Summary
Genomförande av en ortotopisk modell av njurcellscancer i immunkompetenta möss ger utredaren en kliniskt relevanta system definieras av närvaron av en primär njurtumör och lungmetastaser i samma djur. Detta system kan användas för att prekliniskt testa en mängd olika behandlingar in vivo.
Abstract
Njurcellscancer (RCC) drabbar> 60.000 människor i USA varje år, och ~ 30% av RCC-patienter har flera metastaser vid tidpunkten för diagnos. Metastaserande RCC (mRCC) är obotlig, med en medianöverlevnadstid av endast 18 månader. Immunbaserade interventioner (t ex interferon (IFN) och interleukin (IL) -2) inducerar varaktiga responser i en fraktion av MRCC patienter och multikinashämmare (t.ex. sunitinib eller sorafenib) eller anti-VEGF-receptor monoklonala antikroppar (mAb) är till stor del palliativ som kompletta remission är sällsynta. Sådana brister i nuvarande terapier för MRCC patienter ger den logiska grunden för utveckling av nya behandlingsprotokoll. En nyckelkomponent i den prekliniska testning av nya terapier för mRCC är en lämplig djurmodell. Nyttiga funktioner som rekapitulera människans villkor inkluderar en primär njurtumör, njurtumörmetastaser, och ett intakt immunsystem för att undersöka någon terapi driven immun effector svar och bildningen av tumörframkallad immunosuppressiva faktorer. Denna rapport beskriver en orthotopic mRCC musmodell som har alla dessa egenskaper. Vi beskriver en intrarenal implanteringstekniken genom att använda musen renal adenokarcinom cellinje Renca, följt av bedömning av tumörtillväxt i njuren (primärt ställe) och lungorna (metastatisk språk).
Introduction
Njurcellskarcinom (RCC) står för huvuddelen av maligna njur neoplasmer och ungefär 3% av alla vuxna maligniteter världen över ett, två. Grund av brist på symptom, fel diagnos, och otillräckliga screening verktyg för RCC, kommer nästan 30% av patienterna presentera med metastaserad RCC (mRCC) vid tidpunkten för diagnos, med ytterligare 20-30% av patienterna som fortskrider till en metastatisk stadium två. Dessa fall resulterar i ~ 13.500 dödsfall årligen 1, 3. Även om tidigare upptäckt och behandling av primär RCC har förbättrats, hastigheten för RCC relaterat dödsfall fortsätter att öka, vilket antyder att metastatisk sjukdom är till stor del ansvarig för dödlighet 3. Terapi utveckling för RCC har utvecklats under det senaste decenniet med upptäckten och genomförande av riktade behandlingar och immunterapi. Tyvärr progressionsfri survival och total överlevnad av avancerade fall är fortfarande väl under 2 år för majoriteten av patienterna 4, 5, 6. Denna statistik motiverar behovet av ytterligare forskning om identifiering och utveckling av effektiva behandlingar för RCC. Att på lämpligt sätt föra terapeutiska ingrepp för MRCC först behövs translationellt relevanta prekliniska modeller av sjukdomen.
