Abstract
Frigivelsen af ekstracellulære vesikler (EVS), herunder små endosomale-afledte exosomer (Exos, diameter <100 nm) og store plasma membran-afledte mikrovesikler (MVS diameter> 100 nm) er en grundlæggende cellulær proces, der forekommer i alle levende celler. Disse vesikler transportproteiner, lipider og nukleinsyrer specifikke for deres celle af oprindelse og in vitro-undersøgelser har fremhævet deres betydning som formidlere af intercellulære kommunikation. Elbiler succes er blevet isoleret fra forskellige legemsvæsker og især elbiler i blod er blevet identificeret som lovende biomarkører for cancer eller infektionssygdomme. For at muliggøre studiet af MV subpopulationer i blod, præsenterer vi en protokol for standardiseret isolering og karakterisering af MV'er fra perifere blodprøver. MV'er pelleteres fra EDTA-antikoaguleret plasmaprøver ved differentiel centrifugering og har typisk en diameter på 100 - 600 nm. På grund af deres større størrelse, kan delet undersøges ved flowcytometri, en teknik, der rutinemæssigt anvendes i klinisk diagnostik og tilgængelig i de fleste laboratorier. Flere eksempler til kvalitetskontrol assays af de isolerede MV'er vil blive givet, og markører, der kan anvendes til skelnen mellem forskellige subpopulationer MV i blod vil blive præsenteret.
Introduction
I de sidste år har mange in vitro-undersøgelser har vist, at ekstracellulære vesikler (elbiler) spiller en vigtig rolle i intercellulær kommunikation. Levende celler konstant kaste vesikler, der adskiller sig i størrelse, indhold og biogenese. De bedst undersøgte elbiler er exosomer, der stammer fra den endosomale system, hvor de lagres som intraluminale vesikler i multivesikulære organer. Når sidstnævnte sikring med plasmamembranen, er de indeholdte vesikler udgivet som exosomer (Exos, diameter 30 - 100 nm 1). En anden population af EV, der har fået stigende opmærksomhed i de seneste år er store mikrovesikler (MVS diameter 100 - 1000 nm), som knop off direkte fra plasmamembranen 2.
Begge typer af vesikler omgivet af et lipiddobbeltlag og indeholder nukleinsyrer, fx DNA, mRNA eller miRNA 3 - 5, og et væld af proteiner, som de kan overføre til tilstødende Calen. Generelt har proteinsammensætningen af vesiklerne afspejler tilstanden af cellen for oprindelse, synes nogle proteiner selektivt at blive målrettet og beriget på elbiler 1. En stor forskning interesse er at karakterisere elbiler fra unormale og syge celler med henblik på at definere specifikke EV signaturer, som kan tillade brugen af elbiler som nye biomarkører. Især i cancer, som ofte tumoren selv er ikke let tilgængelig, kan flydende biopsier målrettet tumorspecifikke elbiler i blod tillade overvågning af terapi responser eller hjælpe karakteriserer den primære tumor uden behov for invasive procedurer 6.
Faktisk elbiler er allerede blevet isoleret fra forskellige kropsvæsker, herunder urin 7, CSF 8, modermælk 9 eller blod 10. Flere undersøgelser identificeret ændringer i EV tæller og sammensætning i forskellige humane sygdomme. For eksempel i sepsispatienter antallet af pro-koagulerende MV'er ersteget betydeligt i forhold til raske personer 11. Også hos patienter med svær cerebral malaria kan observeres en stigning i de samlede MV'er i blod og tællinger af blodpladeafledte MV'er korrelerer med koma dybde og trombocytopeni 12. Andre undersøgelser rapporterer forhøjede antal endotelafledt vesikler i patienter med systemisk lupus erythematosus eller hjertesvigt og i tilfælde af sidstnævnte, dette korrelerer med en højere sandsynlighed for kardiovaskulære hændelser 13,14.
