Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

doi: 10.3791/55063 Published: January 15, 2018

Summary

وكان الهدف من هذه الدراسة وضع التكنولوجيات التي تسمح لتوصيل الجينات الناجحة في خلايا أولية الطبيعية (ناغورني كاراباخ) القاتل. ديكستران بوساطة توصيل لينتيفيرال للإنسان أو الماوس ناغورني كاراباخ الخلايا النتائج الأولية في أعلى كفاءات التعبير الجيني. هذا الأسلوب لتوصيل الجينات سيحسن ناغورني كاراباخ خلية التحوير الوراثي.

Abstract

تم توصيل فعالة من جينات محددة داخل الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية تحديا كبيرا. ترانسدوكشنز ناجحة ذات الأهمية الحاسمة لتحديد دور الجينات للمصلحة في التنمية، والتمايز، ووظيفة خلايا ناغورني-كاراباخ. التطورات الأخيرة المتعلقة بمستقبلات مستضد تشيميريك (السيارات) في العلاج المناعي السرطان إبراز الحاجة إلى طريقة فعالة لتوصيل الجينات الخارجية إلى الخلايا الليمفاوية المستجيب. كفاءات ترانسدوكشنز لينتيفيرال بوساطة الجينات في الإنسان الأولية أو الماوس ناغورني كاراباخ الخلايا تبقى منخفضة إلى حد كبير، وهو عاملاً معوقا. إظهار التقدم الذي أحرز مؤخرا باستخدام البوليمرات الموجبة، مثل بوليبريني، كفاءة توصيل جينات محسنة في خلايا تي. ومع ذلك، فشل هذه المنتجات تحسين كفاءة توصيل الخلايا ناغورني-كاراباخ. هذا العمل يبين أن ديكستران، السكاريد غلوكان تشعبت، تحسن كبير في كفاءة توصيل للإنسان والماوس الأساسي ناغورني كاراباخ الخلايا. منهجية توصيل استنساخه بشدة هذا يوفر أداة مختصة للبشرية خلايا ناغورني كاراباخ الأولية، التي يمكن أن تحسن إلى حد كبير تطبيقات توصيل الجينات السريرية ومن ثم ناغورني كاراباخ المستندة إلى خلايا السرطان المناعي. ترانسدوسينج

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

خلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية هي السكان اللمفاوية الرئيسية ل نظام المناعة الفطرية1. ناغورني كاراباخ الخلايا تعمل كمدافعين عن السطر الأول من الاستجابة المناعية المضيف ضد الأورام والالتهابات2،،من34. ناغورني كاراباخ الخلايا أيضا دور مركزي في التنمية للتسامح من خلال إفراز السيتوكينات قوية والمستقطبات5. نظراً لقدرتها القوية على الهدف والقضاء على الخلايا السرطانية، تجري تجارب سريرية متعددة لتقييم المستمدة من المانحين ناغورني كاراباخ الخلايا البشرية أدوبتيفي المناعي للسرطان6،7. خلافا لخلايا T، علم الأحياء التنموي للخلايا ناغورني كاراباخ لم يكون جيدا تتسم8. وهذا الافتقار إلى المعرفة جزئيا بسبب عدم وجود تقنيات كفاءة إيصال جينات فائدة للماوس أو الخلايا البشرية الأولية في ناغورني كاراباخ. ولهذه الأسباب، قد أجريت معظم ناغورني كاراباخ-خلية دراسات في خطوط الخلايا بدلاً من الخلايا الأولية. ولذلك، الحاجة إلى بروتوكول موثوقة وفعالة ترانسدوسي الابتدائي ناغورني كاراباخ الخلايا التي تحتوي على الجينات التي تهم أمر حاسم.

وكان الهدف العام لهذه الدراسة صياغة طريقة متسقة وموثوق بها الذي يمكن ترانسدوسيد الخلايا ناغورني كاراباخ البشرية أو مورين الأولية بلينتى-أو الجزيئي.

