Summary
Осуществление ортотопической модели почечно-клеточной карциномы в иммунокомпетентных мышах дает следователю клинически-соответствующую систему, определяемую наличием первичной опухоли почки и метастазов в легких в том же животном. Эта система может быть использована для доклинического тестирования различных методов лечения в естественных условиях.
Abstract
Почечно-клеточный рак (ПКР) влияет на> 60000 человек в Соединенных Штатах ежегодно, и ~ 30% больных ПКР имеют множественные метастазы на момент постановки диагноза. Метастатического ПКР (МСКЦ) неизлечим, медиана выживаемости всего 18 месяцев. Иммунные на основе вмешательства (например, интерферон (IFN) и интерлейкин (ИЛ) -2) вызывают длительные реакции у части пациентов MRCC и мультикиназный ингибиторы (например, сунитиниба или сорафениб) или анти-VEGF - рецептор моноклональные антитела (MAB) являются в значительной степени паллиативный, а полные ремиссии редки. Такие недостатки в современной терапии для пациентов MRCC обеспечивают обоснование для разработки новых протоколов лечения. Ключевой компонент в доклинических испытаниях новых методов лечения MRCC является подходящей моделью для животных. Полезные функции, которые перепросматривать человеческое состояние включают первичную опухоль почек, почечный метастаз опухолей, а также интактную иммунную систему, чтобы исследовать любую терапию управляемого иммунные эффекторнымг реакция и образование опухоли, вызванные иммуносупрессивных факторов. Этот отчет описывает ортотопическую мышиную модель MRCC, которая имеет все эти функции. Опишем внутрипочечный технику имплантации с помощью мыши почечной аденокарциномы клеточной линии Ренка, а затем оценки роста опухоли в почках (основной сайт) и легких (метастатическим сайт).
Introduction
Почечный - клеточный рак (ПКР) составляет для большинства злокачественных новообразований почек и примерно 3% от всех злокачественных новообразований у взрослых во всем мире 1, 2. Из - за отсутствия симптомов, неправильного диагноза, и недостаточные инструменты скрининга для РКС, почти у 30% пациентов будут представлены с метастатическим ПКР (MRCC) на момент постановки диагноза, с дополнительным 20-30% пациентов , прогрессирующих до метастатической стадии 2. Эти случаи приводят к ~ 13500 смертей в год 1, 3. Хотя ранее обнаружение и лечение первичного RCC улучшилось, скорость РКС-связанной смерти продолжает расти, предполагая , что метастатическое заболевание в значительной степени ответственны за смертностью 3. Развитие терапии ПКР прогрессировало в течение последнего десятилетия с открытием и реализацией целевых методов лечения и иммунотерапии. К сожалению, без прогрессирования survivаль и общая выживаемость запущенных случаев все еще хорошо в 2 -х года для большинства пациентов 4, 5, 6. Эти статистические данные говорят о необходимости дальнейших исследований в выявлении и разработке эффективных методов лечения ПКР. Для адекватного продвижения терапевтических вмешательств для MRCC, сначала необходимо поступательно-соответствующие доклинические модели заболевания.
Разработка соответствующей и последовательная модели резюмировать человеческое состояние передового RCC должен решить несколько ключевых вопросов: 1) Является ли модель анатомический отношением; 2) Есть ли прогресс опухоли по аналогии с человеческой патологии; 3) Есть ли метастазы возникают из первичной опухоли; и 4) Может прогрессирование первичного и метастатического опухолевого контролироваться с течением времени? В зависимости от типа лечения исследуется, линии опухолевых клеток мыши РКЦ, линии человеческих опухолевых клеток РКЦ и человека RCC пациента, полученных xenogплоты могут быть использованы в иммунокомпетентных или иммунодефицитных мышей. Хост с интактным и функциональной иммунной системы требуется для этих исследований , оценивающих некоторые аспекты иммунотерапии, что требует использования хорошо описанной клеточной линии , полученной из Ренка спонтанной почечной аденокарциномы BALB / C мышей 7. Большинство исследований впрыснуть Ренок клетки подкожно (SC), который образует простую в меру локальной опухоль, или внутривенно (IV) в мышей BALB / C для получения экспериментальных легких «метастазов» 8, 9, 10, 11, 12. Пользование подкожно имплантированных опухолей Ренка к модели человеческого РКЦ имеет ряд ограничений, в том числе неточной иннервации сосудов 13, различия в микросреде 14, 15, а также отсутствие органа / опухоли сотовой COMMUNICция 13, 16. Кроме того, многие SC опухоли (особенно Ренок) не метастазируют в дистальные органы, ингибируя исследование о событии , которое является общим клинической характеристикой 17. Для изучения MRCC, Ренка клетки могут быть введены внутривенно, чтобы установить бремя опухоли в легких-первичном месте метастазов у больных РСС. IV инъекционный метод инициирования метастатических опухолей, однако, не позволяет исследовать , как, когда и почему клетки мигрировали из первичного органа (т.е. почки) в отдаленном месте. Модель с первичным и метастатическим заболеванием очевидным в том же животном имеет решающее значение для изучения прогрессирования и лечения позднего стадии заболевания, особенно с учетом того, что метастазы обычно являются причиной смертности у этих пациентов.