Især i kræft, er elbiler i blod i øjeblikket drøftes som nye biomarkører med diagnostisk og prognostisk værdi. Niveauer af MV'er udtrykker tumorassocierede proteiner, såsom MUC1, EGFR eller FAK synes at være forhøjet i blodet hos brystcancerpatienter 15,16. Også for Exos, de seneste undersøgelser har vist, at blod-afledte Exos bærer tumor antigener, såsom glypican-1 for kræft i bugspytkirtlen eller Del-1 for brystkræft tillade tidlig sygdom debeskyttelse med høj specificitet og følsomhed 17,18. Endvidere kan serum-afledte tumor Exos indeholde DNA, som kan anvendes til påvisning af mutationer, såsom KRAS og p53 som foreslår deres anvendelse til terapi forudsigelse 19. Nylige fremskridt har vist, at analysen af Exos i blod af glioblastom patienter ved hjælp af en specifik mikrofluid chip tillader overvågning af behandlingen 20. Tilsammen disse resultater indebærer, at analysen af sygdomsspecifikke subpopulationer af vesikler giver værdifulde oplysninger om diagnose, prognose samt terapeutiske muligheder og succes.
Imidlertid isolering og analyse af Exos fra blod er tidskrævende, kræver særlig lab udstyr og er derfor endnu ikke egnet til rutinemæssig klinisk diagnosticering. I modsætning hertil kan MV'er isoleres meget hurtigere og, på grund af deres større størrelse, kan let analyseres ved flowcytometri uden behov for at koble dem til latexperler, som det er nødvendigt for Exos 18, 21. Således her præsenterer vi en protokol, som kan anvendes til den standardiserede isolering af MV'er fra blodprøver og den efterfølgende karakterisering af MV subpopulationer ved flowcytometri. Denne protokol vil gøre det muligt for yderligere undersøgelse og i dybden karakterisering af MV profiler i store patientgrupper som vil være nødvendige for at kunne bruge MV'er til dagligdags klinisk diagnostik.
Protocol
Alle forsøg, herunder mennesker er blevet godkendt af den lokale etiske komité (godkendelse nr. 3/2/14). For valg af patienterne skal det bemærkes, at der skal tages flere faktorer som alder, køn, nuværende terapiregimer, og mange flere kan påvirke MV komposition i blodet og dermed i betragtning forud for prøvetagning 22,23.
1. Fremstilling af plasmaprøver
- Tegn 1 - 2 rør med blod pr donor gennem en 21-gauge butterfly nål en Vacutainer blodprøvetagning rør indeholdende EDTA (1,6 mg / ml blod). Sørg for at vende røret (r) flere gange for at sikre en effektiv blod antikoagulation.
BEMÆRK: Den anbefalede mængde blod til efterfølgende flowcytometri og Western Blot-analyse er 5 - 15 ml. For at forhindre MV nedbrydning og tab, bør blodprøver håndteres <30 min efter blod tilbagetrækning. - Forbered plasmaprøver ved centrifugering af prøverne i 15 minutter ved 1.200 xg vedstuetemperatur (RT).
- Påfør en ventil filter for at hjælpe adskillelsen af plasma (= øvre lag) fra resterende blodlegemer (= nedre lag).
- Overfør plasmaet i et 15 ml rør.
- Centrifuger i 15 min ved 1500 xg, RT til pelletering større cellerester og fjerne de resterende blodplader.
- Supernatanten overføres til et 15 ml rør og gælder fortsætte med MV isolation eller opbevare prøver i op til 6 måneder ved -20 ° C.
BEMÆRK: De præsenterede protokol kan også anvendes til at isolere MV'er (og Exos) fra cellekultursupernatanter. For at gøre dette, dyrke cellerne ved 60 - 80% konfluens i 24 - 48 timer i dyrkningsmedium suppleret med vesikel-forarmet FCS, og derefter indsamle supernatanten. Centrifuger i 5 minutter ved 750 xg, 4 ° C for at depletere resterende flydende celler, fylde supernatanten til et nyt 15 ml rør og centrifugeres igen i 5 minutter ved 1500 xg, 4 ° C for at pelletere større cellerester. Denne supernatant kan derefter anvendes til isoleringen af MV'ersom beskrevet i trin fra 2,1 til 2,16.
2. Isolering af MV'er
- Overfør plasmaprøven i en egnet centrifugering rør. Om nødvendigt fylde rør med PBS for at fortynde prøven og forhindre kollaps af tyndvæggede rør under centrifugeringen procedure.
- Centrifuger i 35 minutter ved 14.000 xg, 4 ° C.
- Dekanter supernatant, holde rør vendt på hovedet og sat på et stykke køkkenrulle. Vent 3 - 5 min, indtil al resterende supernatant er blevet gennemblødt ind i håndklæde og derved fjernes fra prøven.
- Resuspender MV pellet i 1000 pi PBS og overføres til en 1,5 ml rør og centrifugeres i 35 min ved 14.000 xg, 4 ° C i en bordcentrifuge.