Utveckling av en relevant och konsekvent modell för att rekapitulera det mänskliga tillståndet av avancerad RCC bör ta itu med flera viktiga frågor: 1) är den modell anatomiskt relevant; 2) Har tumör framsteg på liknande sätt som den humana patologin; 3) Gör metastaser uppstår från den primära tumören; och 4) Kan primär och metastatisk tumörprogression följas över tid? Beroende på vilken typ av behandling som undersöks, mus RCC tumörcellinjer, humana RCC tumörcellinjer och humana RCC patienten härledda xenogflottar kan användas i immunkompetenta eller immundefekta möss. En värd med ett intakt och funktionellt immunsystem krävs för de studier som utvärderar någon aspekt av immunterapi, nödvändiggör användning av den väl beskrivna Renca cellinje härledd från en spontan renal adenokarcinom i Balb / c-möss 7. De flesta studier injicera RENCA-celler subkutant (sc), som bildar en enkel att mått lokal tumör eller intravenöst (iv) i Balb / c-möss för att producera experimentella lung "metastaser" 8, 9, 10, 11, 12. Användning av en sc-implanterat Renca tumör för att modellera humana RCC har ett antal begränsningar, inklusive felaktig innervation av vaskulatur 13, skillnader i mikromiljö 14, 15, och en brist av organ- / tumörcell Communication 13, 16. Dessutom är det många sc tumörer (särskilt Renca) inte metastasera till distala organ, hämmar studiet av en händelse som är ett vanligt kliniskt kännetecken 17. Att studera MRCC kan RENCA-celler injiceras iv att etablera tumörbördan i lungorna, den primära platsen för metastaser i RCC patienter. Iv-injektion metod att initiera metastatiska tumörer, dock inte tillåter undersökning av hur, när, eller varför cellerna har migrerat från den primära organet (dvs njure) till den avlägsna platsen. En modell med både primära och metastatisk sjukdom tydligt i samma djur är avgörande för att studera utvecklingen och behandling av framskriden sjukdom, särskilt med tanke på att metastaser är vanligen orsaken till dödlighet hos dessa patienter.
Vårt laboratorium har utvecklat en musmodell av mRCC som innehåller alla de funktioner som beskrivs ovan. Att etablera primary, ortotopiska tumörer, är Renca celler implanteras direkt i njuren hos djuret genom den genomskinliga bukhinnan. Ett litet snitt i den vänstra flanken möjliggör visualisering av mjälten (som ett landmärke) och den vänstra njuren. Med användning av en liten nål, är Renca-tumörceller injiceras direkt i njuren genom peritoneum för orthotopic implantation. Jämfört med andra metoder för implantering av RENCA-celler under njurkapseln 18, denna metod för implantering tillåter en högre genomströmning, eftersom det är ganska icke-invasiv, inte kräver suturering, är av en låg smärt klass, och är tidseffektivt när tränad.
Denna väl karaktäriserade modellresultat i reproducerbar primär tumörbörda (~ 99% utnyttjandegrad) i den injicerade njuren samt metastatisk tumörbelastning i lungorna. De stora fördelarna med denna modell inkluderar dess syngena natur, vilket möjliggör immunterapi undersökningar; dess spontana metastaser, att studera ettVANCERADE sjukdom; och dess orthotopic implantation, för att modellera den anatomiska inverkan på sjukdomsförloppet och behandling. Terapier som syftar till att rikta RCC skulle ha stor nytta av användningen av denna modell under preklinisk utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll beskriver ett experimentellt förfarande för inducering och övervakning av tillväxten av experimentella ortotopiska njurtumörer och eventuella spontana metastaser. Alla följande procedurer görs i enlighet med institutionella riktlinjer och godkända förfaranden för human användning av försöksdjur.
1. Underhåll av cellinjer
- Upprätthålla murin renal adenokarcinom cellinje, Renca, i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin och 1 mM vardera av icke-essentiella aminosyror, L-glutamin och natriumpyruvat (hänvisat till som fullständigt RPMI). Kulturceller i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2.
OBS: Som med alla etablerad cellinje, är det rekommenderat att använda låg passage-antal Renca-celler för transfektion och efterföljande implantation för att minimera eventuella fenotypiska eller genetiska förändringar som kan uppstå efter långtidskulture.- Använda en transposon system för att manipulera Renca-celler att stabilt uttrycka grönfluorescerande protein (GFP) och eldflugeluciferas.
- Med användning av en katjonisk liposom-baserade transfektionsreagens, co-transfektera Renca-celler med ett transposas-expressionsvektor (pPGK-SB11) och en transposon vektor som kodar för uttrycket av eldflugeluciferas, samt en fusionsgen som kodar för GFP och zeocinresistensgenen , båda under transkriptionskontroll av en dubbelriktad promotor (pKT2 / LuBiG) 19.
- Två dagar senare, plätera de transfekterade cellerna vid en begränsande utspädning och tillåta cellerna att expandera i komplett RPMI kompletterat med zeocin (300 ug / ml). Bekräfta GFP uttryck i varje klon med flödescytometri. Dessa celler benämns Renca-GL.
