Summary
Metástases cerebrais tornou-se uma necessidade médica não atendida urgente como a sua incidência tem aumentado enquanto as opções terapêuticas têm permanecido paliativos. Criando modelos animais experimentais de metástase cerebral através de injecção arterial intracarotídeo de células cancerosas facilita estudos sobre os mecanismos da biologia da doença e avaliação de novos regimes de intervenção.
Abstract
Metástase, a propagação e crescimento de células malignas em locais secundários dentro do corpo do paciente, representa> 90% da mortalidade relacionada ao câncer. Recentemente, avanços impressionantes em novas terapias têm prolongado significativamente a sobrevivência e melhor qualidade de vida para muitos pacientes com câncer. Infelizmente, a incidência de cérebro recorrências metastáticas está a aumentar rapidamente, e todas as terapias atuais são apenas paliativos. Assim, bons modelos animais experimentais são urgentemente necessárias para facilitar os estudos em profundidade da biologia da doença e avaliar novos regimes terapêuticos para a avaliação pré-clínica. No entanto, o padrão no ensaio de metástases in vivo por via de injecção na veia da cauda de células cancerosas produz predominantemente lesões metastáticas do pulmão; animais costumam sucumbir à carga tumoral pulmonar antes de qualquer crescimento significativo de metástases cerebrais. Intracardíaca injecção de células tumorais produz lesões metastáticas para locais múltiplos órgãos, incluindo o cérebro; No entanto, o variabidade do crescimento do tumor produzidos com este modelo é grande, amortecendo a sua utilidade na avaliação de eficácia terapêutica. Para gerar modelos animais fiáveis e consistentes para o estudo metástase cerebral, aqui descrevemos um procedimento para produzir metástase cerebral experimental na casa do rato (Mus musculus) através de injecção intracarotídeo de células tumorais. Esta abordagem permite que se produzem grande número de ratos metástase de sustentação do cérebro com características de crescimento e mortalidade semelhantes, facilitando assim os esforços de investigação para estudar mecanismos biológicos básicos e avaliar novos agentes terapêuticos.
Introduction
A metástase do cancro para o sistema nervoso central (SNC) é uma doença devastadora, e pode envolver o parênquima cerebral ou as leptomeninges ( "metástase cerebral" refere-se tanto neste artigo). É o tumor maligno intracraniana predominante, ultrapassando gliomas primários por> 10: 1 1, 2. O câncer de pulmão, câncer de mama e melanoma são as principais três principais doenças neoplásicas que produzem alta incidência de metástases cerebrais 3, 4. Nos últimos anos, avanços impressionantes em novas terapias contra o câncer ter prolongado drasticamente a sobrevivência ea melhoria da qualidade de vida de muitos pacientes com câncer. No entanto, após recorrência, a incidência de metástase cerebral está a aumentar rapidamente. Por exemplo, o trastuzumab anticorpo anti-HER2 (Herceptin) demonstrou eficácia clínica significativa em pacientes com cancro da mama HER2 +; ainda uma tendência preocupante surgiunestes doentes: até 1/3 daqueles cuja doença sistêmica extracraniana inicialmente beneficiou de tratamento trastuzumab mais tarde desenvolver metástases cerebrais 5, 6, 7. Infelizmente, os pacientes com metástases cerebrais são refratários a quase todos os tratamentos atuais, geralmente experimentando uma deterioração traumática da qualidade de vida, e sua sobrevivência de um ano após o diagnóstico é apenas ~ 20% 8. As terapias atuais para metástases cerebrais (incluindo esteróides, radioterapia craniana e ressecção cirúrgica em pacientes selecionados) são meramente paliativas, não curativa 9. Portanto, metástase cerebral está a emergir como o próximo desafio imponente nesta era de novas terapias contra o câncer. Para enfrentar o desafio não satisfeitas pacientes enfrentam todos os dias na clínica, precisamos urgentemente para entender melhor o mecanismo subjacente de metástase cerebral e usar esse conhecimento para desenvolver novas terapias.
Aqui nós descrevemos os procedimentos para produzir metástase cerebral experimental através da injeção de células cancerígenas na artéria carótida comum. Nós temos usado essa abordagem para dissecar as contribuições dos genes individuais para a cascata metastática de metástases cerebrais e para avaliar a eficácia da intervenção terapêuticas 12, 13. As principais vantagens desta abordagem são o elevado grau de reprodutibilidade e de baixo grau de variabilidade; A maior desvantagem é a sofisticação e habilidade necessário para executar a microcirurgia.
