Introduction
지난 몇 년 동안, 세포 외 기질 (ECM)는 여러 세포 생리 학적 및 병리학 적 과정에 관여하는 다양한 동적, 복잡한 환경으로 인식되고있다. 조직 수준에서 ECM은 세포 신호, 운동, 분화, 혈관 신생, 줄기 세포 생물학, 종양, 섬유화 등 1, 2에 영향을 미친다. ECM 조직 및 ECM에 의존하는 프로세스의 연구는 따라서 세포 생물학 및 조직 생리에 대한 폭 넓은 의미를 가지고있다. ECM 구성, 조직 및 기능적 특성의 기계적인 이해에 도달하기 위해 ECM의 정확한 분리를위한 방법이 필요합니다. 조직 (3)로부터 분리 의존 ECM 단백질의 초기 식별하는 반면, 배양 된 세포로부터의 ECM의 제조는 더욱 보급되고있다.
세포 유래 ECM의 분리 및 분석은 두 가지 이유로 복잡하다. 우선, 세포의 존재 및IR 풍부한 세포 단백질 어려운 개별 세포 구조와 ECM을 분리 할 수있다. 실제로, 몇몇 ECM 단백질은 세포 내부뿐만 아니라 ECM (4) 역할을; 전자 재료 내의 단백질의 연구는 세포 내부의 역할과 혼동 될 수없는 경우, 따라서, 세포 유래의 세포 ECM 단백질의 효과적인 제거가 필수적이다. 둘째, 세포 유래 ECM 종종 공유 가교 ECM 조립체에있는 표준에 따라서 세제 불용성 많은 대형 올리고머 단백질로 구성된다. 이러한 속성은 추출 및 ECM의 추가 분석을 복잡하게 할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 방법은 세포 성분으로부터 ECM 단백질의 효과적인 분리를 가능하게 할 필요가있다.
여러 방법은 세포 배양 또는 조직 추출물 중 ECM으로부터의 분리에 대한 문헌에 기술되어있다. 이러한 방법의 대부분은 풍부한 ECM 홍보의 추출을 목표로하고 있습니다otein는 조직으로부터 콜라겐 및 중성 염 (3) 산성 조건 5,6- 또는 펩신 (7)의 사용을 포함한다. 조직 추출물에서 총 ECM의 분리는 종종 전에 ECM의 분리에 조직의 탈세 포화을 포함한다. 예를 들어, 연속 추출 방법은 인간의 심장 조직 (8)로부터 분리하는 ECM을 설명 하였다. 우선, 느슨하게 결합 된 ECM 단백질은 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 전에 0.5 M NaCl로 추출 된 세포를 제거 하였다. 마지막으로, 나머지 ECM 단백질은 4 M 구아니딘 (8)를 이용하여 추출 하였다. ECM은 8 M 요소 (9)를 사용하여 decellularized 샘플에서 용해 될 수있다. 다른 기술은 원심 분리하여 수용성 세포 용 해물로부터 불용성 ECM 단백질을 분리하기 전에 두 세포 및 ECM을 추출 등 옥시 콜산 10 세제를 사용한다.
격리이 보고서에 기술 된 세포 유래 ECM의 분석 방법은 생식을 제공합니다세포 물질을 제거 시츄 면역 형광에 의해 분석이나 생화학 분석을 위해 추가로 추출 될 수있는 세포 - 유래 ECM을 떠나는 ducible 방법. 이 방법은 어떤 자기편 세포 유형에 적용 할 수 있습니다 및 면역 또는 질량 분석, 또는 기능 연구에서 분리 된 ECM의 활용 등 다운 스트림 절차를 위해 확장 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 실시간으로 관심 태그 ECM 단백질의 침착을 추적하는 생균의 공 초점 현미경과 함께 사용될 수있다. 이것은 격자, 유리 바닥 접시의 사용을 통해 달성된다. 전체적으로, 방법은 세포 유래 ECM도 식별 증착 개별 ECM 단백질의 동력학을 모니터하는 범위의 정확한 분리를 제공한다.
Protocol
암모늄 수산화 솔루션을 통해 세포의 1. 제거
- 적절한 밀도로 도금하여 부착 세포를 준비합니다.
참고 : 세포 분석을위한 충분한 ECM을 생산하고있는 자기편 세포 유형이 될 수 있습니다. 여기에서는 COS-7 세포를 SV-40 바이러스의 DNA 서열을 포함하는 아프리카 녹색 원숭이 신장 섬유 아세포와 같은 세포 라인의 사용을 기술; RCS, 래트 연골 육종 세포주; 또는 정상적인 인간 피부 섬유 아세포는 (HDF) 청소년 포피에서 균주. HDF는 통로 1 통로 (8)에만 사용됩니다.- 고정 된 ECM의 형광 현미경 연구를위한 살아있는 세포와 ECM의 이미징을위한 커버 슬립의 세포를 플레이트, 또는 작은 규모의 기능 분석을위한 세포 유래 ECM의 준비를위한. SDS-PAGE 분석, 면역, 또는 프로테오믹스 연구를위한 세포 배양 접시에 세포를 플레이트.