OBS: Begränsande-utspädningskloning kommer att tillåta de utvalda cellerna att vara härledda från en enda cell.
- Använda en transposon system för att manipulera Renca-celler att stabilt uttrycka grönfluorescerande protein (GFP) och eldflugeluciferas.
- Att implantera Renca celler intrarenally, förbereda Renca-celler into en enkelcellsuspension med 2 x 10 6 celler / ml i Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
- Avlägsna adherenta Renca-celler från vävnadskulturkolv med användning av 0,25% trypsin i HBSS. Efter ~ 5 minuter, tillsätt fullständigt RPMI till kolven för att neutralisera trypsin och överföra celler till ett centrifugrör för tvättning. Centrifugera cellerna vid 300 relativ centrifug g kraft (RCF xg) under 5 min vid 25 ° C.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera cellerna i HBSS. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer och justera volymen med HBSS för att ge 2 x 10 6 celler / ml.
- Dra cellerna till en 1-ml spruta utrustad med en 18-gauge nål för att förhindra skjuvspänning på cellerna. Ersätta den 18-gauge nål med en 28-gauge nål före injektionen av tumörcellerna. En injektion av 0,1 ml levererar 2 x 10 5 celler in i njure.
2. Kirurgisk Area Framställning
- Förbereda en steril kirurgiskområde i en biosäkerhet skåp genom att placera en steril kirurgisk duk över en värmedyna. Samla alla leveranser, inklusive pincett, skalpell, sax, ögondroppar, 5% povidon-jod antiseptisk och steril gasbinda. Autoklav alla instrument före användning.
- Utföra operationen med hjälp av en aseptisk spets teknik. Omsteriliseras instrument mellan djur med en pärla autoklav. Bär sterila handskar, en labbrock, och en ansiktsmask.
3. Djurpreparering
- Söva mössen med ketamin / xylazin (87,5 mg / kg och 12,5 mg / kg, respektive, ip) enligt institutionella riktlinjer. Bestäm anestesidjup genom att utföra en toe-nypa.
- När djuret anses vara icke-responsiva, förbered injektionsstället (t ex vänster flank) på Balb / c-möss genom att plocka (med fingrarna) eller spån (med användning av hårklippnings) pälsen.
- Flytta mössen från operationen prep område (t.ex., höljet bur) till det kirurgiska området och tillämpa veterinär salva tillögon för att förhindra torrhet. Frikostigt bomullstoppen den förberedda snittstället med 5% povidon-jod antiseptisk.
- Injicera bupivakain-hydroklorid (0,1 ml av en 2,5 mg / ml lösning, subkutant) in i området där snittet kommer att göras som en pre-operativ analgesi.
- Göra en enda snitt (~ 1,0 - 1,5 cm) på den vänstra flanken hos djuret med användning av en steril skalpell eller sax, försiktigt för att inte penetrera bukhinnan. Separera dermis från bukhinnan med steril sax. Badda snittet platsen med steril gasväv för att avlägsna något blod.
- Håll musen med båda händerna, med vänster hand för att hålla huvudet och höger för att stödja flanken.
- Identifiera mjälten genom peritoneum och, med ett finger av den högra sidan, palpera musen underifrån; njuren bör nu vara synlig genom bukhinnan. Håll ett fast tag i djuret för att ge spänning över bukhinnan och njure.
- Har en annan person injicera tumören cells (framställd i avsnitt 1,2.) genom den intakta bukhinnan in i centrum av njuren med användning av en 1-ml spruta utrustad med en 28-gauge nål. Långsamt avge 0,1 ml (2 x 10 5) av celler. När cellerna väl är injiceras, hålla nålen på plats under 5 - 10 s för att minska återflödet av celler. Det är viktigt att notera behovet av extrem försiktighet under detta steg, som den person injicera cellerna kommer att föra in nålen i närheten av fingrarna på den person som innehar musen.
- Ta bort nålen och stäng snittet med ett tunt skikt av cyanoakrylat vävnadsklister.