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Protocol
declaração de ética: Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Prepare células cancerosas para Injection
- Semear as células cancerosas um ou dois dias antes da injecção. Use meio DMEM / F12 suplementado com 10% FBS, a menos que uma forma especializada é indicada na literatura para uma linha de células particular.
- No dia da intervenção cirúrgica, as células da colheita quando atingem 70-80% de confluência, em primeiro lugar a lavagem com meio isento de soro, uma vez antes de tripsinização (0,25%) de 1 - 2 minutos a 37 ° C. Adicionar em células 10% FBS contendo DMEM media / F12 para saciar a tripsina 0,25%.
- Centrifugar as células a 80 x g durante 3 min. Lave as células em meio isento de soro duas vezes para remover o soro residual, a contagem das células com um hemocitómetro e re-suspender em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) a 1 - 5 x 10 6 células / ml, dependendo da linha celular. Manter em geloaté ao momento da injecção.
NOTA: MDA-MB-231 de cancro da mama e células de melanoma K1735 foram utilizados neste estudo, e ambas as linhas de células foram usadas em 2 × 10 6 células / ml de concentração. Manter a duração tripsinização tão curto quanto possível, como sobretratamento pode influenciar os resultados de ensaios de metástase.
2. Prepare Mice para Tumor injeção de células
- Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal (ip) de cetamina / xilazina cocktail (cetamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
- Confirmar anestesia completa por beliscar os pés animais e observar falta de resposta.
- Posicione o mouse sobre uma placa de vidro (usado para a fundição de géis de proteína), e prenda com elásticos.
- Se necessário, remover os pêlos do pescoço raspando ou aplicar uma pequena quantidade de produto de depilação e limpando o cabelo fora com toalha de papel. NOTA: Se estiver usando ratinhos nus, ignore este passo como eles não têm pêlos do corpo.
- Limpe a pele do pescoço, aplicandoiodopovidona e álcool a 70%.
- Coloque o mouse no palco do microscópio de dissecação
- Realizar uma incisão na pele ~ 1 cm de comprimento com um bisturi cirúrgico.
- Bluntly dissecar o músculo com pinças dentadas para expor a artéria carótida por baixo.
- Separar a artéria carótida do nervo vago adjacente com pinça cirúrgica.
- Utilizando uma pinça cirúrgica, separe um pouco de algodão de uma bola de algodão, umedeça e moda em uma bola de algodão menor. Coloque esta bola de algodão hidratada-buffer debaixo da artéria carótida do local pretendido da injeção.
- Coloque um distal sutura e proximal à bola de algodão e fazer nós soltos. Apertar o nó proximal para bloquear o fluxo sanguíneo para o local de injecção.
- Prossiga para a injeção de células de câncer se a artéria carótida na bola de algodão parece totalmente pressurizada com sangue vermelha fresca.
Injeção celular 3. Cancer em Carótida
- Vortex e desenhar 100 ul océlulas cancerosas f para a seringa.
- Sob o microscópio de dissecação, lentamente inserir a agulha 31 G (com bisel para cima) para dentro do lúmen da artéria carótida senta-se sobre a bola de algodão.
- Lentamente injectar as células a partir da seringa para dentro da artéria carótida. injecção bem sucedida pode ser observada sob o microscópio através da mudança de cor dos vasos sanguíneos mais próximos e musculatura quando células cancerosas tamponadas são empurrados para a circulação.
- Quando a injecção de todo o volume é completa, levantar a artéria carótida distai suavemente para evitar a regurgitação.
- Rapidamente apertar o nó distal para completar o processo de injecção.
- Depois de completar a injecção, aperte as ligaduras e aparar o excesso de fio de seda com micro-tesoura sob o microscópio de dissecação. Mover para trás o músculo separadas para cobrir o local da ferida. Feche a pele com dois grampos.
4. A recuperação cirúrgica
- Mova o animal operado em uma almofada de aquecimentopara recuperar. Pode demorar 30 - 60 min para os animais a recuperar a consciência. No entanto, administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) via injecção subcutânea como analgesia pós-cirúrgica. Nota: Analgesia devem ser fornecidos de acordo com o seu IACUC local aprovou o protocolo.
