Summary
We presenteren een eenvoudige methode om 3D nematode teeltsystemen genaamd NGT-3D en NGB-3D construeren. Deze kunnen worden gebruikt om nematode fitness en gedragingen bij habitats die meer lijken op natuurlijke Caenorhabditis elegans habitats dan standaard 2D laboratorium C. elegans kweekplaten zijn bestuderen.
Protocol
1. Bereid Oplossingen voor NGT-3D en NGB-3D
- Bereid de volgende steriele oplossingen: 1 l 0,1454 M NaCl-oplossing, 1 L van 1 M CaCl2, 1 L van 1 M MgSO4, lysogenie bouillon (LB), 1 L van 1 M KPO 4 buffer (108,3 g KH 2 PO 4 en 35,6 g K 2 HPO 4, en vul H 2 O tot 1 L). Productie van NGM behulp van deze oplossingen kan worden gevonden in een eerder protocol 10.
- Oplossingen autoclaaf bij 121 ° C, 15 min.
- Bereid 50 ml van een steriele 5 mg / ml oplossing cholesterol. In een 50 ml conische buis, meng 0,25 g cholesterol en 50 ml 99,99% ethanol en meng. Niet in een autoclaaf. Steriliseer de oplossing cholesterol via een 50 ml spuit met een 0,45 urn spuitfilter. Dit zal ook eventuele onopgeloste cholesterol te verwijderen.
- (Optioneel) Maak 10 ml van een 150 mM 2'-deoxy-5-fluoruridine (FUdR) voorraad. In een 15 ml conische buis, meng 0,3693 gvan FUdR en 10 ml gedestilleerd water. Goed schudden.
2. Bereid Cultuur van bacteriën voor NGT-3D en NGB-3D
- Inoculeer 10 ml LB-bouillon met bacteriën. De standaard bacteriën gebruikt voor C. elegans voeden is E. coli stam OP50.
- Cultuur de bacteriële inoculatie bij 37 ° C in een schudincubator nachts.
- Ter voorbereiding van een seriële verdunning, aliquot 9 ml van de NaCl oplossing in steriele 15 ml conische buizen. Bijvoorbeeld, monster 9 ml in een totaal van 7 buizen een 10 -7 verdunning van OP50 stam E. coli maken.
- Met behulp van een steriele 1000 ui pipet Pipetteer 1 ml van de bacteriële kweek of verdunde bacteriële kweek in de nieuwe steriele buis met 9 ml NaCl-oplossing en vortex het mengsel 10 ml ook. Herhaal dit tot de gewenste bacteriële verdunning wordt bereikt.
OPMERKING: De gewenste bacteriële verdunning hangt af van het type en de toestand van bacteriën en de exacte experimentele omstandigheden.Bijvoorbeeld, een 10 -6 - 10 -8 verdunning van OP50 stam E. coli werd voldoende is om 1-200 bacteriekolonies per 6,5 ml NGT-3D buis. Wormen betrouwbaar ontwikkeld en gereproduceerd normaal wanneer het aantal kolonies was dan 60, die zich bij een verdunning van 10 -6 - 10 -7. Voor NGB-3D, maken gebruik van een verdunning van 10 -8.
3. Het maken NGT-3D en NGB 3D (200 ml)
- Na bereiding van de bacteriecultuur, meng 0,6 g NaCl, 1 g gegranuleerd agar en 0,5 g pepton in een 500 ml kolf. Plaats een magnetische roerstaaf in de kolf.
- Voeg 195 ml gedestilleerd water en hebben betrekking op de mond van de kolf in aluminiumfolie.
- Autoclaaf 121 ° C gedurende 15 minuten.
- Plaats de hete geautoclaveerde kolf op een roer plaat, en roer op een matig tempo gedurende minstens 2 uur. Koel de kolf tot 40 ° C. Zorg ervoor dat u voldoende afkoelen als de voortzetting van hier bij hoge temperaturen kunnen leiden tot vertroebeling van het afgewerkte agar.Evenwel lagere temperaturen resulteren in voortijdige verharding van de agar.
