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Immunology and Infection

Dextran Murine और मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं की Lentiviral Transduction क्षमता को बढ़ाता है

Published: January 15, 2018 doi: 10.3791/55063
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 1,5,6,7
1Laboratory of Molecular Immunology and Immunotherapy, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 2Vector Core Lab, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 3Laboratory of Lymphocyte Biology, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 4Laboratory of Stem Cell Transcriptional Regulation, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 5Department of Microbiology and Immunology, The Medical College of Wisconsin, 6Department of Pediatrics, The Medical College of Wisconsin, 7Department of Medicine, The Medical College of Wisconsin

Summary

इस अध्ययन का लक्ष्य प्रौद्योगिकियों कि प्राथमिक प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं में सफल जीन transduction के लिए अनुमति तैयार करना था । मानव या माउस प्राथमिक NK कोशिकाओं के dextran-मध्यस्थता lentiviral transduction उच्च जीन अभिव्यक्ति क्षमता में परिणाम है । जीन transduction का यह तरीका काफी NK सेल आनुवंशिक हेरफेर में सुधार होगा ।

Abstract

प्राकृतिक खूनी (NK) कोशिकाओं में विशिष्ट जीन की कुशल transduction एक बड़ी चुनौती रही है. सफल transductions विकास में रुचि के जीन की भूमिका को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, भेदभाव, और NK कोशिकाओं के समारोह. हाल ही में chimeric प्रतिजन रिसेप्टर्स (कारें) से संबंधित अग्रिमों कैंसर immunotherapy में एक कुशल विधि के लिए की जरूरत है exogenous जीन देने के लिए प्रभाव लिम्फोसाइटों का चिह्न । प्राथमिक मानव या माउस NK कोशिकाओं में lentiviral-मध्यस्थता जीन transductions की क्षमता काफी कम रहती है, जो एक प्रमुख सीमित कारक है. cationic पॉलिमर, जैसे polybrene का उपयोग कर हाल ही में अग्रिम, टी कोशिकाओं में एक बेहतर जीन transduction दक्षता दिखाते हैं । हालांकि, इन उत्पादों NK कोशिकाओं की transduction क्षमता में सुधार करने में विफल । इस काम से पता चलता है कि dextran, एक शाखा glucan polysaccharide, काफी मानव और माउस प्राथमिक NK कोशिकाओं की transduction क्षमता में सुधार । यह अत्यधिक प्रतिलिपि transduction पद्धति transducing मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं के लिए एक सक्षम उपकरण प्रदान करता है, जो काफी नैदानिक जीन वितरण अनुप्रयोगों में सुधार कर सकते हैं और इस प्रकार NK कोशिका आधारित कैंसर immunotherapy.

Introduction

प्राकृतिक खूनी (NK) कोशिकाएं जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रमुख लिम्फोसाईटिक जनसंख्या है1. NK कोशिकाओं ट्यूमर और संक्रमण के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रथम पंक्ति रक्षकों के रूप में कार्य करता है2,3,4। NK कोशिकाओं को भी शक्तिशाली साइटोकिंस और chemokines5के स्राव के माध्यम से सहिष्णुता के विकास में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । अपने शक्तिशाली करने के लिए लक्ष्य और ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म करने की क्षमता के कारण, एकाधिक नैदानिक परीक्षणों के लिए दाता का मूल्यांकन करने के लिए आयोजित किया जा रहा है कैंसर6,7के लिए एक दत्तक immunotherapy के रूप में मानव NK कोशिकाओं व्युत्पंन । टी कोशिकाओं के विपरीत, NK कोशिकाओं के विकास जीव विज्ञान अभी तक अच्छी तरह से8विशेषता हो गया है । ज्ञान की यह कमी आंशिक रूप से कुशल तकनीकों के अभाव के कारण है कि ब्याज के जीन माउस या मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं को देने के लिए । इन कारणों के लिए, अधिकांश NK-सेल अध्ययन कक्ष लाइनों में आयोजित किया गया है, बजाय प्राथमिक कोशिकाओं में । इसलिए, ब्याज की जीन के साथ प्राथमिक NK कोशिकाओं transduce करने के लिए एक विश्वसनीय और कुशल प्रोटोकॉल के लिए की जरूरत महत्वपूर्ण है ।

इस अध्ययन का समग्र लक्ष्य एक सुसंगत और विश्वसनीय विधि तैयार करना था जिसके द्वारा प्राथमिक मानव या murine NK कोशिकाओं को लेंती-या retroviruses के साथ transduced किया जा सके.

