Summary
Implementatie van een orthotope model niercelcarcinoom in immunocompetente muizen levert de onderzoeker een klinisch relevante systeem gedefinieerd door de aanwezigheid van een primaire niertumor en longmetastasen in hetzelfde dier. Dit systeem kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan behandelingen in vivo preklinisch testen.
Abstract
Niercelcarcinoom (RCC) van invloed op> 60.000 mensen in de Verenigde Staten elk jaar, en ~ 30% van de RCC patiënten hebben meerdere uitzaaiingen op het moment van de diagnose. Gemetastaseerd niercelcarcinoom (mRCC) is ongeneeslijk, met een mediane overleving van slechts 18 maanden. Immuun-interventies (bijvoorbeeld, interferon (IFN) en interleukine (IL) -2) induceren duurzame reacties in een fractie van mRCC patiënten en multikinaseremmer remmers (bijv sunitinib of sorafenib) of anti-VEGF-receptor monoklonale antilichamen (mAb) zijn grotendeels palliatieve, als complete remissies zijn zeldzaam. Dergelijke tekortkomingen in de huidige therapieën voor mRCC patiënten de reden voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingsprotocollen. Een sleutelcomponent in de preklinische testen van nieuwe therapieën voor mRCC een geschikt diermodel. Gunstige eigenschappen dat het menselijk herhalen omvat een primaire niertumor, nier tumormetastasen en een intact immuunsysteem één therapie gedreven immunologische onderzoeken effector reacties en de vorming van tumor geïnduceerde immuno-onderdrukkende factoren. Dit rapport beschrijft een orthotope mRCC muismodel dat al deze functies heeft. We beschrijven een intrarenaal implantatietechniek met de muis renale adenocarcinoom cellijn Renca, gevolgd door de beoordeling van tumorgroei in de nier (primaire plaats) en de longen (metastatische lokalisatie).
Introduction
Niercelcarcinoom (RCC) is goed voor het merendeel van de kwaadaardige nier tumoren en ongeveer 3% van alle volwassen maligniteiten wereldwijd 1, 2. Wegens gebrek aan symptomen, verkeerde diagnose en onvoldoende screeningsmethoden voor RCC, bijna 30% van de patiënten ten tijde van de diagnose te stellen met metastatische RCC (mRCC), met een extra 20-30% van de patiënten progressie naar een metastatische fase 2. Deze gevallen leiden tot ~ 13.500 sterfgevallen per jaar 1, 3. Hoewel vroege detectie en behandeling van primaire RCC is verbeterd, de snelheid van RCC-gerelateerde dood blijft toenemen, wat suggereert dat metastatische ziekte is grotendeels verantwoordelijk voor de sterfte 3. Ontwikkeling van behandelingen bij RCC heeft geboekt in het afgelopen decennium met de ontdekking en de implementatie van gerichte therapieën en immuuntherapie. Helaas, progressievrije overleefdeal en totale overleving van gevorderde gevallen nog steeds ruim onder 2 jaar voor de meeste patiënten 4, 5, 6. Deze statistieken rechtvaardigen de noodzaak voor verder onderzoek naar de identificatie en ontwikkeling van effectieve behandelingen voor RCC. Om adequaat te bevorderen therapeutische interventies voor mRCC worden translationeel relevante pre-klinische modellen van de ziekte voor het eerst nodig is.