주 : 세포 배양 조건 (플레이트 세포 배양 배지의 수)는 세포 유형에 의존 할 것이다. 접시에 세포 수에 필요합니다특정 세포주 또는 세포주에 대해 실험적으로 설정 될 수있다. - 세포가 일반적으로> 16 시간을 ECM을 입금 할 수있는 적절한 시간을 허용합니다. 주 : 기간은 세포 유형에 의존 할 것이며, 경험적으로 판단 할 필요가있다. 이소성 발현을 실시하는 경우, 관심있는 단백질의 형질 발현과 ECM의 증착을위한 적합한 시간을 허용한다.
- 고정 된 ECM의 형광 현미경 연구를위한 살아있는 세포와 ECM의 이미징을위한 커버 슬립의 세포를 플레이트, 또는 작은 규모의 기능 분석을위한 세포 유래 ECM의 준비를위한. SDS-PAGE 분석, 면역, 또는 프로테오믹스 연구를위한 세포 배양 접시에 세포를 플레이트.
- 추출기 후드, 탈 이온수 H 2 O로 원액 1/14 희석하여 적절한 용기 내에서 20 mM 포름산 암모늄 히드 록 시드를 준비
- 인큐베이터에서 세포를 제거하고 부드럽게 배지를 제거합니다. 부드럽게 접시의 벽에 부어 칼슘 / 마그네슘 2+없이 인산 완충 식염수 (PBS)를 추가합니다. 두 접시를 바위와 플라스틱 전송 피펫으로 액체를 제거합니다. 두 번 더 반복한다.
- 추출기 후드, 각각의 접시를 기울 플라스틱 전송 피펫 단계 1.2에서 PBS를 제거합니다. 3 추가100 mm 접시 당 수산화 암모늄 용액과 5 분 동안 실온에서이를 부화. 5 분의 인큐베이션 기간 동안 부드럽게 세포의 용해를 위해 접시마다 분 교반. 단계 1.4-1.7은 추출기 후드에서 수행한다.
주 : 대체 세포 제거 반응물을 10 분 동안 세포와 함께 인큐베이션이 M, 8 M 우레아를 포함한다. - 락과 함께, 각각의 접시에 100mm 접시 당 적어도 20 ㎖를 탈 이온화 된 H 2 O의 풍부한 양을 추가합니다. 수산화 가용화 재료되는 수산화 암모늄, 용균 세포 및 탈 이온화 된 H 2 구성되는 전송 피펫으로 흡인하여 O-암모늄 폐기. 액체 폐기물 용기에이 폐액을 전송합니다.
- 모든 수산화 암모늄 - 가용성 물질의 완전한 제거를 위해 풍부한 탈 이온화 H 2 O 네 번 이상 불용성 ECM 층을 세척한다.
- 면역 형광에 의한 ECM의 검사를 위해 2 %를 추가하여 ECM 해결파라 포름 알데히드 (PFA; 100mm의 접시 당 3 ㎖)을 실온에서 10 분간.
주의 : PFA가 피부 나 눈에 접촉 폐 손상, 질식, 의식 불명 또는 사망을 생성 할 수 있습니다 심한 과다 노출의 경우 매우 위험합니다. 그것은 단지 추출기 후드에서 처리되어야하고, 개인 보호 장비를 착용해야합니다. - 단계 1.2에서와 같이, PBS로 두 번 각각의 고정 된 샘플을 씻어 적당한 액체 폐기물 용기에 PFA 솔루션을 폐기하십시오. 필요한 경우, 형광 현미경을 위해 그들을 준비하기 전에 4 ° C에서 PBS에서 ECM 샘플을 저장합니다.
라이브 세포의 공 촛점 현미경 이미징에 의한 ECM 단백질 2. 추적 증착
- 혈구에서 세포를 계산합니다. COS-7 세포, 형질 전환 용 60mm 세포 배양 접시에 세포를 250,000 접시.