أجريت الدراسات السابقة التي حاولت معالجة هذه المشكلة، إلى حد كبير استخدام التحويل عابرة من خلايا أولية في ناغورني كاراباخ. وهذا يشمل بلازميد تعداء9،10، فيروس ابشتاين-بار (EBV)/ناقل للفيروس الهجين11، متجهات اللقاحية12،13، و Ad5/F35 موجهات أدينوفيرال تشيميريك14. وعلى الرغم من كفاءة هذه التقنيات المتواضعة، يجعلها طبيعة عابرة لتوصيل غير صالحة للاستخدام طويل الأجل ناغورني كاراباخ الخلايا المحورة وراثيا. عدد قليل من الدراسات الأخيرة استخدمت نواقل فيروسات النسخ العكسي إلى ترانسدوسي الخلايا ناغورني كاراباخ، التي تتطلب دورات متعددة من العدوى تحقيق مستوى مقبول من الجينات التعبير11،15. على عكس نواقل فيروسات النسخ العكسي، يمكن استخدام ناقلات لينتيفيرال خلايا المضيف النووية استيراد الآلات إلى ترانسلوكاتي الفيروسية المجمع قبل الاندماج في النواة. وهذا عاملاً معوقا في النسخ المتماثل الفيروس في عدم تقسيم الخلايا التي تتضمن خلايا أولية في ناغورني كاراباخ.

التفاعلات بين مختلف مستقبلات سطح الخلية والجزيئات الفيروسية تسمح بامتصاص الفيروسي داخل الخلية. التعاقدات الأولية بين البروتينات الفيروسية المغلف وعلى مستقبلات المضيف المشابهة قد تكون محدودة بسبب الاتهامات السلبية المحتملة القائمة بين هذين. والأساس المنطقي وراء العديد من تقنيات توصيل هو أن إضافة البوليمرات الموجبة، مثل بوليبريني (Pb) أو كبريتات البروتامين (PS) ديكستران، يمكن إعطاء شحنة موجبة لمستقبلات سطح الخلية وزيادة ربط المغلف الفيروسي وبالتالي البروتينات. هذا سيزيد كفاءة الانصهار وامتصاص الجزيئات الفيروسية ب الخلايا16. على الرغم من أن أفيد بأن الجريدة الرسمية أو PS يمكن تحسين نقل الجينات في خلايا T17، تطبيقها لم يكن أي تأثير في كفاءة توصيل خلايا أولية في ناغورني كاراباخ. وعلاوة على ذلك، لم يتم إجراء تحليل مقارن بين هذه الكاشفات باستخدام خلايا أولية في ناغورني كاراباخ. في هذه الدراسة، تم مقارنة كفاءة توصيل للبوليمرات الموجبة ثلاثة. وتبين النتائج أن ديكستران فقط بين هذه البوليمرات الموجبة ثلاثة، يعزز إلى حد كبير كفاءة توصيل الفيروسية في الماوس والخلايا البشرية الأولية في ناغورني كاراباخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

جميع البروتوكولات الحيوان اتباعها معاملة إنسانية وأخلاقية للحيوانات، ووافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) داخل مركز البحوث الطبية الحيوية (BRC) كلية ويسكونسن الطبية (صحة الأم والطفل)، ميلووكي، ويسكونسن. وأقر استخدام الدم المحيطي البشري الخلايا وحيدات النوى (ببمكس) بالمؤسسية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) معهد بحوث الدم من "مركز الدم من ولاية ويسكونسن"، ميلووكي، ويسكونسن.

1-الفئران، وخطوط الخلية، وناقلات

  1. الحصول على فئران C57BL/6 من الموردين التجاريين. الحفاظ على المستعمرات الماوس في ظروف خالية من مسببات الأمراض واستخدام الفئران الذكور والإناث تتراوح أعمارهم ما بين 6 و 12 أسبوعا. الحصول على إزالة الألغام التي تم تحديدها ببمكس البشرية من المصادر التي وافق عليها مجلس الهجرة واللاجئين.
  2. تخدير الحيوانات مع خليط من 20-30% v/v isoflurane في البروبيلين غليكول (1، 2-بروبانيديول، جامعة جنوب المحيط الهادئ الصف) تخدير الفئران. تطبيق مرهم البيطرية للعين لمنع جفاف بينما الفئران تحت التخدير.
  3. ل euthanize الحيوانات، نفذ التفكك عنق الرحم بعد إدخال التخدير.
    1. كبح جماح الفئران التي تتشبث بشدة قاعدة الذيل مع يد واحدة. ضع قلم قوي من نوع عصا أو الإبهام والإصبع الأول من ناحية أخرى ضد الجزء الخلفي الرقبة، عند قاعدة الجمجمة.
    2. لإنتاج التفكك، دفع الزجرية ناحية رأس الحيوان إلى الأمام، ودفع إلى الأسفل حين سحب إلى الخلف باليد عقد الذيل قاعدة. التحقق من فعالية التفكك بالشعور لفصال أنسجة عنق الرحم.
  4. الحفاظ الحيوانات في القفص/الدائرة لمدة 5 دقائق على الأقل وإزالتها فقط عند غياب نشاط الجهاز التنفسي أو عندما يكون هناك نقص في ضربات القلب يمكن اكتشافها.
  5. الحصول على خلايا K562 والأعمال-1 من البائعين التجاريين والمحافظة عليها في RPMI1640 الحرارة المتوسطة التي تحتوي على 10%-إبطال FBS. اختبار هذه خطوط الخلايا بشكل دوري لاستبعاد إمكانية تلوث مفطورة.