Наша лаборатория разработала мышиную модель MRCC, которая включает в себя все функции, изложенные выше. Чтобы установить прimary, ортотопическая опухоль, клетки Ренка имплантирует непосредственно в почки животного через полупрозрачные брюшины. Небольшой разрез в левом боке позволяет для визуализации селезенки (как ориентир) и левой почки. С помощью небольшой иглы калибра, опухолевые клетки RENCA вводят непосредственно в почку через брюшину для ортотопической имплантации. По сравнению с другими методами имплантации клеток Ренка ниже капсулы 18 почек, этот способ имплантации обеспечивает более высокую пропускную способность , так как это довольно неинвазивным, не требует наложения швов, имеет низкий класс боли, а также занимает много времени эффективным , когда практикуется.
Это хорошо охарактеризованы результаты модели в воспроизводимом бремени первичной опухоли (~ 99% скорости отбора) в впрыскиваемого почек, а также метастатической опухолевой нагрузки в легких. Существенные преимущества этой модели включают его сингенный характер, что позволяет иммунотерапии исследованиям; его спонтанные метастазы, изучатьdvanced болезнь; и его ортотопическая имплантация, смоделировать анатомическое влияние на прогрессировании заболеваний и лечение. Методы лечения, направленные на нацеливание RCC бы извлечь большую пользу от использования этой модели в ходе доклинических развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол описывает экспериментальную процедуру для индукции и мониторинга роста экспериментальных ортотопических опухолей почек и любых потенциальных спонтанных метастазов. Все последующие процедуры осуществляются в соответствии с институциональной политики и утвержденными процедурами в отношении гуманного использования экспериментальных животных.
1. Поддержание клеточных линий
- Поддержание мышиной линии клеток аденокарциномы почек, Ренок, в Институте Roswell Park Memorial (RPMI) 1640 с добавлением 10% фетальной сывороткой теленка (FCS), 1% пенициллин-стрептомицином и 1 мМ каждый из несущественных аминокислот, L-глутамина и пируват натрия (называемый полной RPMI). Культуры клеток в инкубатор при 37 ° С и 5% CO 2.
Примечание: Как и с любой установленной клеточной линией, рекомендуется использовать низкий проход номер Ренок клетки для трансфекции и последующей имплантации, чтобы свести к минимуму любых фенотипическим или генетическим изменениям, которые могут возникнуть после длительной культиЮр.- Используйте систему транспозонов для конструирования клеток Ренка с получением стабильной экспрессии зеленый флуоресцентный белок (GFP) и светлячка люциферазы.
- Использование катионной липосомы на основе трансфекции реагента, со-трансфекции Ренка клетки с вектором экспрессии транспозаза (pPGK-SB11) и транспозон вектором, кодирующим для экспрессии люциферазы светлячка, а также ген, кодирующий слитый для GFP и гена зеоцином сопротивления , оба под транскрипционным контролем двунаправленного промотора (pKT2 / LuBiG) 19.
- Через два дня, плиты трансфектированных клеток при предельном разведении и позволяют клеткам расширяться в полном RPMI с добавлением зеоцином (300 мкг / мл). Подтверждение экспрессии GFP в каждом клоне с помощью проточной цитометрии. Эти клетки называются Ренок-GL.