- (Optioneel) Om het tempo van het koelproces, zet de kolf in een 40 ° C waterbad 15 minuten voordat het op een roer plaat.
- Wanneer de temperatuur van de agar media 40 ° C bereikt, voeg 200 ul 1 M CaCl2 200 gl van 5 mg / ml cholesterol oplossing, 200 ul 1 M MgSO4 en 5 ml 1 M KPO 4 buffer oplossing blijft roeren tot eindconcentraties van 1 mM CaCl2, 5 ug / ml cholesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM KPO 4.
- (Optioneel) voor NGT-3D levensduur assay voeg 80 ul van 150 mM FUdR tot een eindconcentratie van 120 pM 12.
- Voeg 6 ml van de 10 ml verdunde bacteriecultuur uit stap 2.4 in de kolf direct.
- (Optioneel) voor NGT-3D, verwijderen 6 ml agar media vóór stap 3.6 en houd het warm apart. Dit medium wordt gebruikt voor het bacterievrijbovenste laag.
- Met behulp van steriele procedures, afzien van de media in een steriele cultuur kamer. Zorg ervoor dat het deksel van de kamer sluit stevig vast.
- (Optioneel) voorkoming van bacteriële kolonies vormen op het bovenoppervlak van de agar, maken een laag bacterievrij agar media uit stap 3.6.1 bovenaan voor de media uit stap 3.7 volledig verhardt. Dit zal een bacterie zone boven in de NGT-3D maken.
- Voor NGT-3D, giet 6,5 ml medium in de 8 ml doorzichtige plastic testbuisjes een bacterie agarlaag maken, en zorgvuldig afzien 200 pl van het bacterievrije media bovenop het deels geharde 3D media een dun maken bacterie- vrij laag bovenop.
- Voor NGB-3D, giet 65 ml van media in de 25 cm 2 doorzichtige plastic celcultuur fles. Dit bedrag moet het lichaam van de 25 cm 2 celkweek fles te vullen.
- Reactie kamers verticaal bij kamertemperatuur gedurende één week om bacteriële kolonies groeieneen aanzienlijke grootte diameter van ten minste 1 mm.
- (Optioneel) voor de levensduur test in NGT-3D, cover kamers met aluminiumfolie aan het licht degradatie van FUdR voorkomen.
4. Meet de geschiktheid van Worm Bevolking op NGT-3D (Relative Brood Maat Assay)
- Kies een L4 stadium worm met behulp van een platina draad oppikken en overbrengen op een bacterie-vrij NGM plaat. Sta worm vrij bewegen gedurende enkele minuten om bacteriën gehecht aan zijn lichaam.
- Herhaal stap 4.1 en zorg ervoor dat de worm is vrij van bacteriën. In het algemeen, twee herhalingen van 4,1 voldoende.
- Plaats de schone worm voorzichtig op het oppervlak van de 3D media met een platina draad pick. De worm moet uiteindelijk voer de agar in de 3D-agar matrix.
- Sluit het deksel los waardoor wat lucht te krijgen in de buis, maar het voorkomen van het drogen van de agar media.
- Incubeer gedurende 96 uur bij 20 ° C.
- Na 4 dagen, sluit de deksels goed vast en plaats deNGT-3D kweekkamer in een 88 ° C waterbad om de agar te smelten. De hitte doodt wormen, maar hun lichamen blijven intact.
OPMERKING: met 8 ml buizen voor NGT-3D, 20 - 30 min incubatie meestal voldoende. - Met behulp van een glazen pipet de gesmolten media op een 9 cm plastic petrischaal. Plastic pipetten zijn niet mogelijk, zoals wormen vaak kan vasthouden aan hen.
- Met behulp van een transmissie stereo stereomicroscoop Tel het aantal wormen in de L3, L4 en volwassen stadia. Heeft wormen die zijn L2 fase en jonger niet mee, omdat de F1 en F2 generaties hier kan worden verward. Dus deze test is een relatief broedselgrootte test in plaats van een totale broedselgrootte assay.
5. Beeld en Record Worm gedrag op NGB-3D
- Kies een L4 stadium worm met behulp van een platina draad oppikken en verwijder alle bacteriën vast aan de oppervlakte door de overdracht aan een bacterie-vrij NGM plaat en waardoor zij zich vrij te bewegen voor een paar minuten.