Ontwikkeling van een relevante en consistente model om de menselijke conditie van geavanceerde RCC recapituleren moet een aantal belangrijke vragen: 1) Is het model anatomisch relevant; 2) Is de tumor vooruitgang vergelijkbaar met de humane pathologie; 3) Doe uitzaaiingen ontstaan uit de primaire tumor; en 4) Kan de primaire en metastatische progressie van de tumor worden gevolgd in de tijd? Afhankelijk van het type behandeling onderzocht, muis RCC tumorcellijnen, humane RCC tumorcellijnen en humane RCC-patiënten afgeleide xenogvlotten kunnen in immunocompetente of immunodeficiënte muizen. Een gastheer met een intact en functioneel immuunsysteem nodig voor de studies die een aspect van immunotherapie, in het gebruik van de goed beschreven Renca cellijn afgeleid van een spontane renale adenocarcinoom van Balb / c muizen 7. De meeste studies injecteren Renca-cellen subcutaan (sc), die een gemakkelijke maat lokale tumor vormt, of intraveneus (iv) in Balb / c muizen experimentele long "metastasen" 8, 9, 10, 11, 12 te produceren. Gebruik van een sc-geïmplanteerde Renca tumor model humane RCC heeft een aantal beperkingen, met inbegrip van onnauwkeurige innervatie van vasculatuur 13 verschillen in micro 14, 15, en noch orgaanschade / tumor cellulaire communicatie 13, 16. Bovendien zijn veel sc tumoren (in het bijzonder Renca) niet uitzaaien naar distale organen remmen van de studie van een gebeurtenis die een gemeenschappelijke klinische kenmerken 17. MRCC te bestuderen, kunnen Renca-cellen worden iv geïnjecteerd om tumorlast te vestigen in de longen the zetel van uitzaaiingen in RCC patiënten. De iv injectie methode voor het inleiden uitgezaaide tumoren, maar staat niet toe dat het onderzoek naar hoe, wanneer of waarom de cellen zijn gemigreerd van de primaire orgel (dat wil zeggen, de nieren) naar de verre plaats. Een model met zowel primaire als metastatische ziekte duidelijk in hetzelfde dier is cruciaal voor de voortgang en de behandeling van gevorderde ziekte te bestuderen, vooral omdat metastasen typisch de oorzaak van mortaliteit bij deze patiënten.
Ons laboratorium heeft een muizenmodel van mRCC dat alle van de hierboven genoemde functies bevat ontwikkeld. Om pr vast te stellenimary, orthotope tumoren worden Renca cellen direct geïmplanteerd in de nier van de dieren door de doorzichtige peritoneum. Een kleine incisie in de linkerflank maakt visualisatie van de milt (als landmark) en de linker nier. Met een kleine naald maat worden Renca tumorcellen direct geïnjecteerd in de nier door het peritoneum van orthotope implantatie. Vergeleken met andere werkwijzen voor het implanteren Renca-cellen onder de niercapsule 18 deze wijze van implanteren zorgt voor een hogere doorvoersnelheid, aangezien het tamelijk non-invasieve, hoeft hechten vereisen, is een lage pijn klasse en tijdbesparende bij geoefend.
Dit goed gekarakteriseerd model leidt tot reproduceerbare primaire tumorbelasting (~ 99% opbrengst rate) in het geïnjecteerde nieren en metastatische tumor belasting in de longen. De belangrijkste voordelen van dit model zijn onder meer de syngene aard, waardoor voor immunotherapie onderzoeken; haar spontane metastasen, om te studeren eendvanced ziekte; en de orthotope implantatie, de anatomische invloed van ziekteprogressie en behandeling modelleren. Therapieën gericht op targeting RCC zouden veel baat hebben bij het gebruik van dit model tijdens de preklinische ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol beschrijft een procedure voor het induceren van experimentele en controle op de groei van experimentele orthotope niertumoren en eventuele spontane metastasen. Alle volgende procedures worden gedaan in overeenstemming met de institutionele beleid en goedgekeurde procedures met betrekking tot het humane gebruik van proefdieren.
