dの（A、B）画像。濃い紫色の色素deoxyviolaceinを表現OP50株大腸菌のコロニー近くの大人エレガンスの（C）画像。スケールバーは500μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足ムービー1：大人エレガンスが NGB-3Dでコロニーで大腸菌 OP50-violaceに近づきます。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
古典的な線虫の増殖培地プレートを使用して、 線虫の実験室での栽培は、 線虫の研究が提供していることが重要な発見の数百に非常に重要でした。ここで、我々はより正確に自然な立体生息環境を反映している環境で、 線虫を育成する新たな方法を提示します。他の方法は、3D 13の線虫を観察するために使用されているが、これは、固体三次元マトリックスにワームの栽培を可能にする最初のプロトコルです。ここに示されている二つの方法、NGT-3DとNGB-3Dは、科学者が3D栽培でフィットネス、発展と成長の質問をし、また、画像や3Dでワームを記録することができます。 NGT-3DとNGB-3Dは、標準的な2D NGMプレートにいくつかの違いがありますが、彼らはこのオリジナルの方法と同様であり、唯一のz軸にワーム栽培を追加するように調整します。したがって、我々は、開発、生殖能力と寿命が私たちの条件で正常に進行していることを見つけます。ザ目標は、任意の研究室が自分の研究のために使用することができるプロトコルを作成することでした。これらの方法は、非常に低コストで容易に再現、非常に簡単であり、ユーザの特定の実験に合わせてプロトコルの調整を可能にします。
プロトコルのステップのすべてが重要であるが、NGT-3DとNGB-3Dを作る上で重要なステップは、プロトコルの3.6にステップ3.4でオートクレーブ後の寒天の冷却温度です。温度は（40℃以下に数度）が低すぎるを冷却する場合は、寒天が硬化し始め、追加のソリューションは、寒天の中に適切に混在させることはできません。冷却が不十分（40°C以上の数度）である場合には、追加された細菌が死ぬかもしれ、コメントを追加しましたコレステロール溶液は実験のための無駄な寒天をレンダリング寒天を曇らせることがあります。また、注意の面積は、ステップ4.6です。水浴中でNGT-3D寒天を溶融すると、溶融を支援するためにしっかりと蓋を閉じてください。しかし、熱が発生する可能性があります危険なオフ "ポップ"と発射になるためのキャップ。安全のためには、水浴をカバーするのが最善です。プロトコルの多くの部分は、ユーザーには非常に適応可能です。例えば、我々はNGT-3Dのための明確なプラスチック製の試験管とNGB-3D用の25cm 2の明確な細胞培養瓶を（65ミリリットルの合計を保持している）を使用しています。ユーザが利用可能な明確なチューブやボトルの他のタイプも動作するはずです。また、細菌の増殖は調整可能です。 大腸菌株OP50は、一般的に私たちの実験のために好まれた少なくとも1ミリメートル、に成長すると一週間ほどかかります。我々の経験では、細菌のため若干短く、さらにははるかに長い成長時間はワームの成長や生殖能力に影響を与えていないように見えます。寒天濃度の調整は、しかし、ワームの動きに影響を与えます。寒天のより低い濃度は、水泳のような動きを示すワームになり、そしてより高い濃度は、全体の動きを阻害することができます。
NGB-3Dでの懸念の1つの領域は結露の問題でしたそして、水の蓄積。暖かい液体寒天が硬化するように、必然的にいくつかの結露は、特にボトルや寒天の界面で、時間をかけて開発しています。これは、水泳用液体14で行動や液体によってボトル全体に広がることができる細菌の増殖を、示しているワームのための問題を提起することができます。結露を防止することが困難です。二つの可能な救済は、このために存在します。まず、ワームが簡単にボトルの首に寒天表面の中心に置くことで、寒天を入力することができることを確認してください。第二に、我々は意図的にそれによってコロニーは、液体と寒天との界面に成長する機会を減少させる、NGB-3Dで低細菌の濃度を保ちます。
もう一つの懸念は、NGB-3Dでワームのイメージングです。 3Dでワームの画像の明瞭性と品質を向上させるために、コロニーは表面に近いことが、完全に寒天中に埋め込まれたままであるべきです。私たちは、surfaの近くにのみ埋め込まれたコロニーを成長しようとしました表面の細菌を含む寒天の薄層を配置することにより、CE、および残りのメディアが細菌無料でした。しかし、問題は完全には、この方法によって解決されませんでした。代わりに、我々は、一度に多くのNGB-3Dのボトルを生産し、表面に近い埋め込まれたコロニーが含まれているものだけを使用し、それによって、ワームは表面付近の植民地に移動する可能性を増加させることにしました。我々が調査していません1つのオプションは、我々がここで採用した造粒寒天以外の行列に固形培地を変えています。 z軸方向にワームを撮像することも困難なことができます。我々は、手動で粗いフォーカスを昇降させることによってこれを行うが、自動追跡プログラムは、このために存在する場合、それは非常に役に立つかもしれません。
希望は3DでC.エレガンスの栽培のためにここに示す手法が広く線虫の生物学者によって使用されるということです。多くの疑問が高齢化し、3Dでの行動を含め、ワームの生物学についてのままであり、科学者がで観察するものかどうか2Dは3Dでワームに関連します。実際、NGT-3Dを用いた以前の研究は、3D栽培が2D条件9で正常に再生する感覚変異体であったことを生殖適応度への影響を示しました。さらに、1つの研究では、2D 15に比べて3Dで変更された動きの挙動を示しました。最後に、このシステムは、特定の条件、変異体または操作は、その天然の3D環境で動物にトレーニング利点を与えるかどうかの質問に答えるために開始するために使用することができます。
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Acknowledgments
この作品は、韓国国立研究財団（NRF）からJILへの新しい研究者グラント【2014R1A1A1005553]によってサポートされていました。 [2015-22-0133] JILへと延世大学の未来のリーダーチャレンジグラント
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 224620 | |
| Sodium chloride | DAEJUNG | 7548-4400 | 58.44 MW |
| Agar, Granulated | Difco | 214530 | |
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Calcium chloride, dihydrate | Bio Basic | CD0050 | 2*H2O; 147.02 MW |
| Cholesterol | Bio Basic | CD0122 | 386.67 MW |
| Ethyl alcohol | B&J | RP090-1 | 99.99%; 46.07 MW |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Bio Basic | MN1988 | 120.37 MW |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous | Bio Basic | PB0445 | 136.09 MW |
| 2'-Deoxy-5-fluorouridine | Tokyo Chemical Industry | D2235 | 246.19 MW |
| Potassium phosphate, dibasic, anhydrous | Bio Basic | PB0447 | 174.18 MW |
| Multi-Purpose Test Tubes | Stockwell Scientific | ST.8570 | 8 ml |
| Test Tube Closures | Stockwell Scientific | ST.8575 | |
| Cell Culture Flask | SPL Lifescience | 70125 | 25 cm2 |
| Research Stereo Microscope | Nikon | SMZ18 | |
| High-Definition Color Camera Head | Nikon | DS-Fi2 | |
| PC-Based Control Unit | Nikon | DS-U3 | |
| NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software | Nikon | MQS32000 |
References
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