- Uma vez que os animais despertar e retomar o seu comportamento normal, retornar os ratos para o seu local de moradia. Fornecer os ratos com comida gel durante vários dias pós-cirurgia. Mantenha um registro cirúrgico e mantê-lo no quarto.
5. Non-invasive In vivo de imagens
- Para as células marcadas com construções repórter de luciferase, medir a eficiência da injecção de células de cancro utilizando em sistema de imagem in vivo 14.
NOTA: A imagiologia não é realizada no dia da injecção para evitar tensões excessivas para animais de pesquisa.
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Representative Results
Existem dois pontos em que a qualidade da injecção podem ser avaliadas. A primeira chance é pela observação do operador de mudar as cores dos vasos sanguíneos durante a injeção. Vazamento de injeções pobres pode ser facilmente observado sob o microscópio de dissecação. A colocação firme e segura do corpo do ratinho (Figura 1A) e da sua artéria carótida (Figura 1B) sobre a bola de algodão de suporte são factores críticos para injecção suave e bem sucedida na artéria carótida. O segundo ponto para avaliar a qualidade de injeção é pós-cirúrgica de imagem não-invasiva. Para este fim, as células cancerosas são tipicamente marcado com um repórter de luciferase ex vivo, antes da injecção. Para minimizar a tensão sobre os animais, in vivo de imagens é usualmente executada 24 horas após a injecção. Um sucesso resultados de injeção de carga célula cancerosa intracraniana forte, ea cabeça de rato é a única região com s positivosignals (Figura 2A).
Usando no sistema de imagem in vivo para rastrear as células cancerosas marcado com luciferase, observa-se um declínio inicial da intensidade do sinal dentro de dias após a injecção; Ainda, as células cancerosas com capacidade de crescimento no SNC, eventualmente conseguem produzir dividir e aumentando em sinais de sistema de imagem in vivo como desenvolver metástases cerebrais (Figura 2B). Intracarotídeo injeção produz geralmente consistente em sinais do sistema de imagem in vivo com relativamente baixa variabilidade, que é uma grande vantagem de usar essa abordagem para produzir metástase cerebral experimental. Como crescentes lesões tumorais deslocam tecidos cerebrais, a qualidade da saúde para os animais com rápida progressão metástase cerebral pode se deteriorar rapidamente, refletindo a manifestação clínica de pacientes com metástase cerebral humanos. comportamentos sintomáticos típicos indicativos da presença significativa de metástases cerebrais incluem perda dede peso, postura curvada, e circulando incessante. No ponto final experimental, os cérebros dos animais pode ser extraído para análise de parâmetros bioquímicos ou para exames histológicos. Excepto para lesões de metástase melanóticos (Figura 3A), é normalmente difícil distinguir a lesão tumoral circundante de tecidos cerebrais anteriores para avaliação histológica (Figura 3B). Em tais casos, é aconselhável para marcar células de tumor com um repórter fluorescente (por exemplo, GFP) para a conveniência de isolamento de células metastáticas (Figura 3C). Em alternativa, todo o cérebro pode ser dissociado em células individuais e as células tumorais separadas por anticorpos grânulo conjugado magnéticos.
Figura 1: Preparação para injecção artéria carótida. A) O rato anestesiado é colocado sobre uma placa de vidro e protegido com RUbandas bber. A localização e o comprimento da incisão é marcado com uma linha preta no pescoço. B) Após todos os passos cirúrgicos preparatórias estão completos, a artéria carótida exposta é colocado para suporte em uma bola de algodão firme, pronto para a injeção de células cancerígenas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: monitoramento não-invasivo para excrescência metástase cerebral. A) MDA-MB-231 de cancro da mama de modificação células foram marcadas com o gene repórter da luciferase ex vivo. Começando a partir da injecção da artéria 24 h pós-carótida, o desenvolvimento de metástase cerebral foi monitorizada de forma não invasiva por repetidas em imagiologia de sistema de imagem in vivo (barra de escala = 50 mm). B) Quantificação de in vivo sistema de imagem imaging dados indicam um declínio inicial da injeção da artéria carótida pós-carga tumoral, seguido por conseqüência exponencial de metástase cerebral até moribundos animal. As barras de erro refletem o erro padrão da média (SEM) do sinal total de luminescência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Colheita metástases cerebrais lesões. A) As células de melanoma K1735 produzir lesões metástases cerebrais melanóticos no cérebro do rato C3H singénicos, o que facilita muito a separação do cérebro lesões metastáticas do estroma circundante, mas está limitada a certos modelos de melanoma. B) dissociadas células tumorais mamárias do rato -null MMTV- Neu / Pten transgênica produz cerebral manifesta metástase afTer implantação através de injecção artéria carótida. A margem do tumor / estroma é difícil de distinguir, apesar da presença de lesões metastáticas óbvio angiogénicos. C) MDA-MB-231 de cancro da mama foram pré-marcadas com uma proteína fluorescente GFP) repórter verde (ex vivo para facilitar a extracção de lesões de metástase cerebral através de ressecção cirúrgica ou separação de células. Note-se que a maioria das lesões metastáticas são concentrados no mesmo lado do cérebro em que a injecção arterial da carótida ocorre. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os passos mais críticos para injecção arterial da carótida bem sucedida de células de cancro são: 1) anestesia profunda de rato, em preparação para a operação cirúrgica; 2) colocação constante de artéria carótida em cima do suporte de algodão; 3) a ligação apertada da artéria carótida após a injecção bem sucedida.