1. Onderhoud van cellijnen
- Handhaaf murine renale adenocarcinoom cellijn, Renca, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1% penicilline-streptomycine en 1 mM elk van niet-essentiële aminozuren, L-glutamine en natriumpyruvaat (aangeduid met compleet RPMI). Kweekcellen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: Zoals voor alle vastgestelde cellijn, is het raadzaam om lage passage nummer Renca-cellen gebruikt voor transfectie en daaropvolgende implantatie één fenotypische en genetische veranderingen die kunnen optreden na langdurige cult minimaliserenure.- Gebruik een transposon systeem Renca-cellen manipuleren om stabiel tot expressie green fluorescent protein (GFP) en vuurvlieg luciferase.
- Onder toepassing van een kationisch liposoom gebaseerd transfectiereagens, co-transfecteren Renca-cellen met een transposase expressievector (pPGK-SB11) en een transposon vector codeert voor de expressie van vuurvlieg luciferase, evenals een fusiegen dat codeert voor GFP en het zeocine resistentiegen beide onder transcriptionele controle van een bidirectionele promoter (pKT2 / Lubig) 19.
- Twee dagen later, bord de getransfecteerde cellen bij een beperkende verdunning en de cellen te laten groeien in compleet RPMI aangevuld met zeocine (300 ug / ml). Bevestigen GFP expressie in elke kloon door flowcytometrie. Deze cellen worden genoemd Renca-GL.
OPMERKING: beperken van verdunningsklonering de geselecteerde cellen zijn afgeleid van een enkele cel toe.
- Gebruik een transposon systeem Renca-cellen manipuleren om stabiel tot expressie green fluorescent protein (GFP) en vuurvlieg luciferase.
- Om Renca cellen intrarenally implantaten, bereiden Renca cellen into een eencellige suspensie met 2 x 10 6 cellen / ml in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS).
- Renca verwijderen hechtende cellen uit de weefselkweekfles behulp van 0,25% trypsine in HBSS. Na -5 minuten, voeg volledig RPMI aan de kolf met het trypsine te neutraliseren en zet de cellen om een centrifugebuis voor het wassen. Centrifugeer de cellen bij 300 relatieve centrifugale kracht g (RCF xg) gedurende 5 minuten bij 25 ° C.
- Decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen in HBSS. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en zet het volume met HBSS om 2 x 10 6 cellen / ml.
- Trek de cellen in een 1 ml spuit uitgerust met een 18-gauge naald om afschuifspanning te voorkomen op de cellen. Vervang de 18-gauge naald met een 28-gauge naald vóór de injectie van de tumorcellen. Een injectie van 0,1 ml levert 2 x 10 5 cellen in de nier.
2. Chirurgische Area Voorbereiding
- Bereid een steriele chirurgischegebied van een bio kast door een steriele chirurgische laken op een verwarmingskussen. Verzamel alle benodigdheden, zoals forceps, scalpel, schaar, oogdruppels, 5% povidon-jood antiseptische en steriel gaas. Autoclaaf alle instrumenten voor gebruik.
- Voer de operatie met behulp van een aseptische tip techniek. Steriliseren instrumenten tussen dieren met een kraal sterilisator. Draag steriele handschoenen, een laboratoriumjas en een gezichtsmasker.
3. Bereiding van dieren
- Verdoven de muizen met ketamine / xylazine (87,5 mg / kg en 12,5 mg / kg, ip) volgens de institutionele richtlijnen. Bepaal verdoving diepte door het uitvoeren van een teen-snuifje.
- Wanneer het dier wordt beschouwd als niet-responsief, bereid de injectieplaats (bijvoorbeeld linker flank) aan Balb / c muizen door plukken (met de vingers) of scheren (via scheren) van de vacht.
- Verplaats de muizen van de operatie prep gebied (bijvoorbeeld de huiskooi) op de chirurgische stippellijn toepassing dierenarts zalf op deogen om uitdroging te voorkomen. Breng ruim zwabberen de voorbereide incisie site met 5% povidonjood antiseptische.
- Injecteren bupivacaine hydrochloride (0,1 ml van een 2,5 mg / ml oplossing sc) in het gebied waar de incisie wordt gemaakt als een pre-operatieve analgesie.
