Summary
Se presenta un método sencillo de construir sistemas de cultivo de nematodos 3D llamados NGT-3D y NGB-3D. Éstos se pueden utilizar para estudiar la aptitud de los nematodos y los comportamientos en los hábitats que son más similares a los naturales Caenorhabditis elegans hábitats que las placas de cultivo estándar en 2D elegans C. laboratorio.
Protocol
1. Preparar soluciones para NGT-3D y 3D-NGB
- Preparar las siguientes soluciones estériles: 1 L de solución 0,1454 M de NaCl, 1 L de 1 M CaCl 2, 1 L de 1 M MgSO 4, Lisogenia Broth (LB), 1 L de 1 M KPO 4 tampón (108,3 g de KH 2 PO 4 y 35,6 g de K 2 HPO 4, y llenar H2O hasta 1 l). La producción de NGM el uso de estas soluciones se pueden encontrar en un protocolo anterior 10.
- soluciones autoclave a 121 ° C, 15 min.
- Preparar 50 ml de una solución estéril 5 mg / ml de colesterol. En un tubo cónico de 50 ml, mezclar 0,25 g de colesterol y 50 ml de 99,99% de etanol y se mezcla bien. No esterilizar en autoclave. Esterilizar la solución colesterol usando una jeringa de 50 ml con un filtro de jeringa de 0,45 micras. También se eliminará cualquier colesterol no disuelto.
- (Opcional) Preparar 10 ml de una 150 mM de 2'-desoxi-5-fluorouridina (FUdR) stock. En un tubo cónico de 15 ml, mezclar 0,3693 gde FUdR y 10 ml de agua destilada. Agitar bien.
2. Preparar Cultura de las bacterias para NGT-3D y 3D-NGB
- Inocular 10 ml de caldo LB con bacterias. Las bacterias habituales utilizados para la alimentación de C. elegans es E. coli cepa OP50.
- Cultura de la inoculación de bacterias a 37 ° C en una incubadora con agitación durante la noche.
- En la preparación para una dilución en serie, alícuotas 9 ml de la solución de NaCl en 15 ml tubos cónicos estériles. Por ejemplo, parte alícuota de 9 ml en un total de 7 tubos para hacer una dilución 10 -7 de la cepa OP50 E. coli.
- Usando una pipeta estéril 1,000 l, pipetear 1 ml de cultivo bacteriano o un cultivo bacteriano diluido en el nuevo tubo estéril con 9 ml de solución de NaCl y agitar bien la mezcla de 10 ml. Repita hasta que se alcanza la dilución bacteriana deseada.
NOTA: La dilución bacteriana deseada depende del tipo y condición de bacterias, así como las condiciones experimentales exactas.Por ejemplo, un 10 -6 - dilución de la cepa de E. coli OP50 10 -8 era suficiente para producir a partir de 1 - 200 colonias por 6,5 ml tubo NGT-3D. Worms fiable desarrollan y se reproducen normalmente cuando el número de colonias era más de 60, que se produjo a una dilución de 10 -6-10 -7. Para NGB-3D, utilizar una dilución de 10 -8.
3. Hacer NGT-3D y 3D-NGB (200 ml)
- Después de la preparación del cultivo bacteriano, la mezcla 0,6 g de NaCl, 1 g de agar granulado, y 0,5 g de peptona en un matraz de 500 ml. Insertar una barra de agitación magnética en el matraz.
- Añadir 195 ml de agua destilada y cubrir la boca del matraz con papel de aluminio.
- Autoclave 121 ° C durante 15 min.
- Colocar el matraz en autoclave caliente sobre una placa de agitación, y se agita a una velocidad moderada durante al menos 2 horas. Se enfría el matraz a 40 ° C. Asegúrese de que se enfríe lo suficiente como para continuar de aquí a altas temperaturas puede dar lugar a pérdida de transparencia del agar acabado.Sin embargo, temperaturas más bajas pueden resultar en el endurecimiento prematuro de la agar.
- (Opcional) Para acelerar el proceso de enfriamiento, colocar el matraz en un baño de agua a 40 ° C 15 min antes de colocar sobre una placa de agitación.