पहले अध्ययन है कि इस समस्या को हल करने का प्रयास किया गया है, मुख्यतः प्राथमिक NK कोशिकाओं के क्षणिक परिवर्तन का उपयोग कर । इसमें प्लाज्मिड अभिकर्मक9,10, Epstein-बर्रा वायरस (EBV)/retroviral हाइब्रिड वेक्टर11, vaccinia वैक्टर12,13, और Ad5/F35 chimeric adenoviral वैक्टर14शामिल हैं । इन तकनीकों की मामूली दक्षता के बावजूद, transduction के क्षणिक प्रकृति आनुवंशिक रूप से संशोधित NK कोशिकाओं के दीर्घकालिक उपयोग के लिए उन्हें अनुपयुक्त बनाता है । कुछ हाल के अध्ययनों से NK कोशिकाओं transduce करने के लिए सिंड्रम वैक्टर का इस्तेमाल किया है, संक्रमण के कई चक्र की आवश्यकता को जीन अभिव्यक्ति11,15के एक स्वीकार्य स्तर को प्राप्त करने । सिंड्रम वैक्टर के विपरीत, lentiviral वैक्टर नाभिक में वायरल पूर्व एकीकरण परिसर translocate करने के लिए मेजबान सेल परमाणु आयात मशीनरी का उपयोग कर सकते हैं । यह गैर-विभाजित कोशिकाओं में वायरस की प्रतिकृति में एक प्रमुख सीमित कारक है, जो प्राथमिक NK कोशिकाओं में शामिल हैं ।

सेल में विभिन्न कोशिका-सतह रिसेप्टर्स और वायरल कणों की अनुमति वायरल के बीच बातचीत. वायरल लिफाफा प्रोटीन और उनके cognate मेजबान रिसेप्टर्स के बीच प्रारंभिक सगाई संभावित नकारात्मक इन दोनों के बीच मौजूदा आरोपों की वजह से सीमित किया जा सकता है । कई transduction तकनीकों के पीछे तर्क यह है कि cationic पॉलिमर के अलावा, जैसे polybrene (पंजाब), protamine सल्फेट (पी एस), या dextran, सेल सतह रिसेप्टर्स के लिए एक सकारात्मक आरोप दे सकता है और इस तरह वायरल लिफाफा के बंधन में वृद्धि प्रोटीन. इससे फ्यूजन दक्षता बढ़ेगी और16कोशिकाओं द्वारा वायरल कणों की अधिकता बढ़ जाएगी । हालांकि यह बताया गया है कि पंजाब या पी एस टी कोशिकाओं में जीन हस्तांतरण में सुधार कर सकते हैं17, उनके आवेदन प्राथमिक NK कोशिकाओं के transduction दक्षता में कोई प्रभाव नहीं था. इसके अलावा, प्राथमिक NK कोशिकाओं का उपयोग कर इन रिएजेंट के बीच तुलनात्मक विश्लेषण नहीं किया गया है । इस अध्ययन में तीनों cationic पॉलीमर्स की transduction क्षमता की तुलना की गई । परिणाम बताते है कि, इन तीन cationic पॉलिमर के बीच, केवल dextran काफी दोनों माउस और मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं में कुशल वायरल transduction को बढ़ाता है ।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल पशुओं के मानवीय और नैतिक उपचार का पालन किया और विस्कॉंसिन (MCW), मिलवॉकी, वाई के मेडिकल कॉलेज के जैव चिकित्सा अनुसंधान केंद्र (BRC) के भीतर संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किए गए । ह्यूमन पेरिफेरल ब्लड mononuclear सेल (PBMCs) के प्रयोग से विस्कॉंसिन, मिलवॉकी, वाई के ब्लड सेंटर के ब्लड रिसर्च इंस्टीट्यूट के संस्थागत रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) को मंजूरी दी गई ।

1. चूहों, सेल लाइनों, और वैक्टर

  1. वाणिज्यिक विक्रेताओं से C57BL/6 चूहे प्राप्त करें । रोगज़नक़ मुक्त शर्तों में माउस कालोनियों को बनाए रखने और 6 और 12 सप्ताह की उम्र के बीच महिला और पुरुष चूहों का उपयोग करें । आईआरबी-स्वीकृत स्रोतों से डी-पहचाने मानव PBMCs प्राप्त करें ।
  2. चूहों को propanediol करने के लिए propylene ग्लाइकोल (1, 2-Anesthetize, यूएसपी ग्रेड) में 20-30% v/v isoflurane के मिश्रण वाले जानवरों को Anesthetize । चूहों संज्ञाहरण के तहत कर रहे हैं, जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों के लिए पशु चिकित्सक मरहम लागू करें ।
  3. जानवरों को euthanize करने के लिए, संज्ञाहरण के प्रेरण के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का प्रदर्शन ।
    1. एक हाथ से पूंछ के आधार मजबूती से लोभी चूहों को नियंत्रित । एक मजबूत छड़ी-प्रकार की कलम या अंगूठे और दूसरी हाथ की पहली उंगली गर्दन के पीछे के खिलाफ, खोपड़ी के आधार पर रखें ।
    2. विस्थापन का उत्पादन करने के लिए, हाथ आगे जानवर के सिर निरोधक धक्का और नीचे धक्का जबकि पूंछ आधार पकड़े हाथ से पिछड़े खींच । गर्भाशय ग्रीवा के ऊतकों की जुदाई के लिए महसूस करके विस्थापन की प्रभावशीलता की पुष्टि करें ।
  4. कक्ष में पशुओं को रखने के कम से 5 मिनट के लिए/और उंहें हटाने केवल जब श्वसन गतिविधि अनुपस्थित है या जब वहां एक जासूसी दिल की धड़कन की कमी है ।
  5. वाणिज्यिक विक्रेताओं से K562 और YAC-1 कोशिकाओं को प्राप्त करने और उन्हें RPMI1640 मध्यम से युक्त 10% गर्मी-निष्क्रिय FBS में बनाए रखने. माइकोप्लाज्मा संदूषण की संभावना को बहिष्कृत करने के लिए इन सेल लाइनों का समय पर परीक्षण करें ।