주 : 생균 이미징, 세포는 유 전적으로 인코딩 된 형광 프레임 융합 관심 ECM 단백질을 코딩하는 벡터로 형질 전환되어야NT를 태그입니다. 이것은 라이브 세포 이미징 동안 관심의 ECM 단백질의 식별을 가능하게하는 것이다. - 이미징을위한 35 mm 격자, 유리 바닥 접시에 단백질 발현 (예를 들어, 16 시간)에 적합한 시간 후, 트립신 EDTA 용액으로 접시에서 세포를 제거 혈구에서 그들을 계산하고, 플레이트 ~ 150,000 세포. 셀 2 (H)가 다시 연결 허용 ECM 증착 시작 (시간주기는 세포 유형에 의존 할 것이며, 경험적으로 확립되어야한다).
참고 :이 이미지 품질에 영향을 미치는 붉은 색조를 줄 수있는, 페놀 레드를 포함하지 않는 셀 매체를 사용합니다. - 위의 2 시간의 기간 동안 37 ° C 배양기 챔버와 CO 2 공급 공 초점 현미경을 설정합니다. 챔버 및 접시 온도를 촬상하기 전에 37 ℃로 안정화되도록; 이 1 시간까지 걸릴 수 있습니다.
- 30 분 동안 형광 세포 마커로 접시를 격자 35mm에 도금 세포를 품어. 그 후, 세포를 세척두 번 촬영에 앞서 페놀 레드가없는 배지입니다.
주 : 세포질 형광 마커 셀 볼륨 가시화하는 데 사용될 수 있거나 막 내장형 마커 셀 가장자리를 시각화 할 수있다. - 공 초점 현미경에 20X 목표 및 위상 콘트라스트를 사용하여, 수 (> 3) 부착의 건강한 세포를 포함하는 적절한 그리드 광장을 식별합니다. 63X 또는 100X 목적 및 형광 현미경 하에서 적당한 파장을 이용하여 상기 선택된 그리드 사각형 내의 셀 선택의 목적 단백질의 발현을 확인한다.
- A에서 Z - 스택 소프트웨어를 사용하여 형광 및 위상 대비 시간 경과 영상을 설정합니다. 단지 세포체 이상으로 단지 ECM 층과 "끝"스택 이하로하기 위해 "시작"스택을 설정합니다. 세포 유형에 따라, 0.3 ㎛ 인 Z 축 스텝 사이즈 및 총 μm의 5 내지 10 깊이가 Z 음량을 설정한다. 이 시점 당 15 ~ 30 Z-섹션 사이 줄 것이다.
- CAPTUR주기적으로 설정된 기간 동안 위상 콘트라스트 영상 (적색 형광 단백질 (RFP), 여기 = 555 nm에서 방출 = 584 nm)으로 전자 형광. 예를 들어, 2 분의 시간 간격으로 2 시간의 기간을 설정하는 저속 소프트웨어를 사용한다. 정의 된 기간 동안 Z-섹션 이미지 캡처를 시작하려면 "시작"버튼을 선택합니다.
- 전자 재료에 대한 관심의 형광 표지 된 단백질의 위치 파악을 확인하는 단계 1.1-1.5에 설명 된 시간 기간의 끝에서, 접시로부터 세포를 제거한다.
- 관련 그리드 사각형을 재배치 위상차 영상과 20 배 목표를 사용합니다.
- 63X 목표로 전환 형광 현미경 하에서 ECM 층을 식별합니다. 사전 추출 이미지에이 이미지를 비교
세포 기능 분석 실험에 대한 세포 유래 ECM 3. 무균 준비
- 커버 슬립과 다른 popu에 셀 중 하나 인구 (이하 "매트릭스 프로듀서"셀) 성장LATION 최소 24 시간 동안 100mm 세포 배양 접시에 표준 문화 (이하 "시험"셀).
주 :이 두 상이한 부착 세포 유형이 될 수 있으며, 실험적 설계는 형광 태그 ECM 단백질을 표현하는 하나 또는 둘 모두 세포 집단의 형질 전환을 포함 할 수있다. - 층류 후드에서 세포 배양에 사용 된 칼슘없이 PBS의 멸균 용액을 제조 멸균 된 0.2을 각각 통과함으로써 2 O를 ㎎ / 2 + 20 mM의 암모늄 하이드 록 사이드 (단계 1.3 참조), 및 탈 이온수 H 적절한 멸균 용기에 μm의 필터.
- 무균 기술을 유지, 부드럽게 멸균 PBS (단계 1.2 참조) 된 커버에 세 번 "매트릭스 프로듀서"세포를 씻는다.
- 멸균 피펫으로 흡입하여 PBS를 제거하고 적절한 액체 폐기물 용기에 폐기하십시오. 20 mM의 멸균 암모늄 하이드 록 사이드 (3 ㎖ / 100mm 요리)를 추가하고 간격으로 흔들으로 5 분 동안 그들을 품어.