- Cuando la temperatura de los medios de agar alcanza 40 ° C, añadir 200 l 1 M CaCl 2, 200 l de solución de colesterol 5 mg / ml, 200 l 1 M MgSO 4 y 5 ml 1 M KPO 4 tampón como la solución sigue agitar a concentraciones finales de 1 mM CaCl colesterol 2, 5 mg / ml, 1 mM MgSO 4, 1 mM KPO 4.
- (Opcional) Para el ensayo de vida útil NGT-3D añaden 80 l de FUdR 150 mM a una concentración final de 120 mM 12.
- Añadir 6 ml de los 10 ml de cultivo bacteriano diluido a partir del paso 2.4 en el matraz directamente.
- (Opcional) Para NGT-3D, retire 6 ml de medio de agar antes del paso 3.6 y mantenerlo caliente por separado. Este medio se utiliza para los libre de bacteriascapa superior.
- El uso de procedimientos estériles, prescindir de los medios de comunicación en una cámara de cultivo estéril. Asegúrese de que la cubierta de la cámara se cierra herméticamente.
- (Opcional) Para prevenir la formación de colonias de bacterias de la superficie superior de la agar, hacer una capa de libre de bacterias medios de agar de la etapa 3.6.1 en la parte superior antes de los medios de comunicación desde el paso 3.7 se endurece por completo. Esto creará una zona libre de bacterias en la parte superior de la NGT-3D.
- Para NGT-3D, verter 6,5 ml de medio a los 8 ml tubos de ensayo de plástico transparente para hacer una capa de agar bacterias, y dispensar cuidadosamente 200 l de los medios de comunicación libre de bacterias en la parte superior de los medios de comunicación semi-endurecido 3D para hacer una fina bacterias- capa libre en la parte superior.
- Para NGB-3D, verter 65 ml de medio a los 25 cm de botella de cultivo de células de plástico transparente 2. Esta cantidad debe llenar el cuerpo de la 25 cm botella de cultivo 2 celular.
- Deja cámaras verticalmente a temperatura ambiente durante una semana para permitir que las colonias bacterianas que crecena un tamaño considerable de al menos 1 mm de diámetro.
- (Opcional) Para el ensayo de vida útil en NGT-3D, cámaras de cubierta con papel de aluminio para evitar la degradación de la luz de FUdR.
4. Medir la aptitud de la población de gusanos en NGT-3D (Cría relativa Ensayo de tamaño)
- Escoja un gusano de L4 etapa usando un alambre de platino recogida y traslado en una placa de NGM sin bacterias. Permitir que el gusano se mueva libremente alrededor de unos pocos minutos para eliminar bacterias adheridas a su cuerpo.
- Repita el paso 4.1 y asegúrese de que el gusano está libre de bacterias. En general, dos repeticiones de 4.1 son suficientes.
- Con cuidado, coloque el gusano limpia en la superficie de los medios de comunicación en 3D con un pico alambre de platino. El gusano, finalmente, debe entrar en el agar agar en la matriz 3D.
- Cierre la tapa sin apretar que permite un poco de aire para entrar en el tubo, pero evitando el secado de los medios de agar.
- Incubar durante 96 horas a 20 ° C.
- Después de 4 días, cerrar las tapas firmemente y coloque lacámara de cultivo NGT-3D en un baño de agua a 88 ° para fundir el agar. El calor mata los gusanos pero sus cuerpos permanecen intactos.
NOTA: El uso de tubos de 8 ml de NGT-3D, 20 - 30 min de incubación suele ser suficiente. - Usando una pipeta de vidrio, transferir los medios fundidos en un 9 cm placa petri de plástico. No se recomiendan pipetas de plástico, como los gusanos pueden a menudo se adhieren a ellos.
- El uso de un microscopio de disección estéreo de transmisión, contar el número de gusanos en la L3, L4 y etapas adultas. No contar los gusanos que son L2 escenario y más joven, ya que las generaciones F1 y F2 se pueden confundir aquí. Por lo tanto, este ensayo es un ensayo de tamaño de la camada relativa en lugar de un total de ensayo tamaño de la camada.