- Aspirer supernatanten.
- Resuspender MV pellet i 50 - 500 pi PBS, afhængigt af størrelsen af pelleten. Alternativt lyse MV'er direkte, fx i RIPA-buffer (150 mM NaCl / 0,1% SDS / 0,5% Na-deoxycholat / 1% Triton X-100/50 mM Tris, pH 7,2)til efterfølgende Western Blot-analyse. Opbevar MV'er ved -20 ° C. De vil forblive stabil i flere måneder, men undgå gentagne fryse-tø-cykler.
- Valgfrit: Bestem MV proteinkoncentration med et protein assay (f.eks Bradford eller Lowry metode) for at vurdere MV udbytter eller dosis MV'er for efterfølgende eksperimenter.
- Hvis yderligere Exos skal isoleres fra plasmaprøverne, dekanter supernatanten fra trin 2.3 i en ultracentrifugering rør og centrifugeres i 2 timer ved 110.000 xg, 4 ° C. Dekanteres som beskrevet i trin 2.3, resuspenderes Exo pellet i 1000 uL PBS og overføre i små (1,5 ml) ultracentrifugering rør.
- Ultracentrifuge i 2 timer ved 110.000 xg, 4 ° C, aspireres supernatanten og resuspender Exo pellet i 50 - 75 pi PBS eller RIPA buffer.
3. Karakterisering af MV'er ved flowcytometri
- Transfer 15 pi PBS + 1% vesikel-depleteret føtalt kalveserum (FCS) i en flowcytometri rør.
BEMÆRK: vesikel-depleteret FCS fremstilles ved centrifugering varmeinaktiveret (30 minutter ved 56 ° C) FCS i 18 timer ved 110.000 x g og filtrering af supernatanten gennem et 0,2 um filter som tidligere 24 beskrevet. - Tilsæt 5 ug (i tilfælde af lave udbytter 3 ug også kan anvendes) af MV'er i PBS.
- Inkuber prøver til 30 minutter ved stuetemperatur for at blokere uspecifikke bindingssteder på MV overfladen og derved reducere baggrundsfarvning.
- Tilføj et fluorescensmærket antistof mod proteinet af interesse. Titrere mængden af antistof anvendes til før anvendelse for at bestemme den optimale koncentration og garanterer et lavt signal-til-støj-forhold farvningen. Sørg også omfatte ét rør med ufarvede MV'er som negativ kontrol og et rør af MV'er farvet med den matchende isotypekontrolantistof ved samme koncentration (fx hvis 1 ug antistof anvendes, også anvende 1 ug af isotype kontrol entibody) at kvantificere baggrundsfarvning.
BEMÆRK: Det er også muligt at udføre flerfarvet flowcytometri ved at føje flere antistoffer koblet til forskellige fluorochromer. - Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Tilsæt 250 pi PBS og fortsætte med måling af prøven under anvendelse af et flowcytometer.
- I tilfælde af at prøverne ikke kan måles med det samme, tilsættes 150 pi PBS og 50 pi 4% paraformaldehyd (PFA) fastsætte prøver og opbevares ved 4 ° C. ADVARSEL: PFA er giftigt. Brug handsker og passende personlige værnemidler.
- Reducer tærsklen til flowcytometeret til den lavest mulige værdi og søge efter MV befolkning ved hjælp af en forward scatter (FSC) versus sidespredning (SSC) plot i logaritmisk skala. Gate på MV befolkning og evaluere det fluorescerende signal i en tilsvarende histogram.
4. Karakterisering af MV'er ved Western blotting
- Resuspender MV pellet direkte ien egnet lyseringsbuffer (f.eks RIPA-buffer).
- I tilfælde MV pellet allerede er resuspenderet i PBS, fortynde det på mindst 1: 1 i en egnet lyseringsbuffer (f.eks RIPA-buffer).
- Bestem proteinkoncentration MV prøven, fx ved Lowry-assay.
- Forbered 10 - 20 ug MV'er i 22,5 uL RIPA buffer. Derpå tilsættes 7,5 pi 4x Laemmli loading buffer og varme i 5 minutter ved 95 ° C.
- Load prøverne på en polyacrylamidgel og udfør elektroforese og immunoblotting ifølge standard protokoller.
- Efter overførsel af proteinerne på membranen, udføre en Ponceau-farvning som en loading kontrol i overensstemmelse med standardprotokoller.