- 풍부한 양 추가멸균 탈 이온화 H의 "매트릭스 제조자"접시 2 O, 적어도 20 락과 100mm의 접시 당 용액, 및 적절한 폐기 용기에 세포 용 해물을 얻어 붓는다.
- 네 단계를 반복하여 3.5 배 이상이 암모늄 히드 록 시드 - 용해 물질의 완전한 제거를 보장한다.
주 : 커버 슬립의 "매트릭스 프로듀서"세포에 의해 퇴적 된 ECM은 관심의 테스트 세포 기능 분석을위한 멸균 ECM을 제공합니다. - 100mm의 접시 당 트립신 EDTA 용액 1.5 mL로 세포 스톡 접시에서 시험 세포를 부화 시험 셀이 접시로부터 분리 될 때까지 (w 0.05 % / V 트립신 및 w 0.02 % EDTA V / 행크의 균형 잡힌 염 용액) . 세포 배지를 추가 5 분 동안 400 XG에서 시험 세포를 원심 분리하고 상층 액을 제거한다.
- 신선한 멸균 배지에서 시험 세포를 재현 탁하고 혈구대로 계산. coversli에 멸균 절연 ECM에 이러한 시험 셀의 적절한 수 판형추신. 2-3 시간 동안 또는 실험 설계에 필요한 시간 기간 동안 적절한 세포 배양 배지에서 그들을.
- , 액틴 세포 골격의 구성을 검사 2 %에서 테스트 세포를 해결 PFA 및 형광 염료로 얼룩하려면 (FITC) -phalloidin (여자 = 490 nm의 방출 = 525 nm의) 시각화 F - 굴지 및 4 ', 6 -diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI, 여기 = 358 nm의 방출 = 461 nm의)는 핵 (11)를 시각화합니다.
주 : 자신의 ECM에 도금 시험 셀과 이종 세포 유래 ECM에 도금 시험 셀의 형태와 액틴 조직을 비교한다.
SDS-PAGE, 면역 블롯 분석, 또는 단백질 체학을위한 ECM 4. 분리
- 분비 ECM의 증착을 허용하도록, 상기 셀 타입에 적절한 24-96 시간 동안 100mm 세포 배양 접시 (프로테오믹스 5-10 요리 또는 면역 1-2 종)에 관심 부착 세포 성장.
- DESCR로 세포를 제거단계 1.1-1.5에서 ibed.
- 접시의 바닥에 잔류 H 2 O를 배출 각도로 각 플레이트를 기울여, 플레이트가 완전히 건조 될 때까지 조심스럽게 P200 피펫에 남아있는 H 2 O를 제거합니다.
- 병행 열 SDS-PAGE 샘플 버퍼 히트 블록을 사용하여 2 분 동안 95 ° C 내지 100 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 함유하고, 플레이트를 추가한다. 샘플을 면역 블롯에 의해 검사 될 수 있도록 100mm의 접시 당 샘플 완충액 200 μL 적절하다.
- 질량 분광기 ECM을 분석 (단계 4.5 이하 4.6에 기재된 바와 같이) 접시에서 SDS-PAGE 샘플 완충액을 회수하여 농축 된 샘플을 달성, 95 ° C로 재가열하고에서 동일한 분취 량을 사용하여 2-3 추가 판.
- 철저하게 요리의 모든 영역을 긁어 된 보장, 접시 떨어져 ECM을 긁어 셀 스크레이퍼를 사용합니다.
- 셀 스크레이퍼, 접시의 한쪽면에 샘플을 수집하고 (200)를 삭제튜브에 μL 피펫 팁.
- ECM 물질의 손실을 최소화하기 위하여 튜브에 세포 스크레이퍼 팁으로부터 임의의 잔류 SDS-PAGE 샘플 버퍼 추출물을 전송. 농축 된 시료의 경우, 95 ° C에 같은 SDS-PAGE 샘플 버퍼 나누어지는을 다시 열 2-3 추가 판에서 그것을 다시는-사용합니다.
- 7 % 또는 4-7% 구배 폴리 아크릴 아미드 겔을 사용하여 SDS-PAGE (12)에 의한 ECM 단백질을 해결.
참고 : 사전 스테인드 단백질 마커를 사용하는 것이 편리하다. - 고 분자량 ECM 단백질의 해상도를 증가시키기 위해, 37 kDa의 분자량 마커 근접 겔 및 분자량 마커 <37 kDa의 하단에 실행 겔을 실행 갖도록 겔 실행 시간을 연장한다.
- ECM 단백질의 프로테옴 분석을 위해 단백질 얼룩 젤을 염색하고 이미지를 캡처. 겔에서 관심의 밴드를 잘라 트립신을 소화, 매트릭스 보조 레이저 탈착하여 그들을 분석 / 이온화 (MALDI) - 질량 분석 <SUP> 13.