2. lentiviral वैक्टर की तैयारी और अनुमापन

  1. संस्कृति 5 × 106 293T एक T75 सेमी2 कुप्पी में रात भर कोशिकाओं 10% FBS के साथ RPMI1640 माध्यम की 20 मिलीलीटर की एक समाधान युक्त, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, ७.५% सोडियम बिकारबोनिट समाधान का 5%, और ०.००१% β-mercaptoethanol. एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में कुप्पी प्लेस ५.२% CO2के साथ संचार ।
  2. 293T कोशिकाओं trypsin का उपयोग कर फसल (0.025%)/EDTA (1 मिमी) फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) में । पंजाब में Trypsin/EDTA के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक ३७ डिग्री सेल्सियस में 10 मिनट के लिए कुप्पी मशीन एक मशीन T75 सेमी2 कुप्पी से 293T कोशिकाओं की टुकड़ी की अनुमति के लिए ।
    1. रेग्युलेटर कोशिकाओं को लीजिए और trypsin और EDTA के किसी भी निशान को हटाने के लिए उन्हें दो बार पंजाब में धो लें । hemocytometer वाले कक्षों की गणना करें और कक्ष संख्या को १,०००,००० कक्षों में प्रति मिलीलीटर समायोजित करें ।
  3. Transfect के साथ 293T कोशिकाओं को18 psPAX2 के ३.९५ µ g के साथ, १.३२ µ जी की pMD2G, और ५.२६ µ जी की pLEP-GFP-पूरो की (बृ में उत्पन्न EF1alpha से क्लोनिंग कर एक pWPI प्रवर्तक के स्थान पर सीएमवी में pLenti सीएमवी-GFP-पूरो)१९.
    1. ०.६ मिलीग्राम/एमएल polyethylenimine (पी; २५,००० केडी, रैखिक) के १५० मिमी NaCl प्लस ६३ µ एल की 1 मिलीलीटर तैयार करें । अच्छी तरह से मिलाएं और फिर plasmids और मिश्रण जोड़ें । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन और फिर इसे कोशिकाओं को जोड़ने ।
    2. 16 एच पोस्ट-अभिकर्मक, ताजे मीडियम प्लस ४.५ एमएम सोडियम butyrate के साथ अभिकर्मक मीडियम को बदलें । फसल supernatant वायरस ४८ एच के बाद युक्त अभिकर्मक और ५,००० × जी में रात भर केंद्रापसारक द्वारा ध्यान केंद्रित सामग्री तालिका देखें ।
  4. सीरियल कमजोर पड़ने और परख प्रवाह cytometry ७२ एच पोस्ट-transduction20द्वारा प्रदर्शन द्वारा 293T कोशिकाओं का उपयोग वायरल titers निर्धारित करते हैं । ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति का प्रयोग करें (GFP) एक उपाय के रूप में वायरल titers यों तो ।

3. murine प्राथमिक NK कोशिकाओं का शुद्धिकरण और विस्तार

  1. murine प्राथमिक NK कोशिकाओं को शुद्ध21। संक्षेप में, नायलॉन ऊन कॉलम के माध्यम से एकल सेल तिल्ली निलंबन के लिए अनुयाई बी कोशिकाओं और मैक्रोफेज से मिलकर आबादी गिरेगा ।
  2. संस्कृति गैर-अनुयाई आबादी नायलॉन ऊन कॉलम से eluted है कि १,००० यू/एमएल interleukin (IL)-2 के साथ RPMI1640 मध्यम में 10% FBS के साथ murine NK कोशिकाओं में शामिल हैं, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, ७.५% सोडियम बिकारबोनिट का 5% हल, और ०.००१% β-mercaptoethanol (RPMI1640 complete मध्यम) ।
  3. गैर अनुयाई टी और NKT कोशिकाओं को दूर करने के लिए इस संस्कृति के 4 दिन पर कुप्पी से मध्यम बदलें; जो कोशिकाएं कुप्पी का पालन करती रहती हैं, वे काफी हद तक NK कोशिकाएं हैं । बोतल की भरपाई करने के लिए 20 मिलीलीटर ताजा RPMI1640 पूर्ण मध्यम और १,००० यू/एमएल आईएल-2 जोड़ें ।
  4. NK सेल के साथ प्रवाह cytometry द्वारा 7 दिन पर murine NK सेल संस्कृतियों की पवित्रता की जांच करें विशिष्ट मार्करों20 CD3-NK 1.1+ जनसंख्या के ९५% से अधिक के साथ तैयारी का उपयोग कर ।

4. मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं का शुद्धिकरण और विस्तार

  1. अलग PBMCs स्वस्थ मानव स्वयंसेवकों के buffy कोट से घनत्व ढाल द्वारा । संक्षेप में, ध्यान से परत आधा की ३५ मिलीलीटर-पतला (HBSS के साथ) एक ५० मिलीलीटर विहित ट्यूब में घनत्व ढाल के 15 मिलीलीटर से अधिक कोशिकाओं । ब्रेक के बिना एक झूलते बाल्टी रोटर में 20 डिग्री सेल्सियस में 30 मिनट के लिए ४०० × जी पर केंद्रापसारक ।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए वाणिज्यिक एंटीबॉडी आधारित नकारात्मक चयन किट का प्रयोग करें ।
  3. अलगाव के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण द्वारा NK सेल की तैयारी की पवित्रता का निर्धारण । दाग NK सेल की तैयारी 2 µ g/ml एंटी-CD3 और 2 µ g/ml एंटी-CD56 एंटीबॉडी के लिए 4 ° c पर 20 min. दो बार के साथ कोशिकाओं को धो लें पंजाब NK कोशिका आबादी CD3 के अभाव और सेल सतह पर CD56 की उपस्थिति के द्वारा निर्धारित के साथ ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एंटीबॉडी के साथ सेल की तैयारी, पंजाबियों के साथ धो, और एक प्रवाह cytometer में विश्लेषण । जीन transduction परख के लिए ८५% से अधिक शुद्धता के साथ NK सेल की तैयारी का प्रयोग करें20।

5. lentivirus के साथ murine और मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं का Transduction

  1. निलंबित माउस या मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं में एक 24-well थाली में ०.५ × 105/mL में GFP lentivirus supernatant की उपस्थिति में 5, 10, और संक्रमण की 20 गुणा (मुि) और पीबी (8 µ जी/एमएल), पी एस (8 µ जी/एमएल) या dextran (8 µ g/एमएल) की उपस्थिति में ।
  2. ६० मिनट के लिए १,००० × जी में प्लेटें केंद्रापसारक ।
  3. supernatant बिना खिचड़ी भाषा का, संस्कृति एक ३७ डिग्री सेल्सियस में रात भर कोशिकाओं (16-18 ज) ५.२% CO 2 के साथ संचार किया।
  4. पंजाब के 10 मिलीलीटर से धो लें और IL-2 (३०० U/एमएल) की उपस्थिति में पूरा RPMI1640 संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर में reसस्पेंड ।
  5. K562 और YAC-1 के खिलाफ मानव और माउस प्राथमिक NK सेल मध्यस्थता cytotoxicity का परीक्षण, क्रमशः प्रदर्शन करके ५१क्रोमियम (Cr)-विभिंन प्रभाव-लक्ष्य-सेल अनुपात22पर रिलीज की परख ।
    1. संक्षेप में, १,०००,००० लक्ष्य कोशिकाओं ५० µ radiolabeled सोडियम chromate के ci ५१Cr दे । 4 एच मशीन समय के दौरान, वे सेलुलर प्रोटीन में ५१Cr । मशीन के अंत में, कोशिकाओं को धोने के लिए किसी भी अनजाना लेबल को हटा दें ।
    2. लक्ष्य कक्षों से ५१Cr की निरपेक्ष, सहज, और प्रायोगिक रिलीज़ की मात्रा द्वारा विशिष्ट ट्यूमर सेल lysis की गणना करें ।
      नोट: pentaplicate प्रयोगों से विशिष्ट lysis के प्रतिशत की गणना निम्न समीकरण का उपयोग किया गया था:% विशिष्ट lysis = ((५१cr माध्य प्रायोगिक रिलीज़- ५१cr मतलब सहज रिलीज़)/(५१cr माध्य अधिक से अधिक रिलीज- ५१cr मतलब सहज रिलीज)) х १००, जहां "५१सीआर मतलब सहज रिलीज" ५१NK कोशिकाओं के अभाव में लक्ष्य कोशिकाओं से जारी सीआर है और "५१सीआर मतलब अधिक से अधिक रिलीज" है ५१सीआर 2 N हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) द्वारा lysis पर लक्षित कोशिकाओं से जारी ।
  6. धीरे से कुप्पी दोहन द्वारा 7 दिन पर transduced NK कोशिकाओं फसल ।
    1. प्लेट बाध्य विरोधी NKG2D (A10) के titrated सांद्रता के साथ काटा कोशिकाओं को सक्रिय कोटिंग ९६ द्वारा मॉब-ठीक है, उच्च प्रोटीन-शोषक polystyrene प्लेटों के साथ २.५ µ g/एमएल सांद्रता विरोधी NKG2D मॉब रातोंरात ।
    2. तीन बार प्राथमिक NK कोशिकाओं के अलावा पहले पंजाब के १०० µ एल के साथ एक अच्छी तरह से धो लें ।
  7. IFN-γ जैसे साइटोकिंस का अंदाजा लगाने के लिए 16 और 18 एच के बाद सक्रियण के बीच एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर संस्कृति supernatants लीजिए । मानक संयोजक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) किट के साथ प्रदान की साइटोकिंस का उपयोग कर curves उत्पंन करते हैं ।
  8. NK कोशिका व्यवहार्यता का परीक्षण annexin-V/7-एमिनो-actinomycin डी (7-AAD) धुंधला23 और एक प्रवाह NK का उपयोग कर बदल cytometer कोशिकाओं के बीच में गल कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण ।
    1. इस परख प्रदर्शन करने के लिए, फसल murine और मानव NK कोशिकाओं चार दिन transduction के बाद, 5 मिनट प्रत्येक के लिए ५०० × जी में ठंडा पंजाबियों के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार धो, और एक Annexin-V (पीई)/7-AAD किट के साथ मशीन ।
  9. डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त फ़्लो cytometry सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । लाइव सेल जनसंख्या का चयन करें और वायरल transduction के एक उपाय के रूप में GFP (FITC चैनल) की अभिव्यक्ति का विश्लेषण24.