- Voeg een insnijding (~ 1,0-1,5 cm) op de linkerflank van de dieren met een steriele scalpel of schaar voorzichtig om te voorkomen dat het buikvlies dringen. Scheid de dermis van het buikvlies met steriele schaar. Dep de incisie site met steriel gaasje om geen bloed te verwijderen.
- Houd de muis met beide handen vast, met de linker hand op het hoofd en de rechterhand houden om de flank te ondersteunen.
- Identificeer de milt via het peritoneum en met één vinger van de rechterhand, palperen muis van onderaf; de nier is nu zichtbaar door het peritoneum zijn. Houd een stevige greep van het dier om de spanning aan de overkant van het buikvlies en de nieren te bieden.
- Laat een tweede persoon te injecteren de tumor cells (bereid in paragraaf 1.2.) door de intacte peritoneum in het midden van de nier met een 1 ml injectiespuit voorzien van een 28-gauge naald. Leveren langzaam 0,1 ml (2 x 10 5) cellen. Zodra de cellen zijn geïnjecteerd, houdt de naald op zijn plaats gedurende 5-10 s met het terugstromen van cellen te verminderen. Het is belangrijk om de behoefte aan uiterst voorzichtig mee tijdens deze stap, als de persoon die het injecteren van de cellen van de naald zal brengen in de nabijheid van de vingers van de persoon die de muis.
- Verwijder de naald en sluit de incisie met een dun laagje cyanoacrylaat weefsellijm.
- Leg het dier weer in een schone kooi met een steriele papieren handdoek. Laat de dieren om te herstellen op een verwarmingselement. Laat de dieren niet onbeheerd achter tijdens de herstelperiode. Laat de dieren niet terug naar woonomstandigheden tot ze rechtop en borstbeen. Volg de institutionele richtlijnen in alle procedures het gebruik van proefdieren.
4. Bioluminescent Imaging
- Monitor tumorgroei door bioluminescentie beeldvorming.
OPMERKING: Procedurele informatie voor het uitvoeren van bioluminescente beeldvorming kan worden verkregen van Lim et al. 20 De luciferase-signaal kan worden gedetecteerd zo vroeg als 24 uur na tumorcel implantatie. Aangezien er geen extern zichtbare tumor in dit model, is het essentieel om tumorgroei periodiek. Afhankelijk van het experiment ontworpen, kan orthotope tumorgroei verlopen gedurende variërende tijdsduur. Een voordeel van het gebruik van de luciferase expressie Renca-cellen die tumorgroei herhaaldelijk kan worden gevolgd hetzelfde dier regelmatig gedurende de duur van het experiment en een specifieke ondervraging van tumordragende en tumorvrij organen kan worden gedaan op een bepaald eindpunt.- Injecteren luciferine (0,1 ml van een 15 mg / ml oplossing in steriel PBS) ip en laat circuleren gedurende 10 minuten voordat de muis in de bioluminescentie beeldvormingssysteem. Plaats de mo Gebruik met zijn rug naar boven opgerold lichtjes op de zijkant, teneinde de geïnjecteerde nieren naar boven hebben.
- Meet de tumorlast in fotonen uitgezonden per seconde (foton flux) binnen een gedefinieerd gebied van belang (ROI) met behulp van beeldanalyse software.
- Kwantificering van de tumor belasting in individuele organen.
OPMERKING: Kwantificering kan worden uitgevoerd op bepaalde tijdstippen in individuele organen na verwijdering uit muizen geëuthanaseerd.- Injecteren muizen met luciferine, zoals in stap 4.1.
- Na 10 min, euthanaseren de muizen met een erkende procedure.
- Ontleden de organen van belang (bijvoorbeeld, de nieren en de longen; zie punt 5 hieronder). Breng het weefsel 35 x 10 mm petrischalen en plaats ze in de bioluminescentie beeldvormingssysteem.