- 대안 적으로, ECM 추출물에 대한 포괄적 분석을 위해 전체 샘플을 분석 섹션으로 겔 레인 슬라이스 트립신로 소화하고, 액체 크로마토 그래피 질량 분석 (LC-MS) (14)을 수행한다.
- 다르게는, 15을 면역 블 들면, 고 분자량 ECM 단백질의 전달을 보장하기 위해 적어도 1 시간 10 분 (준 건식) 15 V에 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 막 상에 SDS-PAGE 겔에서 단백질을 전송할 . 폰소 s 얼룩 막에 전달 된 총 단백질을 시각화합니다.
- 단계 4.11 이어 존재를 확립 및 / 또는 개별 ECM 단백질 (15)의 반 정량 분석을 위하여 항체를 사용한다.
- 밤새 4 ° C에서 2 % TBS-트윈 20 (차단 버퍼)에서 (w / v)의 우유 멤브레인을 차단합니다. 블로킹 완충액에서 ECM 단백질에 특이적인 항체를 희석하기 위해 FIB (실온에서 1.5 시간 동안 멤브레인에 항체 부화ronectin는 트롬-1 1/150 희석에 1/600 항체를 희석; 보충 표 1).
- 같은 굴지 또는 튜 불린 (항 액틴 1 / 10,000 희석 및 안티 튜 불린은 1 / 5,000 희석) 등의 풍부한 세포 내 단백질에 대한 항체와 같은 오점을 다시 프로빙하여 ECM 분리의 품질을 테스트합니다.
Representative Results
에 기재된 프로토콜은 세포를 제거하고 세포 유래 ECM 남긴다 1.1-1.5 작용 단계. 프로토콜은 COS-7 세포를 커버 글라스에서 96 시간 동안 성장을 실시하고, 세포 유래 ECM는 형광 현미경으로 분석 하였다. DAPI 염색과 팔로이 딘에 각각 (도 1)에 따르면, 세포 핵 및 액틴 세포 골격의 손실에 의해 설정된 바와 같이 수산화 암모늄 처리를 효율적으로 세포를 제거 하였다. 2 M 우레아 세포의 추출은 수산화 암모늄만큼 효과적 아니었다 DAPI와 팔로이 딘 염색의 흔적은 치료 후 검출되었다. 8 M 우레아 수산화 암모늄과 유사한 효과를 (도 1)를 가지고 있었다. 이어서, 세포 유래 ECM은 수산화 암모늄 처리 전후 가시화 하였다 (2.1-2.11 단계). COS-7 세포가 단량체 적색 형광 단백질 (MRFP)로 형질 하였다는 트롬-1 C-터미널 삼량 (mRFPovTSP1C 1) -tagged(1)와 그리드 화 유리베이스와 35mm 접시에 성장.
mRFPovTSP1C을 표현하는 여러 건강한 세포를 포함 두 시간 후 도금, 적합한 그리드 광장 공 초점 현미경으로 가시화되었다. 참조 위상 콘트라스트 이미지는이 지역을 찍은 후 형광 촬영 된 영상은 2 시간 (도 2a)마다 1 분 동안 수행 하였다. 세포를 암모늄 하이드 록 사이드를 사용하여 제거하고, 디쉬에서 동일한 그리드 사각형은 위상차에 따라 재배치 된 후, 형광 현미경으로 다시 분석 하였다. 세포는 더 이상 그리드 사각형 존재하지 않지만 mRFPovTSP1C puncta의 특성은 (도 2A)와 같은 형광 현미경에 의해 검출 된 상기 ECM 내에 남아 있었다. 세포를 제거하기 전에 ECM에 기탁 mRFPovTSP1C는 형광 패턴 전과 세포의 제거 후를 비교하여 확인 하였다. 두 이미지에서 확인 된 형광 puncta의 (Figu2A 재, 예가는 화살표)가 ECM과 관련이있는 것으로 추정된다.
수산화 암모늄 처리 배양, 접착 세포로부터 천연 ECM을 분리 하였다. 인간의 피부 섬유 아세포 (HDF)은 96 시간 동안 커버 글라스에 성장했다. 세포는 암모늄 하이드 록 사이드를 사용하여 제거하고, ECM은 섬유의 특성과 그물 세공 염색 패턴 (16) (도 2B)를 보여 항 콜라겐 I 항체로 프로빙 하였다. 피브로넥틴 패터닝은 RCS 세포 (도 2c)의 제거 후 약 고정 비 투과성이 쥐의 연골 세포 (RCS) 및 ECM 내부를 조사 하였다. "테스트"세포 표현형 또는 기능적 연구에 대한 ECM에 다시 도금 될 수 있도록 ECM의 수산화 암모늄 분리은 멸균 조건 하에서 수행 하였다. 예를 들어, "테스트"은 COS-7 세포를 멸균 RCS 세포에 의해 생성 된 ECM 및 t로 2 시간 동안 배양 하였다암탉 그들은 자신의 ECM을 생산하는 COS-7 세포 (3.1-3.9 단계) (그림 3)과 비교하여, 고정 투과성이, 그리고 FITC-팔로이 딘 염색에 의해 F - 굴지 조직에 대해 분석 하였다.