Примечание: Ограничение разбавления клонирования позволит выбранные клетки, которые будут получены из одной клетки.
- Используйте систему транспозонов для конструирования клеток Ренка с получением стабильной экспрессии зеленый флуоресцентный белок (GFP) и светлячка люциферазы.
- Для того, чтобы имплантировать клетки Ренка intrarenally, подготовить клетки Ренка INto суспензии одноклеточных при 2 × 10 6 клеток / мл в Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS).
- Удалить прилипшие клетки Ренка из тканевой культуральной колбы посредством 0,25% трипсина в HBSS. После ~ 5 мин, добавить полную RPMI в колбу для нейтрализации трипсина и передачи клеток в центрифужную пробирку для стирки. Центрифуга клетки при 300 г относительной центробежной силы (RCF) Xg в течение 5 мин при 25 ° С.
- Декантируйте супернатант и ресуспендирования клеток в HBSS. Граф клеток с использованием гемоцитометра и регулировать громкость с помощью HBSS с получением 2 × 10 6 клеток / мл.
- Draw клетки в шприц 1 мл, снабженную 18-го калибра иглы, чтобы предотвратить напряжение сдвига на клетки. Заменить 18-иглы калибра с 28-го калибра иглы до инъекции опухолевых клеток. Инъекции 0,1 мл обеспечивает 2 × 10 5 клеток в почках.
2. Подготовка Хирургическая Площадь
- Приготовьте стерильный хирургическийплощадь в шкафу биологической безопасности путем размещения стерильную хирургическую драпировка над грелку. Собирают все материалы, в том числе пинцетом, скальпелем, ножницы, глазные капли, 5% повидон-йода антисептик, и стерильной марлей. Автоклав всех инструментов перед использованием.
- Выполните операцию с использованием асептического наконечника. Стерилизуйте инструменты между животными с бисерным стерилизатором. Wear стерильные перчатки, пальто лаборатории, и маску.
3. Подготовка животных
- Обезболить мышей с кетамин / ксилазином (87,5 мг / кг и 12,5 мг / кг, соответственно, IP) в соответствии с институциональными руководящими принципами. Определение глубины анестезии, выполняя носок-пинч.
- Когда считаются не реагирующим животным, подготовить место для инъекции (например, левый фланг) на Balb / с мышей щипком (с пальцами) или бритье ( с помощью машинки для стрижки) мех.
- Перемещение мыши из области подготовительной операции (например, корпус клетки) к хирургической области и применять ветеринарную мазь кглаза, чтобы предотвратить сухость кожи. Обильно тампоном подготовленный участок разреза с 5% повидон-йод, антисептик.
- Вводят гидрохлорид бупивакаина (0,1 мл 2,5 мг / мл раствора, подкожно) в области, где разрез будет выполнен в виде предоперационного обезболивания.
- Сделать один разрез (~ 1,0 - 1,5 см) на левый бок животного, используя стерильный скальпель или ножницы, осторожно, чтобы не проникнуть в брюшину. Отдельные дермы из брюшины с стерильными ножницами. Смочите место надреза стерильной хлопковой марли, чтобы удалить кровь.
- Держите мышь обеими руками, используя левую руку, чтобы держать голову и правую руку, чтобы поддержать фланг.
- Определить селезенку через брюшину и, с одним пальцем правой руки, пальпируют мышь из-под; Теперь почки должны быть видны через брюшину. Держите крепко держать животное, чтобы обеспечить напряжение через брюшину и почки.
- Уже второй человек впрыскивать с опухолиLLS (полученная в разделе 1.2.) через неповрежденные брюшины в центр почки с помощью шприца 1 мл, снабженного 28-го калибра иглы. Медленно поставить 0,1 мл (2 × 10 5) клеток. После того, как клетки инъецируют, держать иглу на месте в течение 5 - 10 с, чтобы уменьшить обратный поток клеток. Важно отметить необходимость крайней осторожности во время этого шага, так как человек, инъекционные клетки будет приносить иглу в непосредственную близость от пальцев человека, держащего мышь.