2-إعداد ومعايرة ناقلات لينتيفيرال

  1. الثقافة 5 × 106 293T الخلايا بين عشية وضحاها في قارورة2 سم T75 تتضمن حلاً 20 مل من المتوسطة RPMI1640 مع 10% FBS، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، بيروفات صوديوم 1 مم، 5% من محلول بيكربونات الصوديوم 7.5%، و 0.001 في المائة Β-ميركابتوثانول. وضع في قارورة في حاضنة 37 درجة مئوية يملؤه 5.2% CO2.
  2. حصاد الخلايا 293T باستخدام التربسين (0.025%)/EDTA (1 مم) في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS). إضافة 5 مل التربسين/يدتا في برنامج تلفزيوني واحتضان قوارير لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية حاضنة للسماح لمفرزة الخلايا 293T من قوارير2 سم T75.
    1. جمع الخلايا المنفصلة وغسلها مرتين في برنامج تلفزيوني لإزالة أي آثار التربسين ويدتا. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير وضبط عدد الخلايا إلى خلايا 1 مليون كل مل.
  3. ترانسفيكت الخلايا 293T18 مع 3.95 ميكروغرام من psPAX2 و 1.32 ميكروغرام من pMD2G و 5.26 ميكروغرام من الوالدية-التجارة والنقل-بورو (تولدها داخليا في BRI استنساخ المروج EF1alpha من بوبي بدلاً من مروج CMV في بلينتي CMV-التجارة والنقل-بورو)19.
    1. إعداد 1 مل من 150 مم كلوريد الصوديوم بالإضافة إلى 63 ميليلتر من 0.6 مغ/مل بولييثيلينيميني (بي؛ 25,000 دينار كويتي، الخطي). يخلط جيدا ثم إضافة البلازميدات ومزيج. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقم بإضافتها إلى الخلايا.
    2. تعداء بعد ح 16، واستبدال المتوسطة تعداء مع متوسطة جديدة بالإضافة إلى 4.5 ملم الصوديوم بوتيرات. المادة طافية تحتوي على فيروس ح 48 تعداء ما بعد الحصاد، والتركيز بالطرد المركزي بين عشية وضحاها في 5,000 × ز. انظر الجدول المواد.
  4. تحديد التتر الفيروسية باستخدام خلايا 293T عن طريق إجراء تخفيف المسلسل والاعتداء بالتدفق الخلوي ح 72 توصيل بعد20. استخدام التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) كمقياس لقياس التتر الفيروسية.

3-تنقية والتوسع في مورين الخلايا الأولية في ناغورني كاراباخ

  1. تنقية مورين الابتدائي ناغورني كاراباخ الخلايا21. بإيجاز، تمرير تعليق خلية واحدة الطحال من خلال أعمدة الصوف النايلون إلى استنزاف السكان ملتصقة تتكون من خلايا ب والضامة.
  2. ثقافة السكان غير ملتصقة التيد من النايلون الصوف العمود الذي يحتوي على خلايا ناغورني كاراباخ مورين مع 1,000 يو/مليلتر انترلوكين (إيل)-2 في المتوسط RPMI1640 مع 10% FBS، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، بيروفات صوديوم 1 مم، 5% من 7.5% بيكربونات الصوديوم الحل، و 0.001 في المائة β-mercaptoethanol (RPMI1640 المتوسطة كاملة).
  3. تغيير المتوسطة من قوارير في يوم 4 من هذه الثقافة لإزالة غير ملتصقة T وخلايا NKT؛ الخلايا التي تظل يلتزم قوارير هي إلى حد كبير ناغورني كاراباخ الخلايا. إضافة 20 مل من 1,000 يو/مليلتر إيل-2 لسد النقص في قوارير والطازجة المتوسطة كاملة RPMI1640.
  4. فحص نقاء الثقافات الخلية ناغورني كاراباخ موريني في يوم 7 من التدفق الخلوي مع ناغورني كاراباخ علامات خاصة بالخلية20 استخدام الإعداد مع أكثر من 95 في المائة CD3NK1.1+ السكان.