5. Imagen y comportamiento de estos animales en el Registro NGB-3D
- Escoja un gusano de L4 etapa usando un alambre de platino recoger y eliminar las bacterias adheridas a la superficie mediante la transferencia a una placa de NGM sin bacterias y permitiendo que se mueva libremente durante unos minutos.
- Repita el paso 5.1 para asegurarse de que el worm está libre de bacterias.
- Colocar con cuidado el gusano limpio en el centro de la superficie de agar de la NGB-3D cerca del cuello de la botella con un pico alambre de platino. El gusano, finalmente, debe entrar en el agar agar en la matriz 3D.
- Cierre la tapa sin apretar que permite un poco de aire para entrar en el tubo, al tiempo que evita el secado de los medios de agar.
- Imagen o grabar el gusano bajo un microscopio de disección estéreo de transmisión. Ajuste el enfoque como el gusano se mueve a través de la matriz 3D.
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Representative Results
La construcción de NGT-3D es un protocolo simple y directo que resulta en un tubo de ensayo de agar-llena de pequeñas colonias bacterianas espaciados en todo el agar (Figura 1A). Los gusanos pueden moverse libremente a través de la matriz de agar, la búsqueda y el consumo de las colonias bacterianas. Para confirmar si C. elegans pueden reproducirse y crecer normalmente en NGT-3D, se comparó la fertilidad y el desarrollo de las larvas en 3D con placas estándar 2D NGM. En el ensayo de cría de tamaño relativo, adultos de C. elegans hermafroditas en NGT-3D se reproducen tan bien como hermafroditas en las placas estándar 2D NGM cuando las colonias bacterianas son abundantes con al menos 60 colonias (Figura 1B). Además, el desarrollo larval en NGT-3D también procede normalmente cuando hay un montón de colonias de bacterias con la mayoría de los gusanos en el estado adulto después de 96 horas (Figura 1C). Sin embargo, si las colonias bacterianas son escasosen la matriz 3D, tanto en la cría de tamaño relativo (Figura 1B, barra de la izquierda) y el desarrollo de las larvas (Figura 1C, barra de la izquierda) se ven afectados negativamente.
Para probar si la vivienda en 3D tiene ningún efecto sobre la fisiología a largo plazo del gusano, se realizó un ensayo de vida útil comparar placas NGT-3D y NGM. El promedio de vida de los gusanos en NGT-3D fue de 15,6 ± 3,6 días en comparación a 14,8 ± 3,1 días para NGM placas estándar. Las curvas de vida útil de los gusanos que viven en NGT-3D y NGM fueron casi idénticos. Por lo tanto, parece que los gusanos sobreviven igualmente bien en condiciones de 3D y 2D.
La fabricación del NGB-3D también no es difícil y debe resultar en una botella de cultivo clara, agar-llenado como la que se observa en la Figura 2A. Para ver fácilmente las colonias bacterianas, que hemos expresado deoxyviolacein, un metabolito bacteriano de color púrpura oscuro 11, en el OP50cepa de E. coli (Figuras 2A, 2B; cepa disponible bajo petición). Gusanos vivos se pueden obtener imágenes bajo una transmisión estéreo-microscopio de disección (Figura 2B, Suplementario Película 1).
El almacenamiento de NGT-3D y NGB-3D a temperatura ambiente es suficiente para mantener estas dos cámaras de cultivo durante un máximo de 1 mes. La desecación del agar no es una preocupación para cualquiera NGT-3D o 3D-NGB si se aplica una de enchufe o de tipo tornillo de cabeza que se ajusta el tubo o botella.