- Placera djuret tillbaka till en ren bur med en steril pappershandduk. Låt djuren att återhämta sig på en värmedyna. Lämna inte djuren obevakad under återhämtningsperioden. Inte tillbaka djuren till standardbostadsförhållanden tills de är upprätt och sternala. Följ institutionens riktlinjer i alla förfaranden som använder försöksdjur.
4. Bioluminiscerande Imaging
- Övervaka tumörtillväxt genom självlysande avbildning.
OBS: Förfarande detaljer för utförande bioluminescerande avbildning kan erhållas från Lim et al. 20 Den luciferas signalen kan detekteras så tidigt som 24 h efter tumörcell implantation. Eftersom det inte finns någon externt synlig tumör i den här modellen, är det viktigt att övervaka tumörtillväxt med jämna mellanrum. Beroende på utformade experiment kan orthotopic tumörtillväxt fortsätta under kortare eller längre tid. En fördel med användning av de luciferas-uttryck Renca celler är att tumörtillväxt kan upprepade gånger övervakas i samma djur med regelbundna intervall under hela experimentet, och en specifik förhör av tumörbärande och tumörfria organ kan göras på ett definierad ändpunkt.- Injicera luciferin (0,1 ml av en 15 mg / ml lösning i sterilt PBS) ip och låt den cirkulera i tio minuter innan de placeras musen in i bioluminescens avbildningssystemet. Placera mo använda med sin ryggsidan uppåt, rullade något på sin sida, för att få den injicerade njurarna uppåt.
- Mäta tumörbördan i fotoner av ljus som avges per sekund (fotonflöde) inom ett definierat område av intresse (ROI) med användning av bildanalysmjukvara.
- Kvantifiering av tumörbörda i enskilda organ.
OBS: Kvantifiering kan utföras vid definierade tidpunkter i enskilda organ efter deras avlägsnande från avlivade möss.- Injicera mössen med luciferin, som i steg 4,1.
- Efter 10 min, euthanize möss med användning av en godkänd procedur.
- Dissekera ut organ av intresse (t.ex. njurar och lungor, se avsnitt 5 nedan). Överföra vävnaden till 35 x 10-mm Petri skålar och placera dem in i bioluminescens avbildningssystemet.
- Mäta tumörbördan i fotoner av ljus som avges per sekund (fotonflöde) inom definierade roi med användning av bildanalysmjukvara.
- Vid en definierad ändpunkt för den enskilda experiment euthanize tumörbärande möss enligt föredragna institutionella riktlinjer (t.ex. CO 2, cervikal dislokation, överdoser anestesi). Undvik dock att halsdislokation om lungorna ska samlas in efter tusch inflation.
- Utföra en grov bedömning av primära njurtumörtillväxt i den injicerade njuren genom att mäta den våta organvikten.
- För att bestämma tumörmassan (i g), isolera 21 och väga det tumörbärande njure och den kontralaterala njuren från samma mus, där skillnaden i njurvikt definierar tumörmassan. Försiktigt dissekera bort eventuella främmande bindväv från de utskurna njurar före mätning sina vikter.
- Bedöma graden av tumörmetastaser till lungorna genom uppblåsning av lungorna med tusch före excision och omedelbart fastställande av lungorna i Fekete lösninglass = "xref"> 22. Manuell beräkning av metastaser på lungytan kan sedan utföras.
- Gör en mittlinjen snitt med sax som börjar vid mitt buken, genom bröstkorgen, och upp genom halsen / spottkörtlar. Försiktigt bort bröstkorgen med sax och pincett, utan att kompromissa med lungvävnad.
- Exponera luftstrupen genom att ta bort bindväv.
- Förbereda en 3 ml spruta med en 18-gauge nål fylld med 10% tusch lösning i HBSS.
- Använd pincett försiktigt tråd en siden sutur under luftstrupen. Detta kommer att användas för att knyta upp luftstrupen när uppblåst.
- Försiktigt in nålen ner i luftstrupen och långsamt trycka sprutan för att blåsa lungorna med bläcklösningen Indien. Cirka 1 - 1,5 ml av tusch lösning kommer att till fullo fylla lungorna.
- Nyp luftstrupen stängs genom att knyta flera knutar, med suturen under nålen för att inhibera backflöde av bläck.