- Meet de tumorlast in fotonen uitgezonden per seconde (foton flux) bij een gedefinieerde roi behulp van beeldanalyse software.
- Bij een gedefinieerde eindpunt voor de afzonderlijke experimenten, euthanize tumordragende muizen volgens institutionele richtlijnen voorkeur (bijvoorbeeld CO2, cervicale dislocatie, verdoving overdosis). Vermijd echter cervicale dislocatie als longen moeten worden verzameld na Oost-Indische inkt inflatie.
- Voer een grove beoordeling van primaire renale tumorgroei bij de geïnjecteerde nieren door het meten van het natte gewicht van de organen.
- De tumormassa (in g) bepalen, isoleer 21 en wegen van de tumordragende nieren en de contralaterale nier van dezelfde muis, waar het verschil in de nier gewicht bepaalt de tumormassa. ontleden zorgvuldig verwijderd eventueel overtollig bindweefsel uit de uitgesneden nieren voor het meten van hun gewicht.
- Beoordeelt de mate van tumor metastase naar de longen door het opblazen van de longen met Indische inkt voorafgaand aan excisie en onmiddellijk vaststelling van de longen in oplossing Fekete'slass = "xref"> 22. Handmatige berekening van metastatische laesies op het longoppervlak kan dan worden uitgevoerd.
- Maak een middellijn incisie met een schaar te beginnen bij het midden van de buik, door de ribbenkast, en omhoog door de nek / speekselklieren. Verwijder voorzichtig de ribbenkast met een schaar en forceps, zonder het longweefsel.
- Expose de trachea door het verwijderen van het bindweefsel.
- Bereid een 3 ml spuit met een 18-gauge naald gevuld met 10% Indische inkt oplossing in HBSS.
- Met behulp van pincet voorzichtig draad een zijden hechtdraad onder de luchtpijp. Dit zal worden gebruikt om af te hechten de luchtpijp eenmaal opgeblazen.
- Steek de naald in de luchtpijp en langzaam druk de spuit aan de longen met Oostindische inkt oplossing te blazen. Ongeveer 1-1,5 ml Indische inkt oplossing volledig opblazen van de longen.
- Knijp de trachea afgesloten door binden verschillende knopen, met het hechtmateriaal onder de naald om de terugstroming van de inkt verhinderen.
- afneeme de naald voorzichtig weggesneden het bindweefsel om de opgeblazen longen verwijderd.
- In een chemische zuurkast plaats de longen in een 15 ml conische buis met 5 ml oplossing Fekete's (35 ml 95% EtOH, 15 ml dH 2 O, 5 ml formaldehyde en 2,5 ml ijsazijn in een 100 ml glazen fles) 23.
- Laat de longen te repareren / ontkleuring voor 24-48 uur bij kamertemperatuur voorafgaand aan het handmatig tellen ontkleurd tumornodulen.
- Verwijder het intacte longen na ontkleuren en zorgvuldig ontleden vaste longen door het uitsteeksel in een 35 x 10 mm petrischaal. Tel het aantal tumornodules (witte nodules) op elk uitsteeksel onder een dissectiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De succesvolle implantatie van Renca-cellen leidt tot de ontwikkeling van tumoren in de nier en metastase naar de longen van de muizen. Na de excisie van de tumor-dragende en de contralaterale nieren werden vochtige doekje gewicht (g) gemeten om de tumorbelasting basis van gewichtstoename (figuur 1) tonen. Renca tumoren kunnen worden geïdentificeerd door immunohistochemie met cytokeratine 8 en 18 kleuring (figuur 2). Voor longitudinale studies, werd een luciferase-expressie Renca cellijn geïmplanteerd. Bioluminescente beeldvorming werd uitgevoerd met een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) om tumorlast en respons op de behandeling in de tijd (Figuur 3A) volgen. Metastase naar de longen werd bevestigd door bioluminescentie beeldvorming (Figuur 3B) gedrukte inkt longinflatie (Figuur 3C).
s / ftp_upload / 55080 / 55080fig1.jpg"/>
Figuur 1. Orthotope Renca implantatie van tumorcellen vormt een groot nierweefsel. Renca-GL-cellen (2 x 10 5 in 0,1 ml) werden geïnjecteerd intrarenally, en het gewicht van de uitgesneden tumordragende nieren en tumorvrij contralaterale nieren in gram (+ SEM) werden bepaald op dag 24 n = 15 tumor- gratis tumordragende nieren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Immunofluorescentie microscopische afbeelding van tumorvrije contralaterale en tumordragende nieren. Renca-GL-cellen (2 x 10 5 in 0,1 ml) werden geïnjecteerd intrarenally en tumordragende en tumorvrij nieren werden geoogst op dag 12. De nieren werden snap-ingevroren en verwerkt voor immunofluorescence beeldvorming om de locatie van collageen zichtbaar, cytokeratine 8 en 18 en CD31. 10x beelden werden genomen en aan elkaar genaaid om de gehele tumordragende nier bekijken. Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Orthotope Renca implantatie van tumorcellen leidt tot spontane longmetastasen. A. Renca-GL-cellen (2 x 10 5 in 0,1 ml) werden intrarenally geïnjecteerd in Balb / c muizen. Bioluminescent beelden werden genomen op de aangegeven dagen. B. Op dag 23, de longen tumorvrij en tumordragende muizen werden uitgesneden en bioluminescente beelden werden genomen. C. parallelle muizen op dag 23 hadden de longen opgeblazen met India inkt longtumor knobbeltjes visualiseren.Schaalbalken = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een protocol voor een orthotope RCC muismodel. Implantatie van muizen renale adenocarcinoom tumorcellen in de muis nier levert een klinisch relevante model mRCC. Dit model levert een primaire tumor in de nieren en metastasen in de longen, die beide kenmerken van geavanceerde RCC. De beschrijving hierin gepresenteerde specifiek is voor het Renca cellijn immunocompetente Balb / c muizen. Met deze orthotope model hebben we aangetoond dat de Renca tumoren reageren op immunotherapie, aantonen van de bruikbaarheid van dit model voor therapeutische testen 17, 24, 25, 26, 27. De mogelijkheid om een syngene tumor cellijn voor implantatie verschaft het voordeel van het bestuderen tumorprogressie in een immunologisch intacte dier. De syngene, orthotope en klinisch relevante characteristics van dit systeem zorgen voor een superieure model die het mogelijk maakt voor het testen van therapieën in een relevant preklinisch model. Dit kan niet worden gerepliceerd wanneer de tumoren subcutaan geïmplanteerd. Het is belangrijk te vermelden dat een dergelijk modelsysteem niet beperkt is tot de evaluatie van anti-tumor immuunreacties of diverse immunotherapeutische benaderingen voor de behandeling van RCC. Het is mogelijk om humane tumorcellen intrarenally geïmplanteerd in immunodeficiënte muizen gebruiken, afhankelijk van het soort experiment uitgevoerd. De beschikbaarheid van vastgestelde RCC cellijnen die in vitro worden gekweekt verbetert de reproduceerbaarheid van deze in vivo orthotopic model, omdat alle dieren kunnen worden geïmplanteerd met een gelijk aantal tumorcellen tegelijkertijd. Verder kunnen de tumorcellen worden gemanipuleerd in vitro voorafgaand aan implantatie intrarenale bieden de mogelijkheid om te bepalen hoe de cellen groeien en / of reageren op omgevingssignalen. Een beperking met deze (en de meeste) Implantabel tumormodellen is dat omzeilen de vroege gebeurtenissen die verantwoordelijk zijn voor tumorvorming, een voordeel dat wordt geboden door een muismodel genetisch gemanipuleerd voor het vormen van autochtone tumoren.
Een nadeel van de orthotope model is de algemene onmogelijkheid om tumorgroei te visualiseren, een eigenschap die gemakkelijk wordt gecontroleerd door een sc tumor diktemeting. Huidige technologie met behulp van genetisch gemanipuleerde tumorcellen en bioluminescentie beeldvorming maakt longitudinale metingen van interne tumors. We hebben de mogelijkheid om primaire renale tumor en metastatische last te bepalen op verschillende tijdstippen op basis van bioluminescentie beeldvorming en / of orgel extractie 17, 24, 25 aangetoond. Een sterk punt van ons model is de beschikbaarheid van de GFP en luciferase tot expressie Renca cellijn, maar het model niet deze functie voor succes nodig. We hebben gekenmerkt de ofthotopic RCC model met zowel parentale Renca en Renca-cellen GL. Na implantatie van Renca-GL cellen, primaire tumoren kunnen gemakkelijk worden gemeten door bioluminescentie beeldvorming. Het kan moeilijk zijn om metastasen te controleren in het gehele dier echter de primaire tumor een signaal dat de onderste signalen die eventuele door de metastatische plaats overspoelt kan produceren. Uitsnijden en beeldvorming van de individuele organen van het gehele dier maakt de visualisatie en kwantificering van uitzaaiingen in deze organen. In het Renca orthotope model, de primaire niertumoren leiden tot spontane micro-metastasen in de longen van de dieren reeds op 7 dagen na implantatie, zoals gezien door luminescentie in de uitgesneden longweefsel 17.
Terwijl het gebruik van een luciferase-expressie tumorcellijn in dit systeem biedt de gebruiker de mogelijkheid om tumorprogressie longitudinaal spoor in hetzelfde dier, voorziet de gebruiker ook de mogelijkheid om evaluate de nauwkeurigheid van de implantatie techniek. De muis nier is een kleine anatomische structuur, waardoor het mogelijk is, vooral bij gebruik van een lange naald om de tumorcellen te injecteren door de nieren en direct in het peritoneum. Het afbeelden van de muis binnen enkele dagen na injectie bepaalt de mate waarin de implantatie van de tumorcellen wordt gelokaliseerd in de nieren. Een ander kenmerk dat de intrarenaal injectie kan bemoeilijken is de aanwezigheid van een overvloed aan visceraal vet die zich ophopen als het dier ouder. De nier is goed zichtbaar door het buikvlies in een magere muis, maar de nier kan verduisterde onder lobben van visceraal vet dat na verloop van tijd kunnen ontwikkelen geworden.
Aan het einde van een bepaald experiment kan een aantal evaluaties worden gebruikt om het gehele lichaam tumorlast bepalen. Bioluminescente beeldvorming van de uitgesneden organen een objectieve maatstaf tumorlast. Het natgewicht van primaire tumoren genormaliseerd met de contralaterale kidney als een interne controle verschaft een bulk massameting. De metastatische belasting in de longen kan worden bepaald door het opblazen van de longen met Indische inkt en bloc om de visualisatie van witte nodules longtumor met behulp van een dissectiemicroscoop. Deze uitlezing kan total-body tumor last, die als basis kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de therapeutische werkzaamheid bij de pre-klinische fase van ontwikkeling van geneesmiddelen vast te stellen. De expressie van GFP door GL Renca-cellen leent zich ook voor flowcytometrische analyses van de tumordragende weefsels. Echter voorzichtigheid geboden voor stroom cytometrische bepaling van de tumordragende nieren, met name bij het onderzoek van de samenstelling en omvang van de immunologische respons gegenereerd als gevolg van de behandeling. Nieren zijn sterk vasculaire organen, waarbij het waarschijnlijk dat de evaluatie van de immuunrespons (ofwel pro-tumor of anti-tumor) in de gehele tumordragende nieren zowel "weefsel- en vasculatuur-lokaliseren omvattend" immuuncellen op het moment van de oogst orgel. Om weefsel versus bloed immuuncellen onderscheiden, gebruik gemaakt van een techniek waarbij fluorochroom-gemerkt anti-CD45.2 monoklonaal antilichaam (mAb) iv geïnjecteerd voor euthanasie. De nieren worden vervolgens bereid voor stroming cytometry, die ex vivo kleuring met verschillende fluorochroom-gemerkt anti-CD45.2 mAb 28, 29. CD45.2 Dubbele kleuring onderscheid cellen binnen de vasculatuur van het weefsel op het moment van de oogst omvat. Deze eenvoudige protocol maakt de identificatie van belangrijke leukocyt lijnen opgenomen in het vaatstelsel die anders de interpretatie van adaptieve en aangeboren immuunreacties in weefsels kunnen verwarren. Dit protocol elimineert ook de noodzaak voor perfusie, die onbedoelde gevolgen 28 kan hebben, 29.