Figura 1: Desarrollo, la fertilidad y la vida útil de C. elegans cultivadas en NGT-3D es comparable con la del estándar NGM 2D. (A) Imágenes de NGT-3D en varias diluciones de bacterias. a la izquierda yla derecha contiene una dilución de 5 x 10 -7, y el medio es una dilución 1 x 10 -7. (B) El tamaño relativo de cría de gusanos de tipo salvaje en NGT-3D a menos de 60 colonias OP50 (n = 24), mayor o igual a 60 colonias (n = 14), o en placas 2D NGM (n = 29). Las barras de error indican el error estándar. (C) Porcentaje de gusanos generación F1 en el L3, L4 o etapa de desarrollo para adultos en NGT-3D con menos de 60 colonias OP50, mayores o iguales a 60 colonias, o en las placas de NGM 2D. Curva (D) La supervivencia de los de tipo salvaje C. elegans en placas NGT-3D o NGM. SN no indica significativamente diferente calcula mediante la prueba de log-rank. Esta cifra se ha modificado de Lee 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes en 3D C. elegans utilizando NGB-3D. (A, B) Imágenes de NGB-3D; (C) Imágenes de adultos C. elegans cerca de una colonia de la cepa de E. coli que expresan OP50 el deoxyviolacein pigmento púrpura oscuro. La barra de escala es de 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película complementaria 1: Adultos C. elegans se acercan a una coli OP50-violacé E. en la colonia en NGB-3D. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El cultivo de laboratorio de C. elegans usando las placas de medio de crecimiento de nematodos clásicos fue crucial para los cientos de descubrimientos importantes que la investigación en C. elegans ha proporcionado. A continuación, presentamos nuevos métodos para cultivar C. elegans en un entorno que refleja con mayor precisión sus hábitats naturales tridimensionales. Aunque otros métodos se han utilizado para observar C. elegans en 3D 13, este es el primer protocolo que permite el cultivo de gusanos en una matriz 3D sólido. Los dos métodos que se muestran aquí, NGT-3D y NGB-3D, permiten a los científicos hacen preguntas de la aptitud, el desarrollo y el crecimiento en cultivo 3D, y también de imagen y grabar los gusanos en 3D. Aunque NGT-3D y 3D-NGB tienen algunas diferencias con respecto a las placas estándar 2D NGM, que son similares a este método original y única ajustada para añadir el cultivo del gusano en el eje z. Por lo tanto, nos encontramos con que el desarrollo, la fertilidad y la vida útil proceder normalmente en nuestras condiciones. losobjetivo era crear un protocolo que cualquier laboratorio puede emplear para su investigación. Estos métodos son muy simples, fácilmente reproducible a un coste muy bajo, y permiten el ajuste de protocolos para adaptarse a experimentos específicos de los usuarios.
A pesar de todos los pasos en el protocolo son importantes, el paso crítico en la toma de NGT-3D y NGB-3D es la temperatura de enfriamiento del agar tras autoclave en los pasos 3.4 a 3.6 del protocolo. Si la temperatura se enfría demasiado baja (algunos grados por debajo de 40 ° C), el agar comenzará a endurecerse y las soluciones añadidas no se mezcla correctamente en el agar. Sin embargo, si la refrigeración es insuficiente (varios grados por encima de 40 ° C), las bacterias añadidas pueden morir y la solución colesterol añadido pueden enturbiar el agar agar haciendo que el inútil para los experimentos. Además, una zona de precaución es en el paso 4.6. Cuando fundir el agar NGT-3D en el baño de agua, asegúrese de cerrar las tapas firmemente para ayudar en la fusión. Sin embargo, el calor puede hacer que eltapas para peligrosamente "pop" y convertirse en un proyectil. Por razones de seguridad es mejor para cubrir el baño de agua. Muchas partes del protocolo son muy adaptables al usuario. Por ejemplo, hemos utilizado un tubo de ensayo de plástico transparente para NGT-3D y una botella de cultivo de células claras 25 cm2 (sostiene un total de 65 ml) para la NGB-3D. Otros tipos de tubos transparentes o botellas disponibles para el usuario también debe trabajar. Además, el crecimiento bacteriano es ajustable. La cepa de E. coli OP50 generalmente toma alrededor de una semana a crecer a por lo menos 1 mm, que se prefiere para nuestros experimentos. En nuestra experiencia, no parece que los tiempos más largos de crecimiento ligeramente más cortos e incluso gran parte de las bacterias que afectan el crecimiento de gusano o la fertilidad. Ajuste de la concentración de agar, sin embargo, afectar el movimiento gusano. Concentraciones más bajas de agar resultan en gusanos que muestran un movimiento de natación similar, y las concentraciones más altas pueden inhibir el movimiento en general.