- Affarves membran i TBST i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Blok membran i 30 minutter op til 1 time ved stuetemperatur i 5% BSA i TBST.
- Inkuber membranen med det primære antistof ved 4 ° C natten over eller i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vask membranen med TBST 3 x 5 min.
- Inkuber membranen med HRP-koblet sekundært antistof ved en fortynding på 1: 10.000 i 5% BSA. Bemærk: I tilfælde af høje baggrundssignaler, bruge mælkepulver i stedet for BSA.
- Vask membranen med TBST 3x 5 min.
- Udvikle membran med en ECL detektionsreagens og detektere signaler via kemiluminescens film eller et kemiluminescens imaging system.
BEMÆRK: For at skelne MV'er fra Exos, proteiner som tubulin, actinin-4 eller mitofilin kan bruges som bør primært være til stede på MV'er 16,25. Vær opmærksom på at de fleste tetraspanin antistoffer (f.eks CD9, CD81), der anvendes som markører for Exos, ikke virker under reducerende betingelser og bør derfor fremstilles i ikke-reducerende ladningsbuffer efterfulgt af opvarmning i 10 minutter ved 70 ° C.
Representative Results
For at kvantificere udbyttet af MV'er som kan isoleres ved fremgangsmåden beskrevet protokol beregnede vi mængden af MV'er isoleret fra blodprøver fra 10 donorer. MV udbytte, som blev vurderet i en Lowry protein assay, varierede fra 10 op til 30 ug med en middelværdi på 19,2 ug MV'er pr ml blod (tabel 1). Koncentrationen partikel bestemt ved nanopartikel sporing analyse (NTA) varierede fra 1,66 x 10 9 til 2,36 x 10 10 med et gennemsnit på 5,9 x 10 9 partikler pr ml plasmaprøve (tabel 2). Yderligere karakterisering af MVS ved transmissionselektronmikroskopi viste en population af vesikler med en diameter> 100 nm, der blev omgivet af et lipiddobbeltlag og indeholdt ingen celleorganeller (figur 1A). NTA bekræftet, at størrelsen af de isolerede MV'er varierede fra 100 op til 600 nm (figur 1 B) og den gennemsnitlige MV størrelse var 201nm (figur 1C). Farvning for typiske MV og exo markører ved Western blotting viste, at de isolerede MV'er var positive for tubulin og kun viste en lille ekspression af CD9 og CD81, mens Exos var negative for tubulin og beriget i CD9 og CD81 (figur 2).
Analyse af de isolerede MV'er ved flowcytometri (figur 3A) afslørede en defineret vesikel population, der kunne gated anvendelse af de samme parametre som normalt anvendes til MVS isoleret fra cellekultursupernatanter og det var klart forskellig fra baggrundssignalet opnået ved måling af PBS + 1% vesikler-depleteret FCS uden tilsætning af MV'er (figur 3B). For at analysere de forskellige MV populationer til stede i blodet, blev MV'er farvet med etablerede markører for de forskellige blod cellepopulationer, f.eks CD62P for blodpladeafledte MV'er, CD45 for leukocytafledte MV'er, CD235a forrøde blodlegemer afledt MV'er og CD62E for endotheliale celle-afledt MV'er (figur 4). Denne karakterisering viste, at procentdelen af MV subpopulationer afveg blandt de undersøgte donor blodprøver, mens størstedelen af MV'er syntes at være kastet af blodplader i alle prøver.
Figur 1: Størrelse Fordeling af MV'er Isoleret fra perifert blod. A, Isolerede MV'er blev visualiseret ved transmissionselektronmikroskopi. B, repræsentant nanopartikel sporing analyse (NTA) af MV'er illustrerer størrelsesfordelingen af vesiklerne. C, Den gennemsnitlige MV størrelse fra 10 uafhængige præparater blev målt ved NTA (middel). Klik her for at se alArger version af dette tal.
Figur 2: Karakterisering af isolerede MV'er ved Western Blotting. Differentiel proteinekspression på de isolerede MV'er og Exos fra to donorer blev visualiseret ved Western Blotting. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Analyse af MV'er ved flowcytometri. A MVS er først visualiseret på forward (FSC) versus sidescatter (SSC) grunde til gate på de respektive MV befolkning. Efterfølgende er disse MV'er karakteriseret for antigenet af interesse ved under anvendelse af fluorescensmærkede antistoffer rettet mod antigenet. B, Typisk FSC versus SSC grunde til MVS isoleret fra plasma af to donorer. Som sammenligning er en typisk plot for tumorcelle-afledte MV'er fra A549 lungecancerceller isoleret fra cellekultursupernatanten samt en negativ kontrol kun anvender PBS + 1% vesikel-depleteret FCS uden MV'er vist til højre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Karakterisering af isolerede MV'er ved flowcytometri. MV'er fra tre donorer blev karakteriseret til ekspression af etablerede blod cellemarkører (rød) ved flowcytometri. De respektive isotypekontroller er vist med gråt.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Prøve | MVS / mL blod [ug] |
| # 1 | 29.4 |
| # 2 | 10.3 |
| # 3 | 15.2 |
| # 4 | 31.1 |
| # 5 | 18.8 |
| # 6 | 22,7 |
| # 7 | 19.1 |
| # 8 | 18.7 |
| # 9 | 15,0 |
| # 10 | 11.9 |
Tabel 1: MV Protein Udbytte fra perifert blod prøver.
| Prøve | MVS / mL plasma [partikel tæller] |
| # 1 | 6.42E + 09 |
| # 2 | 2.36E + 10 |
| # 3 | 1.88E + 09 |
| # 4 | 6.51E + 09 |
| # 5 | 3.48E + 09 |
| # 6 | 4.57E + 09 |
| # 7 | 2.09E + 09 |
| # 8 | 1.66E + 09 |
| # 9 | 2.54E + 09 |
| # 10 | 6.20E + 09 |
Tabel 2: MV Particle Udbytte fra perifert blod prøver.
Discussion
Nylige undersøgelser af elbiler i blodet har vist, at EV sammensætning og tæller ændrer sig under årsagen til flere sygdomme. Derfor er analyse og yderligere karakterisering af disse elbiler er af stor interesse for yderligere at vurdere deres potentielle anvendelse som sygdom biomarkører for diagnose og prognose eller evaluere terapi svar. Protokollen præsenterer vi her tillader isoleringen af vesikler med en diameter på op til 600 nm, som ikke indeholder celleorganeller. Disse observationer er i overensstemmelse med den nuværende definition af MV'er og udelukke tilstedeværelsen af apoptotiske legemer 2. Ved hjælp af Western blot, var vi i stand til at vise, at de isolerede MV'er viser en høj ekspression af tubulin, mens tetraspanins CD9 og CD81, der ofte bruges som Exo markører blev kun lidt til udtryk. Dette bekræfter, at MV'er adskiller sig fra Exos og passer til de seneste dybdegående karakterisering og sammenligning af de to EV befolkninger ved proteomics 25.
indhold "> Under erhvervelsen af blodprøver, er det vigtigt at holde tiden mellem venepunktur og plasma forberedelse så kort som muligt for at forhindre MV nedbrydning. Desuden kunne forlænget opbevaring af blodprøver føre til aktivering af blodlegemer forårsager forøget MV kaste og i sidste ende apoptose, som resulterer i frigivelsen af apoptotiske legemer. En anden vigtig overvejelse for MV isolation er at forhindre kontaminering af MV præparater med plasmaproteiner eller mindre Exos. Derfor er det vigtigt at fjerne så meget af supernatanten som muligt efter nedspinning MVS ved 14.000 x g. Da pelleten er normalt synlige og stramt fastgjort til væggen af røret, supernatanten kan let fjernes med en pipettespids. i modsætning til Exos som har tendens til at danne aggregater under fremstillingen af højhastigheds-ultracentrifugering og er ofte svært at resuspendere, er dette problem ikke opstå med MV'er.Vores undersøgelse viser, at det er muble at karakterisere MV subpopulationer stede i blod ved flowcytometri. Selv detektionsgrænsen for de fleste flowcytometre er ca. 200 - 300 nm, blev MV'er reproducerbart målt i donoren samt cellekultur prøver med de samme parametre for analyse og porte, der klart er tilladt deres skelnen fra baggrundssignaler. Det er vigtigt at kontrollere før målingerne, at PBS er anvendt til analyse indeholder ingen forurenende partikler, der kan forårsage en høj baggrund i flowcytometri (figur 3). Selvom nogle mindre MV'er ikke vil blive fanget i en flowcytometrisk tilgang, vi har registreret MV'er fra alle større blod cellepopulationer (f.eks blodplader, røde blodlegemer, leukocytter, endotelceller). I vores analyser brugte vi standard markører for de forskellige blodlegemer, der tidligere er blevet fundet på MV'er 26 - 29. Det skal bemærkes, at for at opnå de bedst mulige resultater ved flowcytometri, than mængde og koncentration af alle antistoffer skal titreres på en MV prøve udtrykker antigenet af interesse. Hvis specifikke MV subpopulationer i blod skal identificeres med højere specificitet, er det muligt at udføre dobbelt farvning mod to forskellige antigener til stede på de respektive MV'er og kun overveje alle dobbelt positive MV'er til efterfølgende analyser 23. I øjeblikket er der bestræbelser på at fastlægge en standard sortiment af MV subpopulationer i blod fra raske individer 23,30. Disse undersøgelser har allerede vist, at blodpladeafledte MV'er udgør den største bestand af MV'er i blod, som er i overensstemmelse med vores observationer.