큰 규모에서, 방법은 생화학 적 절차 ECM을 분리 하였다. 예를 들어, RCS 세포는 7 일간 개의 100mm 세포 배양 접시에 성장하고, 단계 4.1-4.7의 절차에 따름. 세포 유래 ECM 단백질 핫 SDS-PAGE 샘플 버퍼로 스크래핑하여 수집하고, 환원 조건하에 7 % 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 SDS-PAGE에 의해 분리 하였다. 겔은 단백질을 염색하고, 네 개의 주요 밴드가 각각 분리하고, 질량 스펙트럼 (도 4a)로 분석 하였다. 5 / 연골 올리고머 기질 단백질 (TSP5 / COMP) 및 matrilin-1 트롬 피브로넥틴을 포함하여 ECM 단백질의 수, 1 (TSP1)을 트롬은 (그림 4B) 확인되었다.
대안 적으로, ECM의 소규모 제제는 면역 블롯에 의해 평가 될 수있다. 예를 들어, ectopically mRFPovTSP1C이 방지 RFP 항체 (도 4c)을 사용하여 PVDF 막에 옮기고, RFP 조사해서, SDS-PAGE로 분리하고, 발현 COS-7 세포에서 세포 유래 ECM. 이 기술은 TSP1 (mRFPovTSP1C)의 기본 삼량과 TSP1 C 말단 영역 (MRFP-TSP-5-1C) (17) (도 4C)의 펜타 엔지니어드 사이의 증착의 차이를 감지 할 정도로 민감하다. HDF의 내인성 ECM을 조사하기 위해, 세포 용 해물 또는 절연 ECM에서 특정 단백질의 존재는 면역에 의해 검사 하였다. 풍부한 세포 내 단백질 α-tubulin의 및 β - 굴지는 격리 된 ECM (그림 4D) 결석했다 반면 특성 ECM 단백질 피브로넥틴과 트롬-1은 ECM에서 검출되었다.
그림 1 : 셀 제거하는 방법의 비교. COS-7 세포는 2 % PFA로 고정 된 커버 96 시간 동안 고밀도로 성장하고, 0.5 % 트리톤 X-100으로 투과 화, 또는 세포 제거에 나타낸 바와 같이 처리 하였다 하였다. 커버 슬립은 핵을 시각화하는 F - 굴지 및 DAPI를 시각화하는 FITC-팔로이 딘으로 염색 하였다. 스케일 바는 25 μm의 =. 이 수치는 세포 과학 (11)의 저널의 출판물에서 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 격리 된 ECM에서 ECM 단백질의 식별. 의 (A) 위상차 형광 이미지mRFPovTSP1C을 표현하고 2 시간 동안 유리 바닥 격자로베이스와 35mm 접시에 성장 COS-7 세포. 이미지는 이전과 수산화 암모늄에 의한 세포의 제거 후 나타낸다. 그리드 문자의 가장자리가 점선으로 위상 콘트라스트 이미지에 표시됩니다. 흰색 화살표는 이전과 세포 제거 후 존재 형광 puncta의 예를 나타냅니다. I 간접 면역 형광에 의해 HDF의 ECM 콜라겐의 (B) 검출. HDF는 96 시간 동안 성장시키고 수산화 암모늄을 제거하고, ECM은 ECM이 단독 FITC 접합 항 - 토끼 이차 항체로 염색 된 인간 섬유 성 콜라겐 I. 대해 염색 하였다. 간접 면역 형광 검출로 (C) RCS 세포 주위에 또는 격리 된 RCS ECM 내 피브로넥틴의 현지화. RCS 세포는 2 % PFA로 고정 48 시간 동안 성장 및 피브로넥틴과 DAPI 염색 하였다. 병렬 접시에서 세포를 20 mM의 수산화 암모늄을 제거하고, ECM은 fibr위한 염색onectin 및 DAPI와. 세포는 단독 FITC 접합 항 - 마우스 IgG 항체로 염색 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 기능 연구 멸균 ECM의 사용. RCS "매트릭스 제조자"세포를 커버 글라스에서 48 시간 성장 후, 세포를 제거하기 위해 멸균 조건하에 20 mM의 수산화 암모늄으로 처리 하였다. COS-7 "테스트"세포는 0.5 % 트리톤 X100에 투과성이 2 % PFA로 고정, 또는 2 시간 동안 고립 된 RCS ECM없이 된 커버에 도금하고, 핵을 시각화하는 F - 굴지 및 DAPI를 시각화하는 FITC-팔로이 딘으로 염색 하였다 . RCS ECM에 도금 COS-7 세포는 더 광범위하게 확산 및 대형 미사 번들 (예가는 화살표) 및 에지 멍을 형성레. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : SDS-PAGE, 질량 분석, 또는 면역 블 롯팅에 의해 격리 된 ECM에서 단백질의 식별. (A) RCS 세포를 7 일 동안 성장시키고 20 mM의 수산화 암모늄을 제거 하였다; ECM을 100 mM의 DTT를 함유하는 뜨거운 SDS-PAGE 샘플 버퍼에 긁어 하였다. 전자 재료 제조는 환원 조건하에 7 % 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 SDS-PAGE에 의해 분리 하였다. 네 중요한 밴드 (화살표 1-4) 단백질 염색으로 확인 하였다. RCS의 ECM 대역 1-4 (B) 단백질을 MALDI 질량 분석에 의해 확인되었다. (C) 중 mRFPovTSP1C (삼량 체) 또는 MRFP-TSP-5-1C (량체)는 48 배양 발현하는 COS-7 세포H, 20 mM의 수산화 암모늄을 제거하고 있었다 ECM 100 mM의 DTT를 함유하는 뜨거운 SDS-PAGE 샘플 버퍼에 고립. 전자 재료 제조는 PVDF 막으로 전달 환원 조건하에 7 % 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 항 RFP 항체로 프로빙 하였다. 이 패널은 생명 보고서 (17)의 출판물에서 수정됩니다. (D) HDF 96 시간 동안 재배 한 후 세포를 제거하기 위해 PBS 중 2 % 데 옥시 콜산 (파쇄) 또는 20 mM의 수산화 암모늄으로 처리 하였다. ECM을 뜨거운 SDS-PAGE 샘플 버퍼로 스크랩 하였다. 나타낸 바와 같이, 두 개의 분획하는 PVDF 막으로 전달 환원 조건 하에서 10 % 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 SDS-PAGE로 분리 한 항체로 프로빙 하였다. 각 패널에서, 분자량 마커의 위치를 kDa의에 표시됩니다. 이 파이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오gure.
Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계
이 방법은 ECM의 성공적인 분리 및 분석을 위해 따라야하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 예를 들어, 수산화 암모늄이 세포를 제거하고, 분석 ECM을 분리하는데 사용된다. 수산화 암모늄은 어둠 수용액에서 안정하고, 실온에서 저장 될 수 있지만, 각각의 병은 단단히 사용 사이를 다시 밀봉한다. 가스 따라서 농도를 감소시켜 용액으로부터 증발 할 수 있기 때문에, 강하게 신선한 병마다 6~8주 시작 추천한다. 또한, 상기 작업 용액을 각각의 실험에 갓한다. 이는 세포가 완전히 탈 이온수에 풍부한 세척 제거되는 것이 필수적이다. 이 단계를 적절하게 수행하지 않는 경우, 세포 물질은 접시에 남아 및 다운 스트림 분석을 오염시킬 수 있습니다. 세포를 10 일 이상 성장 된 경우, 추가의 물 세척이 필요할 수있다. 그것은 n은 중요하다촬상시 ECM을 식별 할 때는주의가 필요하므로 ECM 절연 층은 일반적으로 셀 (11)에 비해 매우 얇고 OTE. SDS-PAGE 샘플 버퍼에 절연 ECM의 효율적인 추출을 위해, 샘플 버퍼는 환원제를 포함하는 것이 필수적이다. 전자 재료의 효과적인 제거를 위해 끓는 핫 샘플 버퍼가 사용되어야한다. ECM 샘플은 단백질 염색 또는 프로테오믹스 대한 SDS-PAGE 전기 영동에 의해 해결 될 것이다 실험을 위해, 샘플 버퍼 동일한 분취 량으로 ECM 여러 플레이트 가치를 스크랩하여 농축 샘플을 얻기 위해 중요하다.
수정 및 문제 해결
ECM 단백질의 생산과 분비는 세포 유형 사이에서 크게 달라질 수 있으므로, ECM의 분비 및 증착의 시간주기는 각각의 세포 유형에 대해 새로이 결정되어야한다. ECM 조성물 관계 t에 동적으로 변경된다는 점에 유의하는 것도 중요하다문화 18 오 세포 밀도 및 시간입니다. 실험 설계시 이러한 요인을 고려해야한다. 총 ECM 단백질의 상당한 양이 필요할 수 질량 분석법에 의해 분석 ECM을 추출 할 때 특히 명백하게,이 방법을위한 세포 유형의 선택이 중요하다.
기술의 한계
ECM 단백질의 매우 낮은 수준을 분비 세포는이 방법을 사용하기에 더 도전 할 것이다. 비 부착 세포, 3D 세포 배양, 또는 셀 침공 분석이 방법으로 ECM 격리를위한 현재 부적합하다. 이 방법은 표준 "2 차원"세포 배양에 사용하기에 가장 적합하다. 암모늄 수산화물 추출 완전히 ECM 셀의 상부면에 결합되고 분비 세포를 제거하지만, 비 - 교차 결합되기 때문에, ECM 단백질은 또한 아래에서 상기베이스의 주위 접시에 조립 ECM의 얇은 층을 남겨 제거 세포 (11, 17)의
기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성
절연 ECM 실험의 넓은 범위를 수행하는 능력은 세포 생물학, 조직 생리 맥락에서 중요하고, 또한, 조직 재생 및 조직 공학 분야에 대한 의미를 가진다. 상기 방법은 세포가 천연 가교 메커니즘과 기원의 세포 유형에 적합한 비율로 존재하는 각각의 ECM 단백질과, 그 나라의 크기 복잡한 ECM 구조를 조립하는 정제 된 콜라겐이나 정제 된 ECM 단백질로부터 형성된 겔에 비해 많은 장점을 갖는다. 예상 예를 들어, RCS ECM의 단백체 연구는 풍부한 matrilins 및 COMP / TSP5을 보여 주었다연골 ECM (19, 20) (그림 4). 일반적으로, 세포 유래 ECM의 분석은 공유 결합 가교를 초래 광범위한 다중 단백질 네트워크 많은 ECM 단백질의 불용성로서의 성질에 의해 방해되고, 또한, ECM의 잠재적 오염에 의해 세포 내 단백질 추출한다. 프로테옴 분석을위한 조직으로부터의 ECM 분획을 분리하기위한 다단계 절차 21 식별 된 단백질의 전체 세트 ECM 단백질의 8 %를 수득 하였다. 그러나, ECM 단백질의 펩티드는 확인 된 총 펩티드의 73 %였다. 세포 유래 ECM의 분리 및 분석 방법이 신속하고 안정적으로 ECM 단백질을 유지하는 동안 세포 물질을 제거한다. 이 방법은 세포 유형 하류 다양한 애플리케이션에 사용하고 세포 배양에 ECM 생물학 및 세포 ECM 상호 작용의 분석을 용이하게 할 수있다. 상기 방법은 서로 다른 스케일에 적용될 수 있는지 우리 프로토콜 세부 EXP 다양한를 해결ECM 조직, 역학, 또는 조성물에 관한 erimental 질문과 세포에 고립 된 ECM의 기능적 효과.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
미래를 찾고, 상기 방법은 3 차원 세포 배양에 사용하도록 구성 될 수있다; 이 생리 학적 관련성을 확장합니다. Decellularized 기본 조직이 손실되거나 손상된 조직의 재생 및 심장 장애 (22) 이후로 이식의 대안 등의 발판으로 큰 잠재력을 가지고있다. 이 도너 가용성 및 면역 거부의 문제점을 극복 할 수있는 잠재력이있다. 이 보고서에 기재 한 방법의 미래 애플리케이션은 또한이 방법의 범위를 증가 3D 세포 배양 또는 조직의 탈세 포화와 함께 사용을 조사 할 수있다.
Acknowledgments
우리는 RCS의 ECM의 단백질 체학 분석을 수행하기위한 박사 벨린다 윌러드, 단백질 체학 및 대사 체학 연구소, 러너 연구소, 클리블랜드 클리닉에 가장 감사하고 있습니다. 우리는 JCA에, 번호 K018043을 부여 theMedical 연구위원회 영국의 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
| Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 h. IF: 1/200 |
| Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 h |
| Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2,000 for 2 h |
| Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10,000 for 1.5 h |
| Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5,000 for 1.5 h |
| Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50 mg/mL in DMSO. 1/50 for 45 min |
| FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 h |
| FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 h |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50,000 for 1 h |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100,000 for 1 h |
| Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
| Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg/mL ascorbic acid |
| Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
| Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
| NH4OH, 28-30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2% (v/v) in PBS |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2% (v/v) final concentration |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5% (v/v) final concentration |
| GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
| Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
| Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
| PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
| Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
| WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
| High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
| SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
| Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot | |||
References
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