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Representative Results

Dextran प्राथमिक मानव और murine NK कोशिकाओं में lentiviral वेक्टर के कुशल जीन हस्तांतरण लाती है

मानव NK कोशिकाओं अलग और PBMC से शुद्ध किया गया (अधिक से अधिक ८५%) और आरआईएल के साथ रात भर की मशीन-२ ३०० U/ इन प्राथमिक NK कोशिकाओं तो संक्रमण के विभिंन गुणा पर GFP lentivirus के साथ transduced थे (मुि; 3, 10, और 20 IU प्रति सेल) में 24 अच्छी तरह से प्लेटों में 8 µ जी/एमएल पंजाब, पी एस, या dextran की उपस्थिति । कोशिकाओं ६० मिनट के लिए १,००० × जी में केंद्रापसारक थे और (वायरस की उपस्थिति में) रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस में एक सह2 मशीन में । कोशिकाएं धुल गई और आरआईएल के साथ नए सिरे से RPMI1640 पूर्ण माध्यम में reसस्पैंड-२ ३०० U/एमएल सात दिनों के लिए । transduction क्षमता GFP अभिव्यक्ति के लिए प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था सात दिनों के बाद transduction । परिणाम बताते हैं कि dextran मानव NK कोशिकाओं में lentiviral transduction की कुशलता को बढ़ाता है और वायरल titer को बढ़ाता है, जिससे transduced NK कोशिकाओं का प्रतिशत (चित्रा 1) भी सुधर सकता है ।

Murine NK कक्षों को पूर्व खंड में वर्णित के रूप में पृथक और प्रसंस्कृत किया गया था । इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल का विश्लेषण और पंजाब, पी एस, और dextran की transduction दक्षता की तुलना किया गया । चित्रा 2 में परिणाम बताते है कि dextran lentiviral वैक्टर की दक्षता पंजाब या पी एस की तुलना में वृद्धि कर सकते हैं ।

dextran के साथ NK कोशिकाओं के Transduction प्रभाव कार्य मध्यस्थता करने के लिए उनकी क्षमता को प्रभावित नहीं करता