4-تنقية وتوسيع نطاق من الخلايا البشرية الأولية في ناغورني كاراباخ

  1. عزل ببمكس بكثافة متدرجة من المعاطف بافي المتطوعين بشرية صحية. باختصار، بعناية الطبقة 35 مل خلايا التي تضعف النصف (مع حبس) ما يزيد على 15 مل من الكثافة المتدرجة في أنبوب 50 مل المتعارف عليه. الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية في دوار دلو يتأرجح دون الفرامل.
  2. استخدام مجموعات تجارية الانتقاء السلبي القائم على جسم لتنقية الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي البشرية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  3. بعد العزلة، تحديد نقاء الاستعدادات خلية ناغورني كاراباخ بتحليلات الفلورة. وصمة عار ناغورني كاراباخ خلية التحضيرات مع 2 ميكروغرام/مل المضادة-CD3 و 2 الأجسام المضادة-CD56 ميكروغرام/مل عند 4 درجة مئوية 20 دقيقة أغسل الخلايا مرتين مع السكان خلية برنامج تلفزيوني ناغورني كاراباخ تحددها غياب CD3 ووجود CD56 على سطح الخلية.
  4. احتضان الأعمال التحضيرية الخلية مع الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية وتغسل ببرنامج تلفزيوني وتحليلها في سيتوميتير تدفق. استخدام التحضيرات خلية ناغورني كاراباخ فحوصات النقاء لتوصيل الجينات مع أكثر من 85%20.

5-توصيل مورين والبشرية الأولية ناغورني كاراباخ الخلايا التي تحتوي على لينتيفيروس

  1. تعليق الماوس أو البشرية خلايا أولية ناغورني كاراباخ في صفيحة 24-جيدا في 0.5 × 105/mL المتوسطة حضور lentivirus بروتينات فلورية خضراء طافية في تعدد 5، 10 و 20 من العدوى (وزارة الداخلية) وحضور Pb (8 ميكروغرام/مل)، PS (8 ميكروغرام/مل) أو ديكستران (8 ميكروغرام/مل).
  2. الطرد المركزي اللوحات في ز × 1,000 لمدة 60 دقيقة.
  3. دون الصب المادة طافية، ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها (ح 16-18) في حاضنة 37 درجة مئوية يملؤه 5.2 في المائة شركة2-
  4. يغسل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وريسوسبيند في 2 مل من RPMI1640 كاملة الثقافة المتوسطة حضور إيل-2 (300 U/mL).
  5. اختبار الإنسان والفأر سيتوتوكسيسيتي الخلية بوساطة ناغورني كاراباخ الأولية ضد K562 والأعمال-1، على التوالي قبل تنفيذ 51الكروم (Cr)-فحوصات الإفراج في تفاوت نسب المستجيب للخلية الهدف22.
    1. بإيجاز، تعطي الخلايا الهدف 1 مليون و µCi 50 من كرومات الصوديوم راديولابيليد 51Cr. خلال فترة الحضانة 4-h، الإقبال 51Cr في البروتينات الخلوية. في نهاية الحضانة، غسل الخلايا لإزالة أي تسمية غير مسجلة.
    2. حساب تحلل الخلية ورم محدد بمقدار إطلاق 51Cr المطلق والعفوية والتجريبية من الخلايا المستهدفة.
      ملاحظة: تم حساب النسبة المئوية لتحلل محددة من تجارب بينتابليكاتي باستخدام المعادلة التالية: تحلل محددة % = ((51Cr يعني إصدار تجريبي- 51Cr يعني الإفراج عفوية)/(51Cr يعني الإصدار القصوى- 51Cr يعني الإفراج عفوية)) х 100، حيث "51Cr الإفراج عفوية يعني" هو 51Cr أطلق سراحهم من الخلايا المستهدفة في غياب الخلايا ناغورني-كاراباخ و "51Cr الإفراج القصوى يعني" 51Cr صادر من الخلايا المستهدفة عند تحلل N 2 حمض الهيدروكلوريك (HCl).
  6. حصاد الخلايا ناغورني كاراباخ ترانسدوسيد في يوم 7 بالتنصت بلطف قوارير.
    1. تنشيط الخلايا المقطوع مع معاير تركيزات ماب ربط لوحة مكافحة--NKG2D (A10) بطلاء ألواح البوليسترين 96-جيدا، وعالية البروتين-ماصة مع تركيزات 2.5 ميكروغرام/مل ماب NKG2D المضادة بين عشية وضحاها.
    2. تغسل كل جيدا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات قبل إضافة خلايا أولية في ناغورني كاراباخ.
  7. جمع supernatants ثقافة استخدام ماصة متعدد القنوات من بين 16 و 18 ح التنشيط بعد لقياس السيتوكينات مثل IFN-γ. إنشاء المنحنيات القياسية باستخدام السيتوكينات المؤتلف المقدمة مع مجموعات مرتبطة بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA).
  8. اختبار صلاحية خلية ناغورني كاراباخ باستخدام أنيكسين-ت/7-الأمينية-والاكيتنوميسين د (7-عاد) المصبوغة23 وتحديد نسبة نخرية الخلايا بين الخلايا ناغورني كاراباخ تحول باستخدام سيتوميتير تدفق.
    1. لإجراء هذا الفحص، الحصاد ناغورني كاراباخ مورين والبشرية خلايا أربعة أيام بعد توصيل، يغسل مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة في ز × 500 لمدة 5 دقائق، واحتضان مع أنيكسين-V (PE)/7-عاد كيت.
  9. استخدام البرمجيات المناسبة التدفق الخلوي لتحليل البيانات. حدد الخلية ويعيش السكان وتحليل التعبير عن التجارة والنقل (قناة فيتك) كمقياس لتوصيل الفيروسية24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ديكستران يدفع نقل الجينات كفاءة ناقل لينتيفيرال في الخلايا الأولية من ناغورني كاراباخ البشرية ومورين

