इस अध्ययन का लक्ष्य प्रौद्योगिकियों कि प्राथमिक प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं में सफल जीन transduction के लिए अनुमति तैयार करना था । मानव या माउस प्राथमिक NK कोशिकाओं के dextran-मध्यस्थता lentiviral transduction उच्च जीन अभिव्यक्ति क्षमता में परिणाम है । जीन transduction का यह तरीका काफी NK सेल आनुवंशिक हेरफेर में सुधार होगा ।
प्राकृतिक खूनी (NK) कोशिकाओं में विशिष्ट जीन की कुशल transduction एक बड़ी चुनौती रही है. सफल transductions विकास में रुचि के जीन की भूमिका को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, भेदभाव, और NK कोशिकाओं के समारोह. हाल ही में chimeric प्रतिजन रिसेप्टर्स (कारें) से संबंधित अग्रिमों कैंसर immunotherapy में एक कुशल विधि के लिए की जरूरत है exogenous जीन देने के लिए प्रभाव लिम्फोसाइटों का चिह्न । प्राथमिक मानव या माउस NK कोशिकाओं में lentiviral-मध्यस्थता जीन transductions की क्षमता काफी कम रहती है, जो एक प्रमुख सीमित कारक है. cationic पॉलिमर, जैसे polybrene का उपयोग कर हाल ही में अग्रिम, टी कोशिकाओं में एक बेहतर जीन transduction दक्षता दिखाते हैं । हालांकि, इन उत्पादों NK कोशिकाओं की transduction क्षमता में सुधार करने में विफल । इस काम से पता चलता है कि dextran, एक शाखा glucan polysaccharide, काफी मानव और माउस प्राथमिक NK कोशिकाओं की transduction क्षमता में सुधार । यह अत्यधिक प्रतिलिपि transduction पद्धति transducing मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं के लिए एक सक्षम उपकरण प्रदान करता है, जो काफी नैदानिक जीन वितरण अनुप्रयोगों में सुधार कर सकते हैं और इस प्रकार NK कोशिका आधारित कैंसर immunotherapy.
प्राकृतिक खूनी (NK) कोशिकाएं जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रमुख लिम्फोसाईटिक जनसंख्या है1. NK कोशिकाओं ट्यूमर और संक्रमण के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रथम पंक्ति रक्षकों के रूप में कार्य करता है2,3,4। NK कोशिकाओं को भी शक्तिशाली साइटोकिंस और chemokines5के स्राव के माध्यम से सहिष्णुता के विकास में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । अपने शक्तिशाली करने के लिए लक्ष्य और ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म करने की क्षमता के कारण, एकाधिक नैदानिक परीक्षणों के लिए दाता का मूल्यांकन करने के लिए आयोजित किया जा रहा है कैंसर6,7के लिए एक दत्तक immunotherapy के रूप में मानव NK कोशिकाओं व्युत्पंन । टी कोशिकाओं के विपरीत, NK कोशिकाओं के विकास जीव विज्ञान अभी तक अच्छी तरह से8विशेषता हो गया है । ज्ञान की यह कमी आंशिक रूप से कुशल तकनीकों के अभाव के कारण है कि ब्याज के जीन माउस या मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं को देने के लिए । इन कारणों के लिए, अधिकांश NK-सेल अध्ययन कक्ष लाइनों में आयोजित किया गया है, बजाय प्राथमिक कोशिकाओं में । इसलिए, ब्याज की जीन के साथ प्राथमिक NK कोशिकाओं transduce करने के लिए एक विश्वसनीय और कुशल प्रोटोकॉल के लिए की जरूरत महत्वपूर्ण है ।
इस अध्ययन का समग्र लक्ष्य एक सुसंगत और विश्वसनीय विधि तैयार करना था जिसके द्वारा प्राथमिक मानव या murine NK कोशिकाओं को लेंती-या retroviruses के साथ transduced किया जा सके.
