Summary
metástasis cerebral se ha convertido en una necesidad médica insatisfecha urgente, ya que su incidencia ha aumentado mientras que las opciones terapéuticas se han mantenido paliativos. La creación de modelos animales experimentales de metástasis en el cerebro a través de la inyección arterial intracarotídea de las células cancerosas facilita estudios sobre el mecanismo de la biología de la enfermedad y la evaluación de nuevos regímenes de intervención.
Abstract
La metástasis, la propagación y el crecimiento de las células malignas en los sitios secundarios dentro del cuerpo de un paciente, da cuenta de> 90% de la mortalidad relacionada con el cáncer. Recientemente, impresionantes avances en las terapias innovadoras han prolongado drásticamente la supervivencia y mejorar la calidad de vida de muchos pacientes con cáncer. Por desgracia, la incidencia de recidivas cerebrales metastásicos está aumentando rápidamente, y todas las terapias actuales no son más que paliativos. Por lo tanto, se necesitan urgentemente buenos modelos animales experimentales para facilitar los estudios a fondo de la biología de la enfermedad y para evaluar nuevos regímenes terapéuticos para la evaluación preclínica. Sin embargo, el estándar en el ensayo de metástasis in vivo a través de inyección en la vena caudal de las células cancerosas produce predominantemente lesiones metastásicas de pulmón; animales suelen sucumbir a la carga tumoral de pulmón antes de cualquier consecuencia significativa de la metástasis cerebral. inyección intracardiaca de las células tumorales produce lesiones metastásicas a múltiples sitios de órganos, incluido el cerebro; sin embargo, el variabilidad del crecimiento del tumor producido con este modelo es grande, humedeciendo su utilidad en la evaluación de la eficacia terapéutica. Para generar modelos animales fiables y coherentes para el estudio de la metástasis cerebral, aquí se describe un procedimiento para la producción de metástasis cerebral experimental en el ratón doméstico (Mus musculus) a través de la inyección intracarotídea de las células tumorales. Este enfoque permite producir gran número de ratones portadores de metástasis cerebrales con características de crecimiento y mortalidad similares, facilitando de este modo los esfuerzos de investigación para estudiar los mecanismos biológicos básicos y para evaluar nuevos agentes terapéuticos.
Introduction
La metástasis del cáncer en el sistema nervioso central (SNC) es una enfermedad devastadora, y puede implicar el parénquima cerebral o las leptomeninges ( "metástasis cerebral" se refiere tanto en este artículo). Es la neoplasia intracraneal predominante, superando en número a los gliomas primarios por> 10: 1 1, 2. El cáncer de pulmón, cáncer de mama y el melanoma son las tres principales enfermedades neoplásicas principales que producen una alta incidencia de metástasis cerebral 3, 4. En los últimos años, impresionantes avances en nuevas terapias contra el cáncer han prolongado drásticamente la supervivencia y mejorar la calidad de vida de muchos pacientes con cáncer. Sin embargo, tras la recurrencia, la incidencia de metástasis cerebral está aumentando rápidamente. Por ejemplo, el trastuzumab anticuerpo anti-HER2 (Herceptin) ha demostrado eficacia clínica significativa en pacientes con cáncer de mama HER2 +; sin embargo, una tendencia preocupante ha surgidoen estos pacientes: hasta 1/3 de aquellos cuya enfermedad sistémica extracraneal inicialmente beneficiado del tratamiento con trastuzumab más adelante desarrollar metástasis cerebral 5, 6, 7. Por desgracia, los pacientes con metástasis cerebrales son refractarios a casi todos los tratamientos actuales, por lo general experimentan un deterioro traumática de la calidad de vida y su supervivencia a un año después del diagnóstico es sólo aproximadamente el 20% 8. Las terapias actuales para la metástasis cerebral (incluyendo esteroides, la radioterapia craneal, y la resección quirúrgica en pacientes seleccionados) no son más que paliativos, no curativa 9. Por lo tanto, la metástasis cerebral se perfila como el próximo reto imponente en esta era de nuevas terapias contra el cáncer. Para hacer frente al reto pendiente pacientes se enfrentan todos los días en la clínica, es urgente comprender mejor el mecanismo subyacente de la metástasis cerebral y utilizar este conocimiento para desarrollar nuevas terapias.
Aquí se describen los procedimientos para producir metástasis cerebral experimental a través de la inyección de las células cancerosas en la arteria carótida común. Hemos utilizado este enfoque para diseccionar las contribuciones individuales de los genes a la cascada metastásica de metástasis cerebral y para evaluar la eficacia de la intervención terapéuticas 12, 13. Las principales ventajas de este enfoque son el alto grado de reproducibilidad y bajo grado de variabilidad; La principal desventaja es la sofisticación y la destreza necesaria para realizar la microcirugía.