- Удалить иглу и закрыть разрез с тонким слоем клея цианакриловых тканей.
- Поместите животное обратно в чистую клетку с стерильным бумажным полотенцем. Дайте животным восстановиться на грелку. Не оставляйте животное без присмотра во время периода восстановления. Не вернуть животных в стандартных жилищных условий, пока они не в вертикальном положении и грудины. Следуйте институциональные рекомендации во всех процедурах с использованием лабораторных животных.
4. Bioлюминесцентные изображения
- Мониторинг роста опухоли биолюминесценции визуализации.
Примечание: Процедурные детали для выполнения биолюминесцентных изображений могут быть получены из Lim и др. 20 Сигнал люциферазы может быть обнаружена уже через 24 ч после имплантации опухолевых клеток. Поскольку нет внешне видимой опухоли в этой модели, необходимо контролировать рост опухоли периодически. В зависимости от расчетного эксперимента, рост ортотопической опухоли может протекать в течение различных промежутков времени. Одним из преимуществ использования люциферазы-экспрессирующих Ренка клеток является то, что рост опухоли может быть повторно контролироваться в том же животном через равные промежутки времени в течение всего срока эксперимента, и специфический опрос несущих опухоли и опухоли, свободных от органов может быть сделано на определена конечная точка.- Вводят люциферин (0,1 мл раствора 15 мг / мл в стерильном PBS) IP и дать ему возможность циркулировать в течение 10 мин до помещения мышей в систему визуализации биолюминесценции. Поместите мо использовать с его спинными стороной вверх, слегка прокаткой на его стороне, с тем чтобы иметь впрыскиваемую почку вверх.
- Измерьте бремя опухоли в фотонах света, излучаемых в секунду (поток фотонов) в пределах определенной области интереса (ROI) с использованием программного обеспечения для анализа изображений.
- Количественные опухолевый в отдельных органах.
Примечание: Количественное могут быть выполнены в определенные моменты времени в отдельных органов после их удаления из умерщвленных мышей.- Вводят мышей с люциферин, как в шаге 4.1.
- Через 10 мин эвтаназии мышей с использованием утвержденной процедуры.
- Рассеките из органов , представляющих интерес (например, почки и легкие, см раздел 5 ниже). Передача ткани до 35 х 10 Мм Петри Петри и поместить их в систему биолюминесценции визуализации.
- Измерьте бремя опухоли в фотонах света, излучаемых в секунду (поток фотонов) в пределах определенной рои с использованием программного обеспечения для анализа изображений.
- При определенной конечной точке для отдельного эксперимента, эвтаназия опухоли мышей в соответствии с предпочтительными институциональными принципами (например, СО 2, цервикальная дислокация, анестезия передозировки). Тем не менее, избежать шеек дислокации, если легкие должны быть собраны после накачивания туши.
- Выполните грубую оценку роста первичной опухоли в почечном впрыскиваемых почках пути измерения сырого веса органа.
- Для определения массы опухоли (в г), изолировать 21 и весить почки с опухолью подшипника и контралатеральная почку от тех же мышей, где разница в весах в почках определяет массу опухоли. Осторожно рассекает какую-либо посторонние соединительную ткань из вырезанных почек перед измерением их веса.
- Оценка степени метастазов опухоли в легком пути надувания легкой туши перед иссечением и немедленно фиксации легких в растворе Фекетадеваха = "Xref"> 22. Расчет вручную метастатических поражений на поверхности легких, то может быть выполнена.
- Сделайте срединный разрез с помощью ножниц, начиная с середины живота, через грудную клетку, и через нек / слюнные железы. Осторожно удалите грудную клетку с помощью ножниц и щипцов, без ущерба для легочной ткани.
- Вынести трахеи путем удаления соединительной ткани.
- Подготовьте 3 мл шприц с 18-го калибра иглы, заполненную 10% -ным раствором чернил Индии в HBSS.
- Использование щипцов, тщательно нить шелковой нити под трахеей. Это будет использоваться, чтобы связать трахею раз завышены.
- Осторожно вставьте иглу вниз трахеи и медленно выжмите шприц, чтобы раздуть легкие с раствором краски Индии. Примерно 1 - 1,5 мл раствора краски Индии будет полностью раздуть легкие.