- Avtagbare nålen och försiktigt skära bort bindväv för att ta bort de uppblåsta lungorna.
- I en kemisk dragskåp, placera lungorna in i en 15-ml koniskt rör innehållande 5 ml Fekete lösning (35 ml av 95% EtOH, 15 ml dH 2 O, 5 ml formaldehyd och 2,5 ml glacial sura syra i en 100-mL glass flaska) 23.
- Tillåta lungorna att fixera / avfärgning under 24 - 48 h vid rumstemperatur före manuellt räknar de avfärgades tumörmoduler.
- Avlägsna de intakta lungorna efter avfärgning och försiktigt dissekera de fasta lungorna genom loben i en 35 x 10 mm Petri skål. Räkna antalet tumörknölar (vita noduler) på varje lob under ett dissektionsmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den framgångsrika implantation av RENCA-celler resulterar i tumörutveckling i njuren och metastasering till lungorna hos möss. Efter excision av tumörbärande och de kontralaterala njurar, var våta vävnadsvikter (g) mättes för att demonstrera tumörbördan baserat på ökad vikt (Figur 1). Renca-tumörer kan identifieras genom immunhistokemi genom cytokeratin 8 och 18 färgning (figur 2). För longitudinella studier gjordes en luciferas-uttryck Renca cellinje implanteras. Bioluminescerande avbildning utfördes med användning av ett in vivo-avbildningssystem (IVIS) för att spåra tumörbörda och terapisvaret över tiden (figur 3A). Metastas till lungorna bekräftades genom bioluminescerande avbildning (figur 3B) och tusch lunginflations (figur 3C).
s / ftp_upload / 55.080 / 55080fig1.jpg"/>
Figur 1. Orthotopic implantation av Renca-tumörceller bildar en stor njurmassa. Renca-GL-celler (2 x 10 5 i 0,1 ml) injicerades intrarenally, och vikterna av de utskurna tumörbärande njurar och tumörfria kontralaterala njurar i gram (+ SEM) bestämdes på dag 24. n = 15 tumör- fria och tumörbärande njurar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Immunofluorescens mikroskopbild av de tumörfria kontra och tumörbärande njurar. Renca-GL-celler (2 x 10 5 i 0,1 ml) injicerades intrarenally, och de tumörbärande och tumörfria njurar skördades på dag 12. Njurarna snabbfrystes och behandlades för immunofluorescence avbildning för att visualisera placeringen av kollagen, cytokeratin 8 och 18, och CD31. 10x bilder togs och sys ihop för att se hela tumörbärande njuren. Skalstrecken = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Orthotopic implantation av Renca-tumörceller leder till spontana lungmetastaser. A. Renca-GL-celler (2 x 10 5 i 0,1 ml) injicerades intrarenally i Balb / c-möss. Självlysande bilder togs på de angivna dagarna. B. På dag 23, lungorna från tumörfria och tumörbärande möss ut och självlysande bilder togs. C. parallella uppsättningar av möss på dag 23 hade sina lungor blåses upp med tusch att visualisera lungtumör knölar.Skalstrecken = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar ett protokoll för en ortotopisk RCC musmodell. Implantation av mus renala adenokarcinom tumörceller i musens njure ger en kliniskt relevant modell av mRCC. Denna modell resulterar i en primärtumör i njuren och fjärrmetastaser i lungorna, som båda är kännetecken för avancerad RCC. Den beskrivning som presenteras häri är specifikt för Renca-cellinjen hos immunkompetenta Balb / c-möss. Med hjälp av denna ortotopisk modell har vi visat att Renca-tumörer är mottagliga för immunterapi, vilket visar användbarheten av denna modell för terapeutisk testning 17, 24, 25, 26, 27. Förmågan att använda en syngen tumörcellinje för implantering tillhandahåller fördelen av att studera tumörprogression i ett immunologiskt intakt djur. Det syngena, orthotopic och kliniskt relevant kännemärkena i detta system ger en överlägsen modell som tillåter för testning av terapier i en relevant preklinisk modell. Detta kan inte kopieras när tumörerna implanteras subkutant. Det är viktigt att nämna att ett sådant modelleringssystem är inte begränsad till att utvärdera anti-tumörimmunsvar eller olika immun metoder för behandling av njurcancer. Det skulle vara möjligt att använda humana tumörceller implanterade intrarenally i möss med immunbrist, beroende på vilken typ av experiment som utförs. Tillgängligheten av etablerade RCC-cellinjer som kan odlas in vitro förbättrar reproducerbarheten av denna in vivo-ortotopisk modell, eftersom alla djur kan implanteras med ett lika stort antal tumörceller samtidigt. Vidare kan tumörcellerna manipuleras in vitro före intrarenal implantation erbjuder möjligheten att styra hur cellerna växer och / eller svara på signaler från omgivningen. En begränsning med detta (och de flesta) implantabell tumörmodeller är att de kringgår de tidiga händelser är ansvariga för tumörbildning, en fördel som ges med hjälp av en musmodell genetiskt för bildandet av inhemska tumörer.
En nackdel med den ortotopisk modell är den allmänna oförmågan att visualisera tumörtillväxt, en funktion som lätt övervakas för en sc-tumör genom tjockleksmätning. Nuvarande teknik med användning av genetiskt modifierade tumörceller och bioluminescerande avbildning medger längsgående mätningar av interna tumörer. Vi har visat förmåga att bestämma primär njurtumör och metastaserande börda vid olika tidpunkter baserade på självlysande avbildning och / eller organ utvinning 17, 24, 25. En styrka i vår modell är tillgången på GFP och luciferas-uttryckande Renca cellinje men modellen kräver inte den här funktionen för att lyckas. Vi har präglat ellerthotopic RCC modell med både föräldra Renca och Renca-GL-celler. Efter implantation av Renca-GL-celler, kan primära tumörer lätt mätas genom bioluminescerande avbildning. Det kan vara svårt att övervaka metastaser i hela djuret, men eftersom den primära tumören kan producera en signal som överväldigar de lägre signaler som kan emitteras från den metastatiska stället. Skära och avbildning enskilda organ från hela djuret möjliggör visualisering och kvantifiering av metastaser i dessa organ. I Renca ortotopisk modell, de primära njurtumörer ger upphov till spontana mikrometastaser i lungorna hos djuren så tidigt som 7 dagar efter implantat, sedda av luminiscens i den utskurna lungvävnad 17.
Medan användningen av en luciferas-uttryckande tumörcell-linje i detta system ger användaren möjlighet att spåra tumörprogression i längdled i samma djur, det ger också användaren med förmågan att evaluate precisionen i implanteringstekniken. Musen njure är en liten anatomisk struktur, vilket gör det möjligt, i synnerhet vid användning av en lång nål, att injicera tumörcellerna genom njuren och direkt in i peritoneum. Avbildning musen inom flera dagar av injektion bestämmer den utsträckning i vilken implantationen av tumörcellerna är lokaliserad till njuren. En annan funktion som kan komplicera intrarenal injektion är närvaron av ett överflöd av visceralt fett, vilket kan ackumuleras som djuret åldrar. Njuren är väl synlig genom bukhinnan i en mager mus, men njuren kan bli skymd enligt lober av visceralt fett som kan utvecklas över tiden.
Vid slutet av ett givet experiment, kan ett antal bedömningar användas för att bestämma hela kroppen tumörbörda. Bioluminescent avbildning av de utskurna organ ger ett objektivt mått på tumörbörda. Den våta vikten av primära tumörer normaliserade till den kontralaterala kidney som en intern kontroll tillhandahåller en bulkmassmätning. Den metastatiska börda i lungan kan även bestämmas genom att blåsa lungorna med tusch i klump för att möjliggöra visualisering av vita lungtumörknölar med användning av ett dissekerande mikroskop. Dessa avläsning kan etablera hela kroppen tumörbörda, som kan användas som utgångspunkt för att undersöka den terapeutiska effekten på pre-kliniska stadiet av läkemedelsutveckling. Expressionen av GFP av Renca-GL-celler lämpar sig också för flödescytometriska analyser av tumörbärande vävnader. Emellertid måste försiktighet iakttas för någon flödescytometrisk utvärdering av tumörbärande njuren, särskilt vid undersökning av kompositionen och omfattningen av varje immunologiskt svar som genereras som en följd av behandlingen. Njurar är mycket vaskulära organ, vilket gör det troligt att utvärderingen av immunsvaret (antingen pro-tumör eller anti-tumör) i hela tumörbärande njurar kommer att omfatta både "vävnads- och kärl-Lokaliserad" immunceller vid tidpunkten för organskörd. För att skilja vävnad kontra blodimmunceller, använder vi en teknik där fluorokrom-märkt anti-CD45.2 monoklonal antikropp (mAb) injiceras iv före eutanasi. Njurarna framställes sedan för flöde cytometri, som inkluderar ex vivo färgning med olika fluorokrom-märkt anti-CD45.2 mAb 28, 29. Dual CD45.2 färgning diskriminerar celler inom vaskulaturen från vävnaden vid tidpunkten för skörd. Denna enkla protokollet möjliggör identifiering av större leukocyt härstamningar som finns i kärlsystemet som annars skulle förvirra tolkningen av adaptiva och medfödda immunsvar i vävnader. Detta protokoll eliminerar också behovet av perfusion, som kan ha oönskade konsekvenser 28, 29.
Det finns för närvarande en ökad uppskattning för och användning av immunterapiför att behandla cancer. Utvecklingen av framtida immunologiskt baserade behandlingar för mRCC (och andra cancerformer) börjar i laboratoriet med hjälp av en clinically- och fysiologiskt relevant modell. Den ortotopisk RCC modell som beskrivs häri innehåller ett antal viktiga funktioner (t.ex. primär njurtumör, fjärrmetastaser, tumör-inducerad immunsuppression, och komponenter för längsgående övervakning av tumörtillväxt) för testning av effektiviteten av en mängd olika terapeutiska modaliteter. Det är också frestande att spekulera i att denna modell skulle kunna anpassas i framtiden för att utvärdera framsteg inom andra medel för behandling av RCC, som kirurgisk och / eller fokala terapiprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Cancer Institute (R15CA173657 till AW och R01CA109446 till GTS), Simmons Cancer Institute (till AW), och University of Minnestoa Klättra 4 Kidney Cancer Foundation (till GTS). Vi tackar Dr Kristin Anderson för att få hjälp med immunofluorescens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-162-35 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | CBGBIW011019 | |
| Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-155-32 | |
| 0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection) | Hospira | 0409-1587-50 | |
| Heating pad | Sunbeam | ||
| Syringes | BD | 309659 | |
| Gauze | Venture | 908291 | |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | NDC 57319-609-02 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-111 | |
| Hank’s Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| IVIS | Caliper | ||
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | |
| India Ink | Chartpak Inc | 44201 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Sleeping Beauty (SB) transposon system | Neuromics | SBT0200 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).
- Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. Epidemiology and risk factors for kidney cancer. Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).
- Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect. J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).
- Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma. Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).
- Rini, B. I. New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance. Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).
- Acquavella, N., Fojo, T. Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy. J. Immunother. 36, 459-461 (2013).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).
- Ko, J. S., et al. Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained. Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).
- Kusmartsev, S., et al. Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma. J. Immunol. 181, 346-353 (2008).
- Rocha, F. G., et al. Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice. Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).
- Shanker, A., et al. Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody. J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).
- VanOosten, R. L., Griffith, T. S. Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy. Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).
- Devaud, C., et al. Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors. Oncoimmunology. 3, 963395 (2014).
- Devaud, C., et al. Cross-talk between tumors can affect responses to therapy. Oncoimmunology. 4, 975572 (2015).
- Norian, L. A., et al. Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy. PLoS One. 7, 31085 (2012).
- Matin, S. F., et al. Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model. J. Urol. 183, 333-338 (2010).
- Wilber, A., et al. RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues. Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , (2009).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. , (2013).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse. J. Vis. Exp. , (2010).
- Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).
- James, B. R., et al. CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).
- James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC. Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).
- James, B. R., et al. Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth. J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).
- Brincks, E. L., et al. Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma. FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).
- Anderson, K. G., et al. Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses. J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).