En fordel ved flowcytometri at karakterisere MV prøver er, at denne metode allerede er veletableret til diagnostiske formål i de fleste kliniske centre, som ville give den mulige brug af MV'er som biomarkører i daglig klinisk diagnostik. Tidligere undersøgelser af elbiler i blod, som har det meste fokused på mindre Exos, stole på enten specifikke sortering procedurer til selektivt analysere ønskede Exo målgruppen 31,32 eller kræve en tidskrævende (2 dage) isolation proces med kobling af Exos for latex perler før analyse 18. Vore egne upublicerede observationer antyder, at den flowcytometrisk analyse af MV'er fra fuldblodspræparationer selv muliggør påvisning af MV'er såsom tumorafledte MV'er uden en sådan udvælgelsesproces.
Tilsammen protokollen præsenteres her muliggør hurtig isolering af MV'er fra perifere blodprøver med standard laboratorieudstyr og deres efterfølgende karakterisering ved anvendelse af flowcytometri og vestlige Blotting. Hele processen kan udføres i omkring 2 timer, som vil lette kommende undersøgelser af MV profiler i patienternes blod, der er nødvendige for at vurdere potentialet i MV'er som sygdom biomarkører.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| butterfly needle (21 gauge) | Hospira Deutschland GmbH | 490P29201 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roth | 8076.3 | For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6 |
| For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20 | |||
| CD235a-PE | Beckman Coulter | A07792 | use 5 µl for staining |
| CD45-FITC | Beckman Coulter | 7782 | use 5 µl for staining |
| CD62E-PE | Biolegend | 336008 | use 0.8 µg for staining |
| CD62P-PE | Biolegend | 304905 | use 0.1 µg for staining |
| CD81 antibody | Biolegend | 349501 | 1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| CD9 antibody | Immunotools | 21270091 | 1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 | Fujitsu Life Sciences | ||
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 5000112 | |
| ECL detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| EDTA vacutainers for blood collection | Sarstedt | 01.1605.001 | |
| FACSCanto II | BD Biosciences | ||
| fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated (30 min, 56 °C) |
| filter 0.22 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HRP-coupled anti-mouse secondary antibody | santa cruz | sc-2005 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody | santa cruz | sc-2004 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| 4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 | Roth | K929.1 | |
| microfuge SIGMA 1-15K | Sigma Laborzentrifugen | ||
| milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) | BioRad | 170-6404 | |
| multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
| NanoSight LM10 | NanoSight Ltd. | ||
| PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | |
| perfusor syringe 50 mL | Braun | 8728844F | |
| Ponceau-S staining solution | PanReac AppliChem | A2935,0500 | |
| rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL) | Beckman Coulter | ||
| rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL) | Beckman Coulter | ||
| tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) | BD Biosciences | 352054 | |
| tubes for ultracentrifugation (15 mL) | Beckman Coulter | 344061 | |
| tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) | Beckman Coulter | 343778 | |
| Tubulin antibody | Millipore | 05-829 | 1:5,000 in 5%BSA in TBST |
| ultracentrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | ||
| ultracentrifuge TL-100 | Beckman Coulter | ||
| valve filter Seraplas V15 | Sarstedt | 53,428 | |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (0), (2015).
- Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180 (2011).
- Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
- Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
- Pisitkun, T., Shen, R. -F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
- Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).
- Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
- Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
- Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).
- Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
- Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
- Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
- Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
- Moon, P. -G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
- Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2 (0), (2013).
- Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3 (0), (2014).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
- Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
- Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
- Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
- Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
- Rupp, A. -K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