- Herhaal stap 5.1 om ervoor te zorgen dat de worm is vrij van bacteriën.
- Plaats de schone worm voorzichtig op het midden van de agar oppervlak van de NGB 3D nabij de hals van de fles met een platina draad pick. De worm moet uiteindelijk voer de agar in de 3D-agar matrix.
- Sluit het deksel los waardoor wat lucht te krijgen in de buis, terwijl het voorkomen van het drogen van de agar media.
- Afbeelding of de worm onder een transmissie stereo dissectie microscoop te leggen. Pas de focus als de worm door de 3D-matrix beweegt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De constructie van NGT-3D is een eenvoudige en protocol dat resulteert in een agar-gevulde reageerbuis met kleine bacteriële kolonies verspreid over de agar (Figuur 1A). Wormen kunnen zich vrij bewegen door de agar matrix, vinden en de consumptie van de bacteriële kolonies. Om te bevestigen of C. elegans kunnen voortplanten en groeien normaal in NGT-3D, vergeleken we de vruchtbaarheid en larvale ontwikkeling in 3D met standaard 2D NGM platen. In de relatieve broedselgrootte assay volwassen C. elegans hermafrodieten in NGT-3D reproduceren net als hermafrodieten in de standaard 2D NGM platen als bacteriekolonies overvloedig met ten minste 60 kolonies (Figuur 1B). Bovendien larvale ontwikkeling in NGT-3D verloopt ook normaal als er zijn tal van bacteriële kolonies met de meerderheid van de wormen in de volwassen staat na 96 uur (figuur 1C). Indien bacteriële kolonies schaarsin de 3D-matrix, zijn beide relatief broedselgrootte (Figuur 1B, links bar) en larvale ontwikkeling (figuur 1C, linkerbalk) negatief beïnvloed.
Nagaan bewoning in 3D heeft enig effect op de lange termijn fysiologie van de worm, voerden we een levensduur test vergelijken NGT-3D en NGM platen. De gemiddelde levensduur van wormen op NGT-3D was 15,6 ± 3,6 dagen vergeleken met 14,8 ± 3,1 dagen voor standaard NGM platen. De levensduur curven voor wormen leven op NGT-3D en NGM waren bijna identiek. Zo lijkt het erop dat de wormen overleven even goed in 3D en 2D-omstandigheden.
Vervaardigen van de NGB-3D is ook niet moeilijk en moet resulteren in een duidelijke, agar gevulde fles cultuur zoals die te zien in figuur 2A. Om gemakkelijk de bacteriële koloniën, hebben we deoxyviolacein, een donker paarse bacteriële metaboliet 11 uitgedrukt, in de OP50 bekijkenstam E. coli (figuren 2A, 2B, druk op aanvraag). Levende wormen kunnen worden afgebeeld onder een transmissie-stereo ontleden microscoop (Figuur 2B, Supplemental Film 1).
Opslag van NGT-3D en NGB 3D bij kamertemperatuur is voldoende om beide kamers cultuur handhaven tot 1 maand. Verdroging van de agar is geen probleem voor een van beide NGT-3D of NGB-3D als een plug-type of schroef-type cap dat de buis of fles past wordt toegepast.