Un área de preocupación en NGB-3D fue el tema de la condensacióny la acumulación de agua. A medida que el agar líquido caliente se endurece, inevitablemente algo de condensación se desarrolla con el tiempo, particularmente en la interfase de la botella y el agar. Esto puede plantear problemas para el gusano, que muestra los comportamientos de natación en líquidos 14 y el crecimiento de las bacterias, que pueden extenderse a lo largo de la botella con el líquido. Prevención de la condensación es difícil. Existen dos soluciones posibles para esto. En primer lugar, nos aseguramos de que el gusano puede entrar fácilmente en el agar, colocándolo en el centro de la superficie del agar en el cuello de la botella. En segundo lugar, mantenemos intencionalmente la concentración de bacterias en bajas NGB-3D, disminuyendo así la probabilidad de que una colonia que crece en la interfaz de líquido y agar.
Otra preocupación es la obtención de imágenes de gusanos en NGB-3D. Para aumentar la claridad y la calidad de las imágenes de gusanos en 3D, las colonias deben estar cerca de la superficie, pero permanecen completamente incrustado en el agar. Se intentó hacer crecer colonias sólo incrustados cerca de la surface mediante la colocación de una capa delgada de agar que contienen bacterias en la superficie, y el resto del soporte era libre de bacterias. Sin embargo, el problema no se resolvió totalmente por este método. En su lugar, decidimos producir muchas botellas NGB-3D de una sola vez, y utilizar sólo los que contienen colonias cercanas a la superficie incrustados, lo que aumenta la probabilidad de que un gusano se moverá a una colonia cerca de la superficie. Una de las opciones que no hemos explorado está cambiando los medios sólidos a una matriz que no sea el agar granulado empleamos aquí. La formación de imágenes gusanos en la dirección del eje Z también puede ser un reto. Hacemos esto por subir y bajar el grueso del enfoque de forma manual, pero si existe un programa de seguimiento automatizado de esto, puede ser muy útil.
La esperanza es que las técnicas que aquí se presentan para el cultivo de C. elegans en 3D serán ampliamente utilizados por los biólogos de nematodos. Quedan muchas preguntas acerca de la biología del gusano, incluyendo el envejecimiento y las conductas en 3D, y si lo que los científicos observan en2D es relevante para el gusano en 3D. De hecho, un estudio previo utilizando NGT-3D mostró el impacto sobre la aptitud reproductiva que el cultivo 3D tenía en un mutante sensorial que reproduce normalmente en condiciones 2D 9. Además, un estudio mostró comportamientos de movimiento alterados en 3D en comparación con 2D 15. Por último, este sistema se puede utilizar para comenzar a responder a las preguntas de si ciertas condiciones, mutantes o manipulaciones confieren ventajas de la aptitud para el animal en su ambiente nativo 3D.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por un investigador de Nueva Concesión [2014R1A1A1005553] de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) para JIL; y la Universidad de Yonsei líder futuro desafío de Grant [2015-22-0133] para JIL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 224620 | |
| Sodium chloride | DAEJUNG | 7548-4400 | 58.44 MW |
| Agar, Granulated | Difco | 214530 | |
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Calcium chloride, dihydrate | Bio Basic | CD0050 | 2*H2O; 147.02 MW |
| Cholesterol | Bio Basic | CD0122 | 386.67 MW |
| Ethyl alcohol | B&J | RP090-1 | 99.99%; 46.07 MW |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Bio Basic | MN1988 | 120.37 MW |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous | Bio Basic | PB0445 | 136.09 MW |
| 2'-Deoxy-5-fluorouridine | Tokyo Chemical Industry | D2235 | 246.19 MW |
| Potassium phosphate, dibasic, anhydrous | Bio Basic | PB0447 | 174.18 MW |
| Multi-Purpose Test Tubes | Stockwell Scientific | ST.8570 | 8 ml |
| Test Tube Closures | Stockwell Scientific | ST.8575 | |
| Cell Culture Flask | SPL Lifescience | 70125 | 25 cm2 |
| Research Stereo Microscope | Nikon | SMZ18 | |
| High-Definition Color Camera Head | Nikon | DS-Fi2 | |
| PC-Based Control Unit | Nikon | DS-U3 | |
| NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software | Nikon | MQS32000 |
References
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