transduced मानव और murine NK कोशिकाओं की साइटोटोक्सिक क्षमता की जांच की गई थी ५१Cr-रिलीज परख के खिलाफ K562 और YAC-1 के लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में । परिणाम चित्रा 3 ए और बी में प्रस्तुत पता चलता है कि dextran द्वारा NK कोशिकाओं के transduction नकारात्मक गैर transduced NK कोशिकाओं की तुलना में बदल NK कोशिकाओं की हत्या की क्षमता में परिवर्तन नहीं करता है । साथ ही, transduced प्राथमिक NK कोशिकाओं से cytokine उत्पादन का विश्लेषण किया गया. IFN-γ पीढ़ी एक एलिसा का उपयोग कर मापा गया था । Transduced मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं 24 ज के लिए K562 के साथ सह-कल्चरल थे, और supernatants IFN-γ को मापने के लिए एकत्र किए गए थे। चित्रा 4a में प्रस्तुत परिणाम पता चलता है कि dextran transduced NK कोशिकाओं की क्षमता पर कोई प्रभाव नहीं है साइटोकिंस का उत्पादन । एक स्वतंत्र सत्यापन के रूप में, transduced NK कोशिकाओं के titrated सांद्रता के साथ सक्रिय किया गया प्लेट बाध्य विरोधी NKG2D (A10) मॉब के लिए 18 ज संस्कृति supernatants एकत्र किए गए थे, और IFN-γ पीढ़ी एलिसा द्वारा मापा गया था । चित्रा 4b में दिखाए गए परिणामों से पता चलता है कि dextran के साथ murine NK कोशिकाओं के transduction साइटोकिंस उत्पादन करने की उनकी क्षमता पर कोई प्रभाव नहीं है ।

dextran के साथ NK कोशिकाओं के Transduction उनकी कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता

पंजाब, पी एस, या transduced NK कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर dextran के प्रभाव एक propidium आयोडाइड (PI) परख और बाद में प्रवाह विश्लेषण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । चित्रा 5 और बी में परिणाम प्रदर्शित करता है कि, हालांकि वायरस के साथ transducing प्राथमिक मानव और माउस NK कोशिकाओं NK कोशिकाओं के लगभग 20% में परिगलन पैदा कर सकते हैं, dextran के अलावा इस परिगलन पंजाब या पुनश्च की तुलना में वृद्धि नहीं किया ।

सांख्यिकीय विश्लेषण एक दो पूंछ ख़राब छात्र टी परीक्षण के साथ प्रदर्शन किया गया । P-मान ≤ ०.०५ महत्वपूर्ण माने गए थे ।

Figure 1
चित्रा 1: Dextran मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं के transduction की एक उच्च दक्षता है ।
प्राथमिक मानव NK कोशिकाओं 3, 10, या 20 IU/सेल के मुि के साथ बदल रहे थे और पंजाब (8 µ जी/एमएल), पी एस (8 µ जी/एमएल), या dextran (8 µ जी/एमएल) की उपस्थिति में सात दिनों के लिए संस्कृति थे । GFP के प्रतिशत-सकारात्मक NK कोशिकाओं transduction के बाद सात दिन पर प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया । तीन में से एक स्वतंत्र प्रयोग दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Dextran murine NK कोशिकाओं में transduction की एक उच्च दक्षता है ।
प्राथमिक murine NK कोशिकाओं को 30 IU/सेल के एक मुि के साथ बदल दिया गया था और पंजाब (8 µ जी/एमएल), पी एस (8 µ जी/एमएल), या dextran (8 µ जी/एमएल) की उपस्थिति में सात दिनों के लिए कल्चरित थे । GFP-व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिशत transduction के बाद सात दिनों में प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया । तीन में से एक स्वतंत्र प्रयोग दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Dextran रूपांतरित कक्षों की NK कक्ष-मध्यस्थता साइटोटोक्सिक गतिविधि को संशोधित नहीं करता है ।
प्राथमिक NK कोशिकाओं को 10 IU/सेल के एक मुि के साथ बदल रहे थे और सात दिनों के लिए संस्कृति थे । YAC-1 और K562 murine (क) और मानव (ख) NK कोशिकाओं, क्रमशः की साइटोटोक्सिक क्षमता निर्धारित करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया । दिखाए गए आंकड़ों में दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. डेटा दिखाया SEM के साथ औसत रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 4
चित्रा 4: Dextran प्राथमिक NK कोशिकाओं के IFN-γ उत्पादन में परिवर्तन नहीं करता है ।
क) Murine NK कोशिकाओं को एक मुि के साथ transduced थे 30 IU/प्रकोष्ठ और सात दिनों के लिए प्रसंस्कृत । NK कोशिकाओं २.५ µ जी के साथ उत्तेजित थे/एमएल की प्लेट बंधे विरोधी NKG2D एंटीबॉडी 18 ज के लिए, और IFN-γ एक एलिसा का उपयोग संस्कृति मात्रा में supernatants था । ख) Transduced मानव NK कोशिकाओं को 24 ज के लिए K562 कोशिकाओं के साथ कल्चरित थे, और IFN-γ उत्पादन संस्कृति supernatants में मापा गया था । प्रस्तुत आंकड़ों में तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. डेटा दिखाया SEM के साथ औसत रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 5
चित्रा 5: dextran के साथ NK कोशिकाओं के Transduction उनके सेल व्यवहार्यता को बदल नहीं है ।
रूपांतरित मानव की व्यवहार्यता (a) और माउस (b) NK कक्षों को Annexin-V (PE)/7-AAD धनात्मक कक्षों के लिए धुंधला करने के बाद मात्रा किया गया था. डेटा दिखाया SEM के साथ औसत रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