ناغورني كاراباخ الخلايا البشرية كانت معزولة وتنقيته من ببمك (بدرجة نقاء أكثر من 85 ٪) والمحتضنة بين عشية وضحاها مع rIL-2 300 يو/مليلتر. ثم تم ترانسدوسيد هذه الخلايا الأولية في ناغورني كاراباخ مع لينتيفيروس التجارة والنقل على التعدديات متنوعة من العدوى (موي؛ 3 و 10 و 20 وحدة دولية كل خلية) في لوحات 24-كذلك حضور 8 ميكروغرام/مل Pb أو PS أو ديكستران. الخلايا تثفيل في 1,000 × ز لمدة 60 دقيقة ومثقف (وجود الفيروس) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO. خلايا تم غسلها وحراكه في الطازجة المتوسطة كاملة RPMI1640 مع rIL-2 300 يو/مليلتر لمدة سبعة أيام. وكان تقييم كفاءة توصيل التدفق الخلوي لتعبير بروتينات فلورية خضراء سبعة أيام بعد توصيل. وتظهر النتائج أن ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال في ناغورني كاراباخ الخلايا البشرية ويزيد من عيار الفيروسية، التي يمكن أن تحسن أيضا النسبة المئوية للخلايا ناغورني كاراباخ ترانسدوسيد (الشكل 1).

مورين ناغورني كاراباخ الخلايا المعزولة ومثقف كما هو موضح في المقطع السابق. واستخدمت لتحليل ومقارنة كفاءة توصيل Pb و Ps ديكستران البروتوكول أعلاه. وتظهر النتائج في الشكل رقم 2 أن ديكستران يمكن زيادة كفاءة ناقلات لينتيفيرال مقارنة بالجريدة الرسمية أو س.

توصيل الخلايا ناغورني كاراباخ مع ديكستران لا يؤثر على قدرتها على التوسط في وظائف المستجيب

بفحوصات 51Cr-الإصدار ضد K562 والأعمال-1 دراسة قدرة ترانسدوسيد البشرية ومورين ناغورني كاراباخ الخلايا السامة للخلايا كالخلايا الهدف. وتكشف النتائج المعروضة في الشكل 3 ألف و ب أن توصيل الخلايا ناغورني كاراباخ قبل ديكستران لا يغير سلبا على إمكانية قتل الخلايا ناغورني كاراباخ تحول مقارنة بالخلايا ناغورني كاراباخ غير ترانسدوسيد. بالإضافة إلى ذلك، وقد تم تحليل إنتاج سيتوكين من ترانسدوسيد الخلايا الأولية في ناغورني كاراباخ. كان جيل IFN-γ تقاس باستخدام أليسا. ترانسدوسيد البشرية الأولية ناغورني كاراباخ الخلايا المستزرعة يشترك مع K562 على 24 ساعة، وجمعت في سوبيرناتانتس لقياس IFN-γ. وتكشف النتائج المعروضة في الشكل 4a ديكستران أن ليس له أي تأثير على قدرة ترانسدوسيد ناغورني كاراباخ الخلايا لإنتاج السيتوكينات. كالتحقق من صحة مستقلة، تم تنشيط ترانسدوسيد ناغورني كاراباخ الخلايا مع معاير تركيزات ماب ربط لوحة مكافحة--NKG2D (A10) جمعت supernatants ثقافة 18 h.، وتوليد IFN-γ تم قياسه بواسطة أليسا. وتكشف النتائج هو موضح في الشكل 4 باء أن توصيل مورين ناغورني كاراباخ الخلايا مع ديكستران له أي تأثير على قدرتها على إنتاج السيتوكينات.