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Protocol
declaración de la ética: Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Preparar las células del cáncer de Inyección
- Sembrar las células de cáncer de uno o dos días antes de la inyección. Utilice DMEM / F12 suplementado con 10% de FBS, a menos que un medio de especialidad se indica en la literatura para una línea celular particular.
- En el día de la operación quirúrgica, las células de la cosecha cuando alcanzan 70-80% de confluencia por primera lavado con medio libre de suero una vez antes de la tripsinización (0,25%) para 1 - 2 min a 37 ° C. Añadir a las células 10% de FBS que contiene medio DMEM / F12 para apagar la tripsina 0,25%.
- Centrifugar las células a 80 × g durante 3 min. Lavar las células en medio libre de suero dos veces para eliminar el suero residual, contar las células con un hemocitómetro y volver a suspender en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 1 - 5 x 10 6 células / ml, dependiendo de la línea celular. Mantener en hielohasta el momento de la inyección.
Se han usado MDA-MB-231 células de cáncer de mama y células de melanoma K1735 en este estudio, y se utilizaron dos líneas celulares a 2 x 10 6 células / ml de concentración: NOTA. Mantenga la duración tripsinización lo más corto posible como tratamiento excesivo puede influir en los resultados de ensayos de metástasis.
2. Preparar ratones por inyección de células tumorales
- Anestesiar los ratones por vía intraperitoneal (ip) de inyección de ketamina / xilazina cóctel (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
- Confirmar la anestesia completa pellizcando los pies de los animales y observar la falta de respuesta.
- Coloque el ratón sobre una placa de vidrio (utilizado para la fundición de geles de proteínas), y asegurar con bandas de goma.
- Si es necesario, quitar el pelo de cuello por el afeitado o la aplicación de una pequeña cantidad de producto de depilación y secándose el cabello con una toalla de papel. NOTA: Si está utilizando ratones desnudos, omitir este paso, ya que no tienen vello corporal.
- Limpiar la piel del cuello mediante la aplicación depovidona yodada y 70% de alcohol.
- Coloque el ratón en el escenario del microscopio de disección
- Hacer una incisión en la piel ~ 1 cm de largo con un bisturí quirúrgico.
- Sin rodeos diseccionar el músculo con unas pinzas dentadas para exponer la arteria carótida debajo.
- Se separa la arteria carótida del nervio vago junto con unas pinzas quirúrgicas.
- El uso de pinzas quirúrgicas, separar un poco de algodón de una bola de algodón, humedecer, y la moda en una bola de algodón más pequeño. Coloque esta bola de algodón tampón-humectada por debajo de la arteria carótida del lugar previsto de la inyección.
- Colocar una sutura distal y proximal a la bola de algodón y hacer nudos sueltos. Apretar el nudo proximal para bloquear el flujo de sangre en el sitio de la inyección.
- Proceder a la inyección de células de cáncer si la arteria carótida en la bola de algodón aparece completamente presurizado con la sangre roja fresca.
3. Inyección de células cancerosas en la arteria carótida
- Vortex y dibujar o 100 lcélulas de cáncer de f en la jeringa.
- Bajo el microscopio de disección, introduzca lentamente la aguja 31 G (con bisel hacia arriba) en el lumen de la arteria carótida se sienta encima de la bola de algodón.
- Lentamente inyectar las células de la jeringa en la arteria carótida. inyección con éxito se puede observar en el microscopio por el cambio de color de los vasos sanguíneos cercanos y la musculatura cuando las células cancerosas tamponadas son empujados en la circulación.
- Cuando la inyección de todo el volumen se completa, levante la arteria carótida distal suavemente para evitar la regurgitación.
- apretar rápidamente el nudo distal para completar el proceso de inyección.
- Después de completar la inyección, apretar las ligaduras y recortar el exceso de sutura de seda con micro-tijeras bajo el microscopio de disección. Mover hacia atrás el músculo separado para cubrir el sitio de la herida. Cierre la piel con dos grapas.
4. Recuperación Quirúrgica
- Mover el animal operado sobre una almohadilla térmicapara recuperar. Puede tomar 30 - 60 minutos para que los animales puedan recobrar el conocimiento. Mientras tanto, administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) por vía subcutánea, como analgesia posquirúrgica. Nota: La analgesia debe ser proporcionada de acuerdo a su IACUC local aprobó el protocolo.
- Una vez que los animales se despiertan y reanudar su comportamiento normal, volver a los ratones a su ubicación de la vivienda. Proporcionar los ratones con comida en gel durante varios días después de la cirugía. Mantener un registro quirúrgico y mantenerlo en la habitación.
5. No invasivo imágenes in vivo
- Para las células marcadas con construcciones de reportero de luciferasa, medir la eficiencia de la inyección de células de cáncer usando el sistema de imágenes in vivo 14 en.
NOTA: Imaging no se realiza en el día de la inyección para evitar el estrés excesivo a los animales de investigación.
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Representative Results
Hay dos puntos en los que la calidad de la inyección se puede evaluar. La primera oportunidad es mediante la observación del operador de cambiar los colores de los vasos sanguíneos durante la inyección. Las fugas de inyecciones pobres puede observarse fácilmente bajo el microscopio de disección. La colocación estable y segura del cuerpo del ratón (Figura 1A) y su arteria carótida (Figura 1B) en la bola de algodón de soporte son factores críticos para la inyección suave y exitosa en la arteria carótida. El segundo punto a evaluar la calidad de la inyección es post-quirúrgica de imagen no invasiva. Para este propósito, las células cancerosas son típicamente marcados con un indicador de luciferasa ex vivo antes de la inyección. Para minimizar el estrés en los animales, imágenes in vivo se realiza generalmente 24 horas después de la inyección. A exitosos resultados de inyección en una fuerte carga de células de cáncer intracraneal, y la cabeza del ratón es la única región con s positivosignals (Figura 2A).
Utilizando el sistema de imágenes in vivo para rastrear las células de cáncer de luciferasa marcado, se observa una disminución inicial de la intensidad de la señal en cuestión de días después de la inyección; sin embargo, las células cancerosas capaces de excrecencia en el SNC con el tiempo logran dividirse y producir el aumento en las señales del sistema de formación de imágenes in vivo como se desarrollan metástasis cerebrales (Figura 2B). Inyección intracarotídea produce generalmente consistente en señales del sistema de formación de imágenes in vivo con relativamente baja variabilidad, que es una ventaja importante de usar este enfoque para producir metástasis cerebral experimental. A medida que las lesiones tumorales en crecimiento desplazan a los tejidos del cerebro, la calidad de la salud de los animales con que progresa rápidamente metástasis cerebral puede deteriorarse rápidamente, lo que refleja la manifestación clínica de los pacientes con metástasis cerebrales humanos. comportamientos sintomáticos típicos indicativos de la presencia significativa de metástasis cerebral incluyen la pérdida depeso, postura encorvada, y dando vueltas incesantes. En el punto final experimental, los cerebros de los animales pueden ser extraídos para el examen de los parámetros bioquímicos o para los exámenes histológicos. Excepto para las lesiones de metástasis melanotic (Figura 3A), por lo general es difícil distinguir la lesión tumoral de los tejidos circundantes del cerebro antes de la evaluación histológica (Figura 3B). En tales casos, se aconseja para etiquetar las células tumorales con un indicador fluorescente (por ejemplo, GFP) para la comodidad de aislamiento de las células metastásicas (Figura 3C). Alternativamente, todo el cerebro puede disociarse en células individuales y las células tumorales separadas por anticuerpos de talón conjugado magnéticos.
Figura 1: Preparación para la inyección de la arteria carótida. A) El ratón anestesiado se coloca sobre una placa de vidrio y se fija con rubber bandas. El sitio y la longitud de la incisión se marca con una línea de negro en el cuello. B) Después de todos los pasos quirúrgicos preparatorias están completos, la arteria carótida expuesta se coloca para el apoyo en una bola de algodón firme, lista para la inyección de las células cancerosas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Monitorización no invasiva para la excrecencia de la metástasis cerebral. A) modificados MDA-MB-231 células de cáncer de mama se marcaron con gen indicador de luciferasa ex vivo. A partir de la inyección de la arteria 24 horas después de la carótida, el desarrollo de metástasis cerebral se controló de forma no invasiva por formación de imágenes repetidas sistema de imágenes in vivo (barra de escala = 50 mm) en. B) Cuantificación de la formación de imágenes in vivo sistema imabio de datos indica una disminución inicial de la inyección de la arteria carótida después de la carga tumoral, seguido por consecuencia exponencial de la metástasis cerebral hasta moribundity animal. Las barras de error reflejan el error estándar de la media (SEM) de la señal total de luminiscencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La recolección metástasis cerebral lesiones. A) las células de melanoma K1735 producen lesiones metástasis cerebral melanotic en el cerebro del ratón C3H singénico, lo que facilita en gran medida la separación de las lesiones metastásicas del cerebro de la estroma circundante, pero se limita a determinados modelos de melanoma. B) Disociado células tumorales mamarias del ratón transgénico -null MMTV- Neu / PTEN produce la metástasis cerebral abierta afla implantación ter través de la inyección de la arteria carótida. El margen de tumor / estroma es difícil distinguir a pesar de la presencia evidente de lesiones metastásicas angiogénicos. C) MDA-MB-231 células de cáncer de mama fueron pre-marcadas con una proteína fluorescente reportero verde (GFP) ex vivo para facilitar la extracción de las lesiones metástasis cerebral a través de la resección quirúrgica o la clasificación de células. Tenga en cuenta que la mayoría de las lesiones metastásicas se concentran en el mismo lado del cerebro donde la inyección arterial de la carótida tiene lugar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos más críticos para la inyección arterial de la carótida con éxito de células de cáncer son: 1) la anestesia profunda de ratón en la preparación para la operación quirúrgica; 2) la colocación estable de la arteria carótida en la parte superior del soporte de algodón; 3) apretada la ligadura de la arteria carótida después de la inyección con éxito.
anestesia profunda de ~ 30 minutos suele ser necesario para un rendimiento constante quirúrgica bajo el microscopio de disección. Utilizamos cóctel de ketamina / xilazina comercialmente listos para el uso para la anestesia ratón. Para evitar la sobredosis potencial, el cóctel de ketamina / xilazina se puede diluir 1: 1 o 1: 2 en solución salina fisiológica para proporcionar más flexibilidad en el ajuste del volumen utilizado para la anestesia. Alternativamente, no controlado tribromoetanol medicamento también puede ser usado como anestésico; sin embargo, hemos encontrado que la propensión de tribromoetanol a degradarse hace que la sustancia menos fiable como un anestésico eficaz que el cóctel de ketamina / xilazina.
UNde manera constante coloca y totalmente la arteria carótida a presión facilita en gran medida de la inyección de las células cancerosas; Por lo tanto, es muy recomendable pasar el tiempo para preparar cuidadosamente la posición de la arteria bajo el microscopio en vez de proceder con la inyección en condiciones subóptimas.
Más células cancerosas se alojarán dentro de la vasculatura en el lado de la inyección arterial de la carótida. A veces, una parte significativa de las células metastásicas puede migrar al otro lado del cerebro de modo que ambos hemisferios parecen soportar cantidad significativa de las lesiones metastásicas en animales moribundos.
Las lesiones metastásicas pueden aparecer ya sea en el parénquima o las leptomeninges del SNC, o en ambas ubicaciones. Parece que hay interacciones únicas con el tumor microambiente que subyacen a estos fenotipos biológicos 15. Por lo tanto, cuando una nueva línea celular se va a probar por su capacidad de producir metástasis cerebral experimental, es neceary prestar especial atención a estos fenotipos.
Las arterias carótidas internas y externas de suministro de sangre en el parénquima cerebral y leptomeninges, respectivamente. Por consiguiente, la deposición de las células tumorales en el parénquima o leptomeninges puede lograrse mediante una ligera modificación de este protocolo. Para permitir que las células solamente en leptomeninges, la arteria carótida interna puede ligarse por una sutura antes de la inyección de las células tumorales, dirigiendo de ese modo las células en la arteria carótida externa; Por otra parte, la ligadura de la carótida externa antes de la inyección permitirá células entrada sólo en la arteria carótida interna y el parénquima cerebral.
En general, el enfoque de inyección intracarotídea produce datos de más alta reproducibilidad y una menor variabilidad en comparación con las venas o intracardiaca inyecciones de cola; también evita inducida por inyección de inflamación del SNC en comparación con el método de inyección intracerebral directa. Por lo tanto, este enfoque es actualmente el másútil en estudios cuantitativos de la metástasis cerebral que tienen como objetivo generar conclusiones estadísticas significativas utilizando un número limitado de animales. Al mismo tiempo, todos los modelos experimentales tienen limitaciones. De manera similar a otros métodos de introducción de las células tumorales hematógena, la inyección intracarotídea solamente recapitula pasos posteriores en la cascada de la metástasis después de la difusión de células cancerosas en la circulación. Así, no es un modelo apropiado para estudiar, por ejemplo, los factores biológicos que determinan la diseminación de células de cáncer primario en el torrente sanguíneo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | to make skin incisions |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | to bluntly dissect mucles |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | to separate and prepare the carotid artery for injection |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | to cut sutures |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | for wound cloure |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | for cell injection |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
References
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