Figuur 1: Ontwikkeling, vruchtbaarheid en levensduur van C. elegans in NGT-3D geteeld, is vergelijkbaar met die van de standaard 2D NGM. (A) Beelden van NGT-3D op verschillende verdunningen van bacteriën. links enrechts bevat een 5 x 10 -7 verdunning, en het midden is een 1 x 10 -7 verdunning. (B) Relatieve broedselgrootte wildtype wormen in NGT-3D minder dan 60 OP50 kolonies (n = 24), groter of gelijk aan 60 kolonies (n = 14) of 2D NGM platen (n = 29). Fout balken geven de standaard fout. (C) Percentage F1 generatie wormen in de L3, L4 en volwassen ontwikkelingsstadium NGT-3D met minder dan 60 OP50 kolonies, groter dan of gelijk aan 60 kolonies of 2D NGM platen. (D) Survival curve van wild-type C. elegans in NGT-3D of NGM platen. NS geeft niet significant verschillend berekend met log-rank test. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Lee 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Imaging C. elegans in 3D met behulp van NGB-3D. (A, B) Beelden van NGB-3D; (C) Foto's van de volwassen C. elegans in de buurt van een kolonie van OP50 stam E. coli uiting van de donkerpaarse pigment deoxyviolacein. Schaal bar is 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Movie 1: Adult C. elegans benaderen een E. coli OP50-violace in kolonie in NGB-3D. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het laboratorium teelt van C. elegans het gebruik van de klassieke nematode groei media platen was van cruciaal belang voor de honderden belangrijke ontdekkingen die het onderzoek in C. elegans heeft verstrekt. Hier presenteren we nieuwe methoden om C. elegans kweken in een omgeving die een betere afspiegeling hun natuurlijke driedimensionale habitats. Hoewel andere methoden zijn gebruikt om C. elegans observeren 3D 13, is het eerste protocol dat kweken van wormen maakt in een vaste 3D matrix. De twee methodes hier getoonde, NGT-3D en NGB-3D, kunnen wetenschappers op vragen van fitness, ontwikkeling en groei in 3D teelt, maar ook beeld te stellen en de wormen op te nemen in 3D. Hoewel NGT-3D en NGB 3D hebben enkele verschillen met de standaard 2D NGM platen, zijn ze gelijk aan het oorspronkelijke methode slechts aangepast worm teelt voegen in de z-as. Zo vinden we dat de ontwikkeling, vruchtbaarheid en levensduur gaan normaal gesproken in onze voorwaarden. Dedoel was om een protocol dat een lab kunt inzetten voor hun onderzoek te creëren. Deze methoden zijn zeer eenvoudig, gemakkelijk reproduceerbaar tegen een zeer lage kostprijs, en kunnen worden ingesteld protocollen specifieke experimenten de gebruiker past.
Hoewel alle stappen in het protocol van belang is de kritische stap om NGT-3D en NGB-3D is de koeltemperatuur van de agar na het autoclaveren in de stappen 3,4-3,6 van het protocol. Als de temperatuur te laag afkoelt (enkele graden beneden 40 ° C), zal de agar beginnen te harden en de toegevoegde oplossingen niet goed mengen in de agar. Indien de koeling onvoldoende is (enkele graden boven 40 ° C), kan de toegevoegde bacteriën sterven en de toegevoegde cholesterol oplossing kan de agar wolk waardoor de agar nutteloos voor experimenten. Bovendien, een gebied van voorzichtigheid in stap 4,6. Bij het smelten van de NGT-3D-agar in het waterbad, zorg ervoor dat de deksels goed sluiten om te helpen bij het smelten. Echter, de warmte hetcaps te gevaarlijk "pop" uit en word een projectiel. Om veiligheidsredenen is het het beste om het waterbad te dekken. Veel delen van het protocol vrij aangepast aan de gebruiker. Zo hebben we een doorzichtige plastic reageerbuis voor NGT-3D en een 25 cm 2 clear cell kweekfles (heeft een totaal van 65 ml) voor de NGB-3D gebruikt. Andere typen duidelijk tubes of flessen aan de gebruiker ook werken. Ook bacteriegroei instelbaar. E. coli stam OP50 duurt ongeveer een week te groeien tot ten minste 1 mm, dat is aangewezen voor onze experimenten. In onze ervaring, iets korter en zelfs veel langer groei tijden voor de bacteriën niet te groei worm of de vruchtbaarheid aantasten. Aanpassing van agar concentratie zal echter worm beweging beïnvloeden. Lagere concentraties van agar resulteren in wormen met een zwembad-achtige beweging, en hogere concentraties kan de algehele beweging remmen.