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Discussion

यह अध्ययन दर्शाता है कि एक cationic बहुलक एजेंट के रूप में dextran का उपयोग दोनों murine और मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं की lentiviral transduction क्षमता को बढ़ाता है । इसके अतिरिक्त, अंय cationic एजेंटों, जैसे पंजाब या पुनश्च, वायरल वैक्टर के वितरण पर मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं में कोई प्रत्यक्ष प्रभाव है । पहले, यह दिखा दिया गया है कि पंजाब मानव टी कोशिकाओं में जीन transduction वृद्धि कर सकते है17। इन परिणामों, तथापि, सुझाव है कि न तो पंजाब और न ही पुनश्च मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं पर एक समान दक्षता है । इस अध्ययन में, पंजाब murine NK कोशिकाओं में केवल मामूली transduction प्रभावकारिता में सुधार. यह दिखाया गया है कि intracellular एंटीवायरल रक्षा BX795, TBK1 के एक अवरोधक/IKKɛ का उपयोग कर तंत्र के निषेध, और एक बढ़ाने के रूप में पुनश्च lentiviral transduction दक्षता में वृद्धि कर सकते है25। फिर भी, परिणाम से पता चला है कि इस अवरोधक murine या मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं में transduction प्रभावकारिता पर कोई प्रभाव नहीं है (डेटा नहीं दिखाया गया है).

परिणाम प्रदर्शित करता है कि dextran प्राथमिक मानव और माउस NK कोशिकाओं के कुशल transduction प्रेरित कर सकते हैं, जबकि पी एस और पंजाब कोई प्रभाव नहीं है । परिणाम भी पता चलता है कि dextran विरोधी ट्यूमर cytotoxicity और समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के उत्पादन के रूप में NK कोशिकाओं, के प्रभाव के कार्यों को बदल नहीं करता है । इस प्रकार, इन परिणामों से साबित होता है कि इन प्राथमिक NK कोशिकाओं की व्यवहार्यता dextran के उपयोग द्वारा परिवर्तित नहीं किया गया था ।

कई अध्ययनों से विश्लेषण और विभिंन cationic पॉलिमर का उपयोग कर सिंड्रम वैक्टर के transduction दक्षता की तुलना में, विभिंन परिणामों के साथ26,27,28। एक पहले अध्ययन lentiviral वैक्टर का उपयोग कर इन पॉलिमर की transduction प्रभावकारिता की तुलना में; हालांकि, यह सीडी+ टी कोशिकाओं16में परीक्षण किया गया था । इनमें से एक अध्ययन में यह दर्शाया गया है कि पीबी dextran26की तुलना में रूपांतरित बी कोशिकाओं और वृक्ष कोशिकाओं पर transduction की बेहतर क्षमता है । एक अन्य अध्ययन में, यह दिखाया गया है कि dextran मानव बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं में अन्य बढ़ाने की तुलना में एक उच्च transduction दक्षता की सुविधा16. वर्तमान अध्ययन अपनी तरह का पहला है, हमारे ज्ञान के लिए, कि विश्लेषण और दोनों मानव और murine प्राथमिक NK कोशिकाओं में अलग पॉलिमर की transduction क्षमता की तुलना में ।

Dextran आधारित जीन transductions transductions के दो दौर की एक ंयूनतम आवश्यकता हो सकती है । इन परिणामों से पता चलता है कि transduction का एक दौर सकारात्मक transduced कोशिकाओं के ४०% तक पहुंचने के लिए पर्याप्त है, जो transduction के दो दौर के बाद १००% तक बढ़ जाता है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । transducing NK कोशिकाओं में प्रमुख चुनौतियों में से एक transduced जीन की अभिव्यक्ति को संरक्षित करने के लिए इन कोशिकाओं की क्षमता है । वर्तमान परिणाम प्रदर्शित करता है कि dextran के साथ प्राथमिक NK कोशिकाओं के transduction स्थिर है और कि NK कोशिकाओं है कि IL-2 की उपस्थिति में संस्कृति रहे है वेक्टर बनाए रखने और चार सप्ताह के लिए transgene अभिव्यक्ति बनाए रखने कर सकते है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । अतिरिक्त प्रयोगों transduction दक्षता का विश्लेषण करने के लिए और एकाधिक transgenes की समवर्ती अभिव्यक्ति की जाँच करने के लिए आवश्यक हैं.