Er is momenteel een verhoogde waardering voor en het gebruik van immunotherapieom kanker te behandelen. De ontwikkeling van toekomstige immunologisch-based behandelingen voor mRCC (en andere vormen van kanker) begint in het laboratorium met behulp van een clinically- en fysiologisch relevante model. De RCC orthotope model beschreven bevat een aantal belangrijke functies (bijvoorbeeld primaire niertumor, metastasen, door tumor geïnduceerde immuunsuppressie, en componenten voor het longitudinaal volgen van tumorgroei) voor het testen van de doeltreffendheid van verschillende therapeutische modaliteiten. Het is ook verleidelijk te speculeren dat dit model kan worden aangepast aan toekomstige vooruitgang in andere middelen voor het behandelen RCC, zoals chirurgische en / of focale therapieprotocollen evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Cancer Institute (R15CA173657 AW en R01CA109446 naar TSG), de Simmons Cancer Institute (AW), en de Universiteit van Minnestoa Klim 4 Kidney Cancer Foundation (naar TSG). Wij danken Dr. Kristin Anderson voor hulp bij de immunofluorescentie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-162-35 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | CBGBIW011019 | |
| Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-155-32 | |
| 0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection) | Hospira | 0409-1587-50 | |
| Heating pad | Sunbeam | ||
| Syringes | BD | 309659 | |
| Gauze | Venture | 908291 | |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | NDC 57319-609-02 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-111 | |
| Hank’s Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| IVIS | Caliper | ||
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | |
| India Ink | Chartpak Inc | 44201 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Sleeping Beauty (SB) transposon system | Neuromics | SBT0200 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).
- Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. Epidemiology and risk factors for kidney cancer. Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).
- Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect. J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).
- Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma. Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).
- Rini, B. I. New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance. Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).
- Acquavella, N., Fojo, T. Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy. J. Immunother. 36, 459-461 (2013).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).
- Ko, J. S., et al. Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained. Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).
- Kusmartsev, S., et al. Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma. J. Immunol. 181, 346-353 (2008).
- Rocha, F. G., et al. Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice. Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).
- Shanker, A., et al. Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody. J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).
- VanOosten, R. L., Griffith, T. S. Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy. Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).
- Devaud, C., et al. Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors. Oncoimmunology. 3, 963395 (2014).
- Devaud, C., et al. Cross-talk between tumors can affect responses to therapy. Oncoimmunology. 4, 975572 (2015).
- Norian, L. A., et al. Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy. PLoS One. 7, 31085 (2012).
- Matin, S. F., et al. Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model. J. Urol. 183, 333-338 (2010).
- Wilber, A., et al. RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues. Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , (2009).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. , (2013).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse. J. Vis. Exp. , (2010).
- Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).
- James, B. R., et al. CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).
- James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC. Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).
- James, B. R., et al. Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth. J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).
- Brincks, E. L., et al. Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma. FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).
- Anderson, K. G., et al. Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses. J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).