- Pinch трахеи закрыть, связывая несколько узлов, с швом ниже иглы, чтобы ингибировать обратный поток чернил.
- убре иглу и аккуратно срезаем соединительную ткань, чтобы удалить раздутые легкие.
- В химическом вытяжном шкафу, поместить в легкие в конической трубе 15 мл , содержащую 5 мл раствора Фекете (35 мл 95% этанола, 15 мл дН 2 O, 5 мл формальдегида и 2,5 мл ледяной кислой кислоты в стеклянная бутылка 100 мл) 23.
- Разрешить легкие, чтобы исправить / destain в течение 24 - 48 ч при комнатной температуре перед вручную подсчете обесцвечивает опухолевые узелки.
- Удалить интактные легкие после депигментации и осторожно рассекают фиксированные легкие по доле в 35 х 10 Мм Петри Петри. Подсчитайте число опухолевых узелков (белые узелки) на каждом лепестке под микроскопом рассекает.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешной имплантации клеток Ренка приведет к развитию опухоли в почке и метастазы в легких мышей. После иссечения опухоли подшипнике и контралатеральной почки, вес сырой ткани (г) были измерены для демонстрации опухолевой нагрузки , основанную на увеличении веса (фигура 1). Опухоли Ренка может быть идентифицированы с помощью иммуногистохимии через цитокератин 8 и 18 окрашивание (рисунок 2). Для продольных исследований, люцифераз, экспрессирующие клеточная линия Ренка была имплантирована. Биолюминесцентные изображения проводили с использованием системы визуализации естественных условий в (ИВИСЕ) для отслеживания нагрузки опухоли и реакции на терапию с течением времени (рис 3А). Метастазы в легкие было подтверждено биолюминесценции визуализации (рис 3B) и Индии инфляции чернил легкого (рис 3C).
s / ftp_upload / 55080 / 55080fig1.jpg»/>
Рисунок 1. Ортотопическая имплантации опухолевых клеток Ренка образует большую массу почек. Ренок-GL клетка (2 × 10 5 в 0,1 мл) вводили intrarenally, а вес на вырезанных несущую опухоль почек и опухоли , свободные от контралатеральной почки в граммах (+ SEM) были определены на день 24. п = 15 tumor- свободные и несущая опухоли почки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. иммунофлуоресцентного микроскопическое изображения опухолей , свободные от контралатеральных и несущей опухоли почек. Ренок-GL клетка (2 × 10 5 в 0,1 мл) вводили intrarenally, и несущая опухоль и опухоль , свободные почки собирали на день 12. почки были быстро замораживали и обрабатывали для immunofluorescence визуализация для визуализации расположения коллагена, Цитокератином 8 и 18, и CD31. 10x снимки были сделаны и сшиты вместе, чтобы просмотреть всю несущую опухоль почки. Масштабные полоски = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Ортотопическая имплантации опухолевых клеток Ренка приводит к спонтанных метастазов в легких. А. Ренка-GL клетки (2 × 10 5 в 0,1 мл) вводили intrarenally в Balb / с мышей. Биолюминесцентные снимки были сделаны на указанные дни. Б. На 23 -й день, легкие от опухолей , свободной и опухоли мышей были вырезаны и были взяты биолюминесцентного изображения. С. Параллельные наборы мышей на 23 -й день было их легкие завышены тушью для визуализации легких опухолевые узелки.Масштабные полоски = 1 см. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем протокол для ортотопической мышиной модели РКЦ. Имплантация мыши почечных опухолевых клеток аденокарциномы в почки мыши, обеспечивает клинически соответствующую модель MRCC. Эта модель приводит к первичной опухоли в почках и отдаленных метастазов в легких, оба из которых являются отличительными чертами передовых RCC. Описание Представленное здесь является специфическим для клеточной линии Ренка в иммунокомпетентных мышах линии BALB / C. С помощью этой модели ортотопической, мы показали , что опухоли Ренка реагируют на иммунотерапию, демонстрируя полезность этой модели для терапевтического тестирования 17, 24, 25, 26, 27. Способность использовать сингенную линию опухолевых клеток для имплантации дает преимущество изучения прогрессирования опухоли у иммунологически интактного животного. Сингенный, ортотопический и клинический значимый характristics этой системы обеспечивает превосходную модель, которая позволяет проводить тестирование терапии в соответствующей доклинической модели. Это не может быть воспроизведено, когда опухоли имплантируют подкожно. Важно отметить, что такая система моделирования не ограничивается оценки противоопухолевые иммунные ответы или различные иммунотерапевтические подходы для лечения RCC. Было бы целесообразно использовать опухолевые клетки человека, имплантированных intrarenally в иммунодефицитных мышей, в зависимости от типа экспериментов, проводимых. Наличие установленных клеточных линий ПКР , которые можно культивировать в пробирке улучшает воспроизводимость этой модели ортотопической в естественных условиях, так как все животные могут быть имплантированы с равным количеством опухолевых клеток , в то же время. Кроме того, опухолевые клетки можно манипулировать в пробирке до внутрипочечной имплантации предлагает возможность контролировать как клетки растут и / или реагировать на сигналы окружающей среды. Одно ограничение с этим (и большинство) implanОпухолевые таблица моделей является то, что они обойти ранние события, ответственные за образование опухолей, пособие, которое обеспечиваемой с помощью мышиной модели генной инженерии для формирования автохтонных опухолей.
Одним из недостатков ортотопической модели является общая неспособность визуализировать рост опухоли, функция, которая легко контролировать для опухоли подкожно путем измерения толщины. Современные технологии с использованием генетически сконструированные клеток опухоли и биолюминесцентные изображений позволяют продольные измерения внутренних опухолей. Мы продемонстрировали способность определять первичную опухоль почек и метастатическую нагрузку в различные моменты времени на основе биолюминесценции визуализации и / или экстракции органов 17, 24, 25. Сильный наша модель является наличием GFP и люциферазы-экспрессирующих клетки линии Ренка, но модель не требует этой функции для достижения успеха. Мы охарактеризовали илиthotopic модель АС с обеими родительским Ренком и Ренок-GL клетками. После имплантации клеток Ренка-GL, первичные опухоли можно легко измерить с помощью биолюминесценции визуализации. Это может быть трудно контролировать метастазы в целом животном, однако, как первичная опухоль может производить сигнал, который подавляет низшие сигналы, которые могут быть испускаемые из метастатической сайта. Акцизирование и визуализации отдельных органов от всего животного позволяет для визуализации и количественного определения метастазов в этих органах. В ортотопической модели Ренка, опухоли первичной почки приводят к спонтанных микро-метастазов в легких животных уже через 7 дней после имплантации, как видно по свечению в вырезанной ткани 17 легких.
В то время как использование опухолевых клеток линии люциферазы-экспрессирующих в этой системе предоставляет пользователю возможность отслеживать прогрессирование опухоли в продольном направлении в том же животном, он также предоставляет пользователю возможность evaluatе точность метода имплантации. Почки мыши является небольшим анатомическим строением, что делает возможным, особенно при использовании длинной иглы, чтобы придать опухолевые клетки через почку и непосредственно в брюшину. Визуализации мыши в течение нескольких дней после инъекции определяет степень, до которой имплантация опухолевых клеток локализуются в почки. Еще одна особенность, которая может усложнить внутрипочечный инъекции является наличие обилия висцерального жира, который может накапливаться по мере старения животных. Почки хорошо видны через брюшину в обедненной мыши, но почки могут стать тусклыми, под лопастями висцерального жира, которые могут развиться в течение долгого времени.
При завершении данного эксперимента, количество оценок может быть использовано для определения опухолевой нагрузки на все тело. Биолюминесцентные изображения из вырезанных органов обеспечивают объективную меру опухолевой нагрузки. Влажный вес первичных опухолей нормированы на контралатеральной kidneу в качестве внутреннего контроля обеспечивает измерение объемной массы. Метастатический нагрузка в легких также может быть определен путем раздувания легких с тушью гуртом , чтобы для визуализации белых опухолей легких узелков с использованием рассекает микроскоп. Эти показания могут установить опухолевую нагрузку всего тела, который может быть использован в качестве основы для исследования терапевтической эффективности на доклинической стадии разработки лекарственных средств. Экспрессия GFP в клетках Ренка-GL также поддается проточной цитометрии анализы несущих опухоль тканей. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность для любой оценки проточной цитометрии почки опухоли, особенно при исследовании состава и размера любого иммунологического ответа, генерируемом в результате терапии. Почки являются очень сосудистые органы, что делает его вероятным, что оценка иммунного ответа (или про-опухоли или анти-опухоль) в цельной несущих опухоль почек будет включать в себя как «ткани, так и сосудистой локализоватьд»иммунные клетки в момент сбора урожая органа. Чтобы различать ткани в сравнении с иммунными клетками крови, мы используем технику, где флуорохром меченного анти-CD45.2 моноклональное антитело (монАТ) вводится внутривенно, прежде чем эвтаназии. Почки затем получают для потока цитометрии, который включает в себя экс вива окрашивания с различным флуорохромом-меченым анти-CD45.2 мАтом 28, 29. Двойное окрашиванием CD45.2 дискриминационных клетки в сосудистой сети из ткани в момент сбора урожая. Этот простой протокол позволяет идентификацию основных лейкоцитов клоны , содержащиеся в сосудистой сети, которые могли бы запутать интерпретацию адаптивных и врожденных иммунных реакций в тканях. Этот протокол также устраняет необходимость в перфузии, которые могут иметь нежелательные последствия 28, 29.
Существует в настоящее время увеличение признательность и использование иммунотерапиидля лечения рака. Развитие будущих лечения иммунологический основой для MRCC (и других видов рака) начинается в лаборатории с использованием clinically- и физиологически соответствующая модели. Ортотопической модели РСС описано здесь , содержит ряд ключевых особенностей (например, первичной опухоли почки, отдаленные метастазы, опухоль-индуцированной иммуносупрессии, а также компонентов для продольного мониторинга роста опухоли) для проверки эффективности различных терапевтических методов. Также заманчиво предположить, что эта модель может быть адаптирована в будущем для оценки достижений в области других средств лечения RCC, например, хирургические и / или фокальные протоколы терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национального института рака (R15CA173657 к AW и R01CA109446 к TSG), Института рака (Simmons к AW) и Университета Minnestoa Подняться 4 рака почки Foundation (для TSG). Мы благодарим д-ра Кристин Андерсон за помощь в иммунофлюоресценции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-162-35 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | CBGBIW011019 | |
| Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-155-32 | |
| 0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection) | Hospira | 0409-1587-50 | |
| Heating pad | Sunbeam | ||
| Syringes | BD | 309659 | |
| Gauze | Venture | 908291 | |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | NDC 57319-609-02 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-111 | |
| Hank’s Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| IVIS | Caliper | ||
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | |
| India Ink | Chartpak Inc | 44201 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Sleeping Beauty (SB) transposon system | Neuromics | SBT0200 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).
- Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. Epidemiology and risk factors for kidney cancer. Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).
- Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect. J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).
- Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma. Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).
- Rini, B. I. New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance. Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).
- Acquavella, N., Fojo, T. Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy. J. Immunother. 36, 459-461 (2013).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).
- Ko, J. S., et al. Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained. Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).
- Kusmartsev, S., et al. Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma. J. Immunol. 181, 346-353 (2008).
- Rocha, F. G., et al. Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice. Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).
- Shanker, A., et al. Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody. J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).
- VanOosten, R. L., Griffith, T. S. Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy. Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).
- Devaud, C., et al. Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors. Oncoimmunology. 3, 963395 (2014).
- Devaud, C., et al. Cross-talk between tumors can affect responses to therapy. Oncoimmunology. 4, 975572 (2015).
- Norian, L. A., et al. Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy. PLoS One. 7, 31085 (2012).
- Matin, S. F., et al. Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model. J. Urol. 183, 333-338 (2010).
- Wilber, A., et al. RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues. Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , (2009).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. , (2013).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse. J. Vis. Exp. , (2010).
- Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).
- James, B. R., et al. CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).
- James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC. Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).
- James, B. R., et al. Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth. J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).
- Brincks, E. L., et al. Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma. FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).
- Anderson, K. G., et al. Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses. J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).