प्रतिरक्षा कोशिका आधारित कैंसर उपचारों की नैदानिक प्रभावकारिता को अनेक संस्थाओं द्वारा मान्य किया जा रहा है. कार-transduced टी कोशिकाओं रोग के लिए नए सिरे से वादा प्रदान करते हैं-और चूक-पारंपरिक चिकित्सा की तुलना में कैंसर रोगियों की मुफ्त वसूली । जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के भाग के रूप में, NK कोशिकाओं विरोधी ट्यूमर cytotoxicity सहित उनके प्रभाव कार्य, मध्यस्थता करने के लिए पूर्व संवेदीकरण की आवश्यकता नहीं है. अपनी तेजी से प्रतिक्रिया के कारण, NK कोशिकाओं एक आदर्श प्रभाव लिम्फोसाइट सबसेट के लिए एक कुशल कोशिका आधारित कैंसर immunotherapy मध्यस्थता कर रहे हैं । ट्यूमर मांयता और उंमूलन में अपने सकारात्मक गुण के बावजूद, तकनीकी बाधाएं आनुवंशिक हेरफेर के बारे में transgenes देने के लिए NK कोशिकाओं के पूर्ण नैदानिक उपयोग सीमा ।

exogenous जीन अभिव्यक्ति के लिए mRNA के Electroporation अत्यधिक कुशल है और बेहतर परिणाम है । हालांकि, mRNA उपयोगिता सीमित है, के रूप में वे केवल ब्याज की जीन के क्षणिक अभिव्यक्ति की अनुमति है और इस तरह नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हैं । NK कोशिकाओं के सिंड्रम transduction कम कुशल है क्योंकि यह transduction के कई दौर की आवश्यकता है; इसके अलावा, सिंड्रम वैक्टर गैर-विभाजित कोशिकाओं में transduce नहीं कर सकते । स्थिर transgene वितरण के लिए केवल आशाजनक दृष्टिकोण lentiviral वैक्टर का उपयोग है ।

कुल मिलाकर, इस अध्ययन के एक कुशल विधि प्रदान करता है प्राथमिक NK कोशिकाओं में transgenes देने के लिए, उनके प्रभाव कार्यों को बाधित किए बिना. इस प्रोटोकॉल NK कोशिका आधारित कैंसर immunotherapy अत्यधिक कुशल बनाता है और उभरते नैदानिक परीक्षणों के लिए लागू है । NK कोशिका आधारित कैंसर immunotherapies में इस पद्धति की प्रभावकारिता को मान्य करने के लिए भावी प्रयोगों की जरूरत होती है.

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई वित्तीय संघर्ष का दावा है ।

Acknowledgments

हम लूसिया Sammarco और उसके Lulu के नींबू पानी प्रेरणा, प्रेरणा, और समर्थन के लिए खड़े धंयवाद । इस कार्य को NIH R01 AI102893 और NCI R01 CA179363 (एम) द्वारा भाग में समर्थित किया गया; NHLBI-HL087951 (सेवाराम); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (एल. डब्ल्यू.); एलेक्स नींबू पानी स्टैंड फाउंडेशन (एम); MACC निधि का HRHM कार्यक्रम (एम; सेवाराम; एम. एस. टी.); निकोलस परिवार फाउंडेशन (एम); Gardetto परिवार (एम); हुंडई जनाब कार्यक्रम (M.S.T.); हुंडई पर आशा पहियों (सेवाराम); MACC कोष (M.S.T. and एम); बाल शोध संस्थान, MCW (सेवाराम); और कैथी Duffey Fogerty पुरस्कार (M.J.R.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran Sigma-Aldrich 90-64-91-9
polybrene (Pb) Sigma-Aldrich TR-1003
protamine sulfate (PS) Sigma-Aldrich p3369
Trypsin Corning 25-052-CI
RPMI1640 Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum ATALANTA S11150
Penicillin Corning 30-001-CI
B-mercaptoethanol SIGMA M3148
sodium pyruvate Corning MT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ ) eBioscience 14-7311-85
Propidium lodding staining solution BD 51-66211E
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher L3000015
Isoflurane PHOENIX NDC 57319-559-05
NK cell negative selection kit Stem Cell 19855
Yac-1 ATCC TIB-160
K562 ATCC CCL-243
Mice Jakson 664
293T cells ATCC CRL-3216
T75 flasks Cornnig 430641U
antibody-based negative selection kits Stem Cell 19055
51Chromium (Cr)-release assays perkin elmer's NEZ030
ELISA kits Ebioscience 00-4201-56
Sodium Butyrate Sigma 5887-5G
Linear polyethylenimine polysciences 23966-2
Ficoll GE Life Science 17-1440-03
HBSS Corning 21-022-CV

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १३१ Transduction प्राथमिक NK कक्ष dextran lentivirus आनुवंशिक रूप से संशोधित immunotherapy
Dextran Murine और मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं की Lentiviral Transduction क्षमता को बढ़ाता है
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Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M., Rao, S., Wang, L., Medin, J., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells. J. Vis. Exp. (131), e55063, doi:10.3791/55063 (2018).

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