Een gebied van zorg in NGB-3D was de kwestie van de condensatieen water accumulatie. Als de warme agar vloeistof uithardt, onvermijdelijk enige condenswater in de tijd, met name aan het grensvlak van de fles en de agar. Dit kan problemen veroorzaken voor de worm, die zwemmen gedrag in vloeistoffen 14 en de groei van bacteriën, die verspreid over de fles door de vloeistof laat vormen. Voorkomen van condensatie moeilijk. Twee mogelijke oplossingen bestaan voor dit. Ten eerste, zorgen we ervoor dat de worm gemakkelijk de agar kan komen door het plaatsen van het in het midden van de agar oppervlak op de hals van de fles. Ten tweede houden we bewust de concentratie bacteriën laag NGB-3D, waardoor de kans dat een kolonie groeit op het grensvlak van vloeistof en agar verminderen.
Een andere zorg is de beeldvorming van wormen in NGB-3D. Om de duidelijkheid en de kwaliteit van de beelden van de wormen in 3D te verhogen, moet kolonies dicht aan de oppervlakte, maar blijven volledig ingebed in de agar. We hebben geprobeerd om alleen ingebed kolonies groeien in de buurt van de surface door een dunne laag van bacteriën bevattende agar aan het oppervlak, en het resterende medium werd bacterievrij. Echter, het probleem niet volledig opgelost door deze methode. In plaats daarvan hebben we besloten om vele NGB 3D-flessen tegelijk, en alleen degene die kolonies bevatten ingebedde nabij het oppervlak, waardoor de kans dat een worm naar een kolonie nabij het oppervlak toeneemt. Een optie die we hebben niet onderzocht is het veranderen van de vaste media naar een andere dan de kristalsuiker agar we hier hanteren matrix. Beeldvorming wormen in de z-asrichting kan ook uitdagend. Dit doen we door met de hand verhogen en verlagen van de grove focus, maar als een geautomatiseerd volgen programma bestaat voor dit, kan het heel nuttig zijn.
De hoop is dat de hier gepresenteerde voor de teelt van C. elegans in 3D technieken breed worden gebruikt nematode biologen. Vele vragen blijven over de worm biologie, met inbegrip van de vergrijzing en het gedrag in 3D, en of wat wetenschappers observeren2D is relevant voor de worm in 3D. Inderdaad, een eerdere studie met behulp van NGT-3D toonde de invloed op de reproductieve fitness, dat 3D teelt had op een zintuiglijke mutant die normaal reproduceert in 2D omstandigheden 9. Bovendien, een onderzoek vertoonde een veranderde beweging gedrag in vergelijking met 3D 2D 15. Tenslotte kan dit systeem worden gebruikt om te beginnen bevat of bepaalde voorwaarden, mutanten of manipulaties verlenen fitness voordelen aan het dier in zijn natieve omgeving 3D beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een New Investigator Grant [2014R1A1A1005553] van de National Research Foundation Korea (NRF) naar JIL; en een Yonsei University Future Leader Challenge Grant [2015-22-0133] om JIL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 224620 | |
| Sodium chloride | DAEJUNG | 7548-4400 | 58.44 MW |
| Agar, Granulated | Difco | 214530 | |
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Calcium chloride, dihydrate | Bio Basic | CD0050 | 2*H2O; 147.02 MW |
| Cholesterol | Bio Basic | CD0122 | 386.67 MW |
| Ethyl alcohol | B&J | RP090-1 | 99.99%; 46.07 MW |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Bio Basic | MN1988 | 120.37 MW |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous | Bio Basic | PB0445 | 136.09 MW |
| 2'-Deoxy-5-fluorouridine | Tokyo Chemical Industry | D2235 | 246.19 MW |
| Potassium phosphate, dibasic, anhydrous | Bio Basic | PB0447 | 174.18 MW |
| Multi-Purpose Test Tubes | Stockwell Scientific | ST.8570 | 8 ml |
| Test Tube Closures | Stockwell Scientific | ST.8575 | |
| Cell Culture Flask | SPL Lifescience | 70125 | 25 cm2 |
| Research Stereo Microscope | Nikon | SMZ18 | |
| High-Definition Color Camera Head | Nikon | DS-Fi2 | |
| PC-Based Control Unit | Nikon | DS-U3 | |
| NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software | Nikon | MQS32000 |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
- Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
- Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
- Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
- Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056 (2015).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
- Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484 (2013).
- Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
- Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564 (2015).