توصيل الخلايا ناغورني كاراباخ مع ديكستران لا يؤثر على قدرتها على الاستمرار في الخلية

تم تقييم تأثير Pb أو PS أو ديكستران على استمرارية ترانسدوسيد ناغورني كاراباخ الخلايا باستخدام مقايسة يوديد (PI) بروبيديوم وتحليل تدفق اللاحقة. وتبين النتائج في الشكل 5 ألف و ب أن، على الرغم من أن ترانسدوسينج الإنسان الأولية والماوس ناغورني كاراباخ الخلايا مع فيروسات يمكن أن يستحث نخر في حوالي 20% خلايا ناغورني-كاراباخ، إضافة ديكستران لا تزيد نخر هذا مقارنة بالجريدة الرسمية أو س.

أجريت التحليلات الإحصائية مع-مزاوج التائي الاختبار t. P-قيم ≤ 0.05 اعتبرت هامة.

Figure 1
الشكل 1: قد ديكستران كفاءة أعلى لتوصيل الخلايا البشرية الأولية في ناغورني كاراباخ.
الابتدائي الخلايا البشرية في ناغورني كاراباخ تحولت مع موي 3 أو 10 أو 20 وحدة دولية/خلية ومثقف لمدة سبعة أيام حضور Pb (8 ميكروغرام/مل)، PS (8 ميكروغرام/مل)، أو ديكستران (8 ميكروغرام/مل). النسب المئوية لخلايا ناغورني كاراباخ بروتينات فلورية خضراء-إيجابية يحددها التدفق الخلوي السبعة التالية توصيل في اليوم. ويرد واحد من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: ديكستران بدرجة أعلى من كفاءة لتوصيل في مورين ناغورني كاراباخ الخلايا.
خلايا أولية ناغورني كاراباخ مورين تحولت مع موي 30 وحدة دولية/خلية ومثقف لمدة سبعة أيام حضور Pb (8 ميكروغرام/مل)، PS (8 ميكروغرام/مل)، أو ديكستران (8 ميكروغرام/مل). النسب المئوية للإعراب عن بروتينات فلورية خضراء الخلايا يحددها التدفق الخلوي في الأيام السبعة التالية توصيل. ويرد واحد من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: عدم تعديل ديكستران نشاط ناغورني كاراباخ السامة للخلايا الخلية بوساطة الخلايا المحولة.
الابتدائي ناغورني كاراباخ الخلايا تحولت مع موي 10 وحدات دولية/خلية ومثقف لمدة سبعة أيام. واستخدمت الأعمال-1 و K562 كالخلايا الهدف لتحديد إمكانات السامة للخلايا خلايا (ب) ناغورني كاراباخ مورين (أ) والبشرية، على التوالي. البيانات المعروضة ممثلين تجربتين مستقلة. البيانات المعروضة متوسطات مع sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: لا يغير ديكستران IFN-γ إنتاج خلايا أولية في ناغورني كاراباخ.
أ) مورين ناغورني كاراباخ الخلايا كانت ترانسدوسيد مع موي 30 وحدة دولية/خلية ومثقف لمدة سبعة أيام. حفز الخلايا ناغورني كاراباخ مع 2.5 ميكروغرام/مل من جسم ربط لوحة مكافحة--NKG2D ح 18، وكان كمياً IFN-γ في supernatants ثقافة استخدام أليسا. ب) ترانسدوسيد الخلايا البشرية في ناغورني كاراباخ كانت مثقف مع الخلايا K562 على 24 ساعة، وتم قياس إنتاج IFN-γ في supernatants ثقافة. البيانات المعروضة هي الممثل لثلاث تجارب مستقلة. البيانات المعروضة متوسطات مع sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: توصيل الخلايا ناغورني كاراباخ مع ديكستران لا يغير من قدرتها على الاستمرار في الخلية.
وكان كمياً إمكانية تحول الإنسان (أ) وخلايا (ب) ناغورني كاراباخ الماوس بعد تلطيخ أنيكسين-V (PE)/7-عاد الخلايا إيجابية. البيانات المعروضة متوسطات مع sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وتوضح هذه الدراسة أن استخدام ديكستران كعامل بوليمر الموجبة يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية على السواء. بالإضافة إلى ذلك، قد العوامل الموجبة الأخرى، مثل الجريدة الرسمية أو PS، أي تأثير ملحوظ على إيصال النواقل الفيروسية في الخلايا البشرية الأولية في ناغورني كاراباخ. سابقا، وقد ثبت أن الجريدة الرسمية يمكن زيادة توصيل الجينات في خلايا تي البشرية17. بيد أن هذه النتائج تشير إلى أن الجريدة الرسمية لا PS لها كفاءة مماثلة على الخلايا البشرية الأولية في ناغورني كاراباخ. في هذه الدراسة، Pb تحسين كفاءة توصيل فقط متواضعة في مورين ناغورني كاراباخ الخلايا. فقد ثبت أن تثبيط آليات الدفاع المضادة للفيروسات داخل الخلايا باستخدام BX795، مثبط TBK1/IKKɛ، وملاحظة كمحسن يمكن أن تزيد من كفاءة توصيل لينتيفيرال25. ومع ذلك، أظهرت النتائج أن هذا المانع ليس له تأثير على فعالية توصيل في الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين أو البشرية (البيانات لا تظهر).