पहले अध्ययन है कि इस समस्या को हल करने का प्रयास किया गया है, मुख्यतः प्राथमिक NK कोशिकाओं के क्षणिक परिवर्तन का उपयोग कर । इसमें प्लाज्मिड अभिकर्मक9,10, Epstein-बर्रा वायरस (EBV)/retroviral हाइब्रिड वेक्टर11, vaccinia वैक्टर12,13, और Ad5/F35 chimeric adenoviral वैक्टर14शामिल हैं । इन तकनीकों की मामूली दक्षता के बावजूद, transduction के क्षणिक प्रकृति आनुवंशिक रूप से संशोधित NK कोशिकाओं के दीर्घकालिक उपयोग के लिए उन्हें अनुपयुक्त बनाता है । कुछ हाल के अध्ययनों से NK कोशिकाओं transduce करने के लिए सिंड्रम वैक्टर का इस्तेमाल किया है, संक्रमण के कई चक्र की आवश्यकता को जीन अभिव्यक्ति11,15के एक स्वीकार्य स्तर को प्राप्त करने । सिंड्रम वैक्टर के विपरीत, lentiviral वैक्टर नाभिक में वायरल पूर्व एकीकरण परिसर translocate करने के लिए मेजबान सेल परमाणु आयात मशीनरी का उपयोग कर सकते हैं । यह गैर-विभाजित कोशिकाओं में वायरस की प्रतिकृति में एक प्रमुख सीमित कारक है, जो प्राथमिक NK कोशिकाओं में शामिल हैं ।
सेल में विभिन्न कोशिका-सतह रिसेप्टर्स और वायरल कणों की अनुमति वायरल के बीच बातचीत. वायरल लिफाफा प्रोटीन और उनके cognate मेजबान रिसेप्टर्स के बीच प्रारंभिक सगाई संभावित नकारात्मक इन दोनों के बीच मौजूदा आरोपों की वजह से सीमित किया जा सकता है । कई transduction तकनीकों के पीछे तर्क यह है कि cationic पॉलिमर के अलावा, जैसे polybrene (पंजाब), protamine सल्फेट (पी एस), या dextran, सेल सतह रिसेप्टर्स के लिए एक सकारात्मक आरोप दे सकता है और इस तरह वायरल लिफाफा के बंधन में वृद्धि प्रोटीन. इससे फ्यूजन दक्षता बढ़ेगी और16कोशिकाओं द्वारा वायरल कणों की अधिकता बढ़ जाएगी । हालांकि यह बताया गया है कि पंजाब या पी एस टी कोशिकाओं में जीन हस्तांतरण में सुधार कर सकते हैं17, उनके आवेदन प्राथमिक NK कोशिकाओं के transduction दक्षता में कोई प्रभाव नहीं था. इसके अलावा, प्राथमिक NK कोशिकाओं का उपयोग कर इन रिएजेंट के बीच तुलनात्मक विश्लेषण नहीं किया गया है । इस अध्ययन में तीनों cationic पॉलीमर्स की transduction क्षमता की तुलना की गई । परिणाम बताते है कि, इन तीन cationic पॉलिमर के बीच, केवल dextran काफी दोनों माउस और मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं में कुशल वायरल transduction को बढ़ाता है ।
यह अध्ययन दर्शाता है कि एक cationic बहुलक एजेंट के रूप में dextran का उपयोग दोनों murine और मानव प्राथमिक NK कोशिकाओं की lentiviral transduction क्षमता को बढ़ाता है । इसके अतिरिक्त, अंय cationic एजेंटों, जैसे पंजाब या पुनश्च, वायरल वैक्टर क…
The authors have nothing to disclose.
हम लूसिया Sammarco और उसके Lulu के नींबू पानी प्रेरणा, प्रेरणा, और समर्थन के लिए खड़े धंयवाद । इस कार्य को NIH R01 AI102893 और NCI R01 CA179363 (एम) द्वारा भाग में समर्थित किया गया; NHLBI-HL087951 (सेवाराम); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (एल. डब्ल्यू.); एलेक्स नींबू पानी स्टैंड फाउंडेशन (एम); MACC निधि का HRHM कार्यक्रम (एम; सेवाराम; एम. एस. टी.); निकोलस परिवार फाउंडेशन (एम); Gardetto परिवार (एम); हुंडई जनाब कार्यक्रम (M.S.T.); हुंडई पर आशा पहियों (सेवाराम); MACC कोष (M.S.T. and एम); बाल शोध संस्थान, MCW (सेवाराम); और कैथी Duffey Fogerty पुरस्कार (M.J.R.) ।
Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
K562 | ATCC | CCL-243 | |
Mice | Jakson | 664 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
HBSS | Corning | 21-022-CV |