anestesia profunda de ~ 30 min é normalmente necessário para o desempenho cirúrgico estável sob o microscópio de dissecação. Usamos cocktail de cetamina / xilazina comercialmente ready-to-use para anestesia mouse. Para evitar a possibilidade de sobredosagem, o cocktail de cetamina / xilazina podem ser diluídas 1: 1 ou 1: 2 em solução salina fisiológica para fornecer uma maior flexibilidade em ajustar o volume utilizado para a anestesia. Em alternativa, não-controlada tribromoetanol medicamento possa também ser usada como anestésico; No entanto, verificou-se que a propensão de tribromoetanol a degradar-se faz com que a substância menos fiável como um anestésico eficaz do que o cocktail de cetamina / xilazina.
UMAde forma constante e totalmente colocada artéria carótida pressurizado facilita muito a injecção de células cancerosas; Portanto, é altamente recomendável gastar tempo para preparar cuidadosamente a posição da artéria sob o microscópio, em vez de prosseguir com injecção sob condições menos favoráveis.
Mais células cancerosas vai alojar no interior da vasculatura do lado de injecção arterial da carótida. Por vezes uma porção significativa das células metastáticas podem migrar para o outro lado do cérebro, de forma que ambos os hemisférios parecem suportar quantidade significativa de lesões metastáticas em animais moribundos.
As lesões metastáticas podem aparecer quer no parênquima ou leptomeninges do SNC, ou em ambos os locais. Parece haver interações únicas tumorais microambiente que fundamentam esses fenótipos biológicos 15. Portanto, quando uma nova linha celular é para ser testado para a sua capacidade para produzir metástases cerebrais experimentais, é necessary prestar atenção especial a esses fenótipos.
As artérias carótidas interna e externa fornecem sangue para o parênquima cerebral e leptomeninges, respectivamente. Deste modo, a deposição de células do tumor para dentro do parênquima ou leptomeninges pode ser conseguida por modificação ligeira do presente protocolo. Para permitir que apenas as células em leptomeninges, a artéria carótida interna pode ser ligado por um fio de sutura antes da injecção de células tumorais, orientando deste modo as células para dentro da artéria carótida externa; Por outro lado, a ligação da carótida externa antes da injecção permitirá a entrada apenas as células dentro da artéria carótida interna e o parênquima cerebral.
No geral, a abordagem de injeção intracarotídeo produz dados de maior reprodutibilidade e variabilidade menor em comparação com veia ou intracardíaca injeções de cauda; Também evita induzida por injecção de inflamação do SNC em comparação com o método de injecção directa intracerebral. Assim, esta abordagem é actualmente o maisvaliosa em estudos quantitativos de metástase cerebral que visam gerar conclusões estatisticamente significativas utilizando um número limitado de animais. Ao mesmo tempo, todos os modelos experimentais têm limitações. Semelhante a outros métodos de introdução de células de tumor hemática, a injecção única intracarotídeo recapitula passos posteriores na cascata de metástases após a disseminação de células de cancro para a circulação. Assim, não é um modelo adequado para estudar, por exemplo, os fatores biológicos que determinam a disseminação de células cancerosas primárias na corrente sanguínea.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | to make skin incisions |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | to bluntly dissect mucles |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | to separate and prepare the carotid artery for injection |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | to cut sutures |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | for wound cloure |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | for cell injection |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
References
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