النتائج تثبت أن ديكستران يمكن حمل توصيل كفاءة الإنسان الأولية والماوس ناغورني كاراباخ الخلايا، بينما PS والجريدة الرسمية ليس لها أي أثر. وتبين النتائج أيضا أن ديكستران لا يغير من وظائف المستجيب في ناغورني كاراباخ الخلايا، مثل سيتوتوكسيسيتي المضادة للورم وإنتاج السيتوكينات الالتهابية للمحترفين. وهكذا تثبت هذه النتائج أن بقاء هذه الخلايا الأولية في ناغورني كاراباخ لم يتم تغييرها باستخدام ديكستران.

دراسات متعددة بتحليل ومقارنة كفاءة توصيل نواقل فيروسات النسخ العكسي باستخدام البوليمرات الموجبة المختلفة، مع نتائج متنوعة26،،من2728. دراسة سابقة واحدة مقارنة كفاءة توصيل هذه البوليمرات استخدام ناقلات لينتيفيرال؛ ومع ذلك، وهذا تم اختبارها في خلايا CD4 خلايا+ تي16. في واحدة من هذه الدراسات، اتضح أن Pb لديها قدرة أفضل لتوصيل المحولة ب الخلايا والخلايا الجذعية بالمقارنة إلى ديكستران26. وفي دراسة أخرى، ثبت أن ييسر ديكستران من كفاءة توصيل أعلى من القدرة على غيرها في الخلايا البشرية ب وخلايا تي16. الدراسة الحالية هي أولى نوعها، على حد علمنا، أن تحليل ومقارنة قدرة توصيل البوليمرات المختلفة في خلايا ناغورني كاراباخ الأولية سواء البشرية أو مورين.

ترانسدوكشنز المستندة إلى ديكستران الجينات قد تتطلب حدا أدنى جولتين من ترانسدوكشنز. تظهر هذه النتائج أن جولة واحدة من توصيل بما فيه الكفاية لتصل إلى تصل إلى 40% خلايا ترانسدوسيد إيجابيا، الذي هو زيادة تصل إلى 100% بعد جولات اثنين من توصيل (البيانات لا تظهر). واحدة من التحديات الرئيسية في ترانسدوسينج الخلايا ناغورني كاراباخ هو قدرة هذه الخلايا على الحفاظ على التعبير عن الجين ترانسدوسيد. وتبين النتائج الحالية أن توصيل الخلايا ناغورني كاراباخ الأولية مع ديكستران مستقرة وأن الخلايا ناغورني كاراباخ التي تستزرع حضور إيل-2 يمكن الإبقاء ناقلات والحفاظ على التعبير التحوير لمدة أربعة أسابيع (البيانات لا تظهر). تجارب إضافية مطلوبة لتحليل كفاءة توصيل ودراسة التعبير المتزامنة المتسلسلات متعددة.

ويجري التحقق من صحة السريرية فعالية العلاجات المناعية السرطان يستند إلى الخلية مؤسسات متعددة. الخلايا T ترانسدوسيد سيارة تقديم الوعد المتجدد لاسترداد خالية من المرض والانتكاس لمرضى السرطان مقارنة بالعلاجات التقليدية. كجزء من الاستجابات المناعية الفطرية، لا تتطلب الخلايا ناغورني كاراباخ التوعية المسبقة للتوسط في مهامهم المستجيب، بما في ذلك سيتوتوكسيسيتي المضادة للورم. نظراً لاستجابتها السريعة، ناغورني كاراباخ الخلايا مجموعة فرعية لمفاويات المستجيب مثالية للتوسط العلاج المناعي سرطان فعال يستند إلى الخلية. وعلى الرغم من هذه الصفات الإيجابية في التعرف على الورم والقضاء، قصر العقبات التقنية المتعلقة بالتحوير الوراثي لتسليم المتسلسلات أكمل استعمال السريرية الخلايا ناغورني كاراباخ.

انهانسر مرناً للتعبير الجيني خارجية ذات كفاءة عالية وتحقيق نتائج أفضل. ومع ذلك، الأداة مرناً محدودة، كما أنها تسمح فقط تعبير عابر للجينات للفائدة وبالتالي ليست مناسبة للتطبيقات السريرية. توصيل النسخ العكسي للخلايا ناغورني كاراباخ أقل كفاءة لأنه يتطلب جولات متعددة لتوصيل؛ وعلاوة على ذلك، لا يمكن ترانسدوسي الناقلة للفيروسات الرجعية إلى عدم تقسيم الخلايا. النهج الوحيد الذي يبشر بالخير لإيصال التحوير مستقرة هو استخدام ناقلات لينتيفيرال.

وتوفر هذه الدراسة بالإجمال، وسيلة فعالة إيصال المتسلسلات في خلايا أولية في ناغورني-كاراباخ، دون الإخلال بوظائفهم المستجيب. يجعل هذا البروتوكول ناغورني كاراباخ المستندة إلى خلايا السرطان المناعي كفاءة عالية وتنطبق على التجارب السريرية الناشئة. التجارب المقبلة ضرورية للتحقق من مدى فعالية هذا الأسلوب في ناغورني كاراباخ المستندة إلى خلايا السرطان إيمونوثيرابيس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويدعي مقدما البلاغ لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

ونحن نشكر ساماركو لوسيا ولولو لها عصير الليمون الوقوف للإلهام والحافز والدعم. هذا العمل كان تدعمها جزئيا AI102893 R01 المعاهد الوطنية للصحة ولجنة التحقيق الوطنية R01 CA179363 (س. م.)؛ نهلبي-HL087951 (ر. س)؛ المعاهد الوطنية للصحة-CA151893-K08 (M.J.R.)؛ NCI 1R01CA164225 (L.W)؛ مؤسسة الوقوف عصير الليمون أليكس (س. م.)؛ البرنامج هرهم الصندوق MACC (س. م.؛ س. ر.؛ M.S.T)؛ مؤسسة عائلة نيكولاس (س. م.)؛ الأسرة جارديتو (س. م.)؛ برنامج علماء هيونداي (M.S.T.)؛ أمل هيونداي موتورز (س)؛ الصندوق MACC (M.S.T.) و (س. م.؛ معهد البحوث للأطفال، صحة الأم والطفل (س)؛ وجائزة Fogerty دوفي كاثي (M.J.R.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran Sigma-Aldrich 90-64-91-9
polybrene (Pb) Sigma-Aldrich TR-1003
protamine sulfate (PS) Sigma-Aldrich p3369
Trypsin Corning 25-052-CI
RPMI1640 Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum ATALANTA S11150
Penicillin Corning 30-001-CI
B-mercaptoethanol SIGMA M3148
sodium pyruvate Corning MT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ ) eBioscience 14-7311-85
Propidium lodding staining solution BD 51-66211E
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher L3000015
Isoflurane PHOENIX NDC 57319-559-05
NK cell negative selection kit Stem Cell 19855
Yac-1 ATCC TIB-160
K562 ATCC CCL-243
Mice Jakson 664
293T cells ATCC CRL-3216
T75 flasks Cornnig 430641U
antibody-based negative selection kits Stem Cell 19055
51Chromium (Cr)-release assays perkin elmer's NEZ030
ELISA kits Ebioscience 00-4201-56
Sodium Butyrate Sigma 5887-5G
Linear polyethylenimine polysciences 23966-2
Ficoll GE Life Science 17-1440-03
HBSS Corning 21-022-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
  3. Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
  4. Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
  5. Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
  6. Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
  7. Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
  8. Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
  9. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
  10. Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
  11. Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
  12. Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
  13. Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
  14. Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
  15. Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
  16. Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
  17. Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
  18. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
  19. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  20. Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
  21. Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
  22. Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
  23. Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
  24. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
  25. Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
  26. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
  27. Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
  28. Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).
ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M., Rao, S., Wang, L., Medin, J., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells. J. Vis. Exp. (131), e55063, doi:10.3791/55063 (2018).More

Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M., Rao, S., Wang, L., Medin, J., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells. J. Vis. Exp. (131), e55063, doi:10.3791/55063 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter