Summary
치료 옵션을 완화 남아있는 동안 그 빈도는 증가로 뇌 전이는 긴급 충족되지 않은 의료 요구되고있다. 암 세포의 intracarotid 동맥 주입을 통해 뇌 전이의 실험 동물 모델을 만들기 소설 개입 요법의 질병 생물학 및 평가의 기계론의 연구를 용이하게한다.
Abstract
전이, 환자의 신체 내에서 보조 사이트의 확산과 악성 세포의 성장, 암 관련 사망의> 90 %를 차지한다. 최근, 새로운 치료의 인상적인 발전은 극적으로 많은 암 환자의 생존과 삶의 품질 향상을 연장했다. 슬프게도, 뇌 전이 재발의 빈도는 빠르게 상승하고, 현재의 모든 치료는 단지 완화 있습니다. 따라서, 좋은 실험 동물 모델이 긴급하게 질병 생물학에 대한 심층 연구를 촉진하고 전임상 평가를위한 새로운 치료 요법을 평가하기 위해 필요하다. 그러나 암세포의 꼬리 정맥 주사를 통하여 생체 전이 분석에서 표준은 주로 폐 전이성 병변을 생성한다; 동물은 일반적으로 뇌 전이의 의미를 가지 전에 폐 종양 부담에 굴복. 종양 세포의 주입 심내 뇌를 포함한 여러 기관 사이트 전이성 병변을 생성; 그러나 variabi이 모델로 제작 종양 성장의 lity는 치료 효과를 평가하는 자사의 유틸리티를 완충, 큽니다. 뇌 전이의 연구를위한 안정적이고 일관성있는 동물 모델을 생성하려면, 여기에 우리가 종양 세포의 intracarotid 주입을 통해 집 마우스 (뮤스의 musculus)에서 실험적인 뇌 전이를 생성하는 절차를 설명합니다. 이러한 접근 방식은 기본 따라서 생물학적 메커니즘을 연구 및 신규 한 치료제를 평가하는 연구 노력이 용이 한 유사 성장과 사망률 특성 뇌 전이 - 함유 마우스의 다수를 생성 할 수있다.
Introduction
중추 신경계 (CNS)에 암의 전이는 파괴적인 질환, 뇌 실질 또는 ( "뇌 전이는"이 문서에 모두를 의미)를 leptomeninges를 포함 할 수있다. 1 일, 2 : 그것은> 10 차 신경 교종을 상회, 주된 두개 내 악성 종양이다. 폐암, 유방암, 흑색 종 및 뇌 전이 3,4- 높은 빈도를 생성하는 세 가지 주요 종양 질환이다. 최근, 새로운 암 치료의 인상적인 발전이 크게 많은 암 환자의 생존 및 삶의 질 개선을 연장하고있다. 그러나, 재발시 뇌 전이의 빈도가 빠르게 증가하고있다. 예를 들어, 항 HER2 항체 트라 스투 주맵 (헤르 셉틴)은 HER2 + 유방암 환자에서 심각한 임상 적 효능을 보여 주었다; 아직 불안 추세가 등장했습니다이러한 환자 : 그 두개 외 전신 질환 초기에 나중에 뇌 전이 5, 6, 7을 개발 트라 스투 주맙 치료 혜택을 사람들의 1/3까지. 슬프게도, 뇌 전이 환자는 일반적으로 삶의 질 외상 저하를 경험하고, 거의 모든 현재의 치료에 불응하고, 진단 후 자신의 일 년 생존율은 ~ 20 % 8입니다. 현재 (스테로이드, 두개골 방사선 치료, 선택된 환자에서 수술 적 절제 포함) 뇌 전이에 대한 치료입니다 단지 9 치료하지 완화. 따라서, 뇌 전이는 새로운 암 치료의 시대에서 다음 당당한 도전으로 부상하고있다. 환자가 병원에 매일 직면 충족 문제를 해결하기 위해, 우리는 긴급하게 더 나은 뇌 전이의 기본 메커니즘을 이해하고 새로운 치료법을 개발하기 위해이 지식을 사용해야합니다.
여기서 우리는 경동맥에 암세포를 주입 실험을 통해 뇌 전이를 생성하는 절차를 설명한다. 우리는 뇌 전이의 전이성 캐스케이드 개별 유전자 '기여를 해부하고 치료 개입의 효과를 평가하기 위해이 방법을 사용했다S (12, 13). 이 방법의 주요 이점은 재현성 및 변동의 낮은 정도의 높은 수준이다; 주요 단점은 미세 수술을 수행하기 위해 필요한 정교함 손재주이다.
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Protocol
윤리 문 : 모든 동물 연구는 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 사출에 대한 암 세포를 준비
- 주입 이전에 암 세포를 하루나 이틀 종자. 전문 매체가 특정 세포주에 대한 문헌에 표시되지 않는 한, 10 % FBS로 보충 된 DMEM / F12 미디어를 사용합니다.
- 37 ℃에서 2 분 - 1 트립신 (0.25 %) 이전에 한번 혈청이없는 배지로 세척하여 처음 80 % 합류 - 수술 당일 수확 세포들은 70에 도달 할 때. DMEM / F12 배지를 FBS 함유 10 %는 0.25 % 트립신을 종결 세포에 추가한다.
- 3 분 동안 80 × g에서 원심 분리하여 세포. 세포주에 따라, 5 × 106 세포 / ml - 잔류 혈청을 제거 혈구와 세포를 세어 1 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)에 재현 탁 두번 무 혈청 배지에서 세포를 세척 하였다. 얼음에 보관주입 때까지.
주 : MDA-MB-231 유방암 세포 K1735 흑색 종 세포는이 연구에 사용되었고, 두 세포주 / ml의 농도를 2 × 106 세포로 사용 하였다. 전이 분석의 결과에 영향을 미칠 수 overtreatment 최대한 짧게 트립신 처리 시간을 유지한다.
2. 종양 세포 주입을 위해 마우스를 준비합니다
- 복강 내 (IP)에 의해 마우스 케타민의 주입 / 자일 라진 칵테일 (케타민 100 ㎎ / ㎏, 자일 라진 10 ㎎ / ㎏)를 마취.
- 동물의 발을 곤란하게하여 완전한 마취를 확인하고 응답의 부족을 관찰합니다.
- (단백질 젤 주조에 사용) 유리 접시에 마우스를 놓고 고무 밴드로 고정합니다.
- 필요한 경우, 면도 또는 털 제거 제품을 소량 도포하고 종이 타월로 머리를 닦아 목 모발 제거. 참고 : 누드 마우스를 사용하는 경우가 체모를 가지고 있지 않는 한,이 단계를 건너 뜁니다.
- 적용하여 목 피부를 청소포비돈 요오드 및 70 % 알콜.
- 해부 현미경의 무대에 마우스를 놓습니다
- 긴 수술 메스로 피부 ~ 1cm의 절개를합니다.
- 퉁명스럽게 아래에있는 경동맥을 노출 이빨 집게로 근육을 해부하다.
- 수술 집게와 인접 미주 신경에서 경동맥을 분리합니다.
- 수술 집게를 사용하여 작은 목화 공에, 목화 공에서 어떤면을 분리 축축하고, 패션. 주사 원하는 사이트의 경동맥 아래에이 버퍼 수분 목화 공을 놓습니다.
- 코튼 볼에 봉합 원위부 및 근위부를 놓고 느슨한 매듭을합니다. 주사 부위에 혈류를 차단하는 근위 매듭을 조인다.
- 면화 공 경동맥 신선한 붉은 피와 완벽하게 가압 나타나는 경우 암 세포 주입을 진행합니다.
경동맥에 3. 암 세포 주입
- 소용돌이와 100 μL O를 그립니다주사기로 F 암세포.
- 해부 현미경, 천천히면 공의 꼭대기에 앉아 경동맥의 루멘에 (경사 최대) 31 G 바늘을 삽입합니다.
- 천천히 경동맥 내로 주사기로부터 세포를 주입. 버퍼 암 세포가 순환으로 가압 될 때 사출 성공적인 인근 혈관 근육의 색을 변경하여 현미경으로 관찰 할 수있다.
- 전체 볼륨의 주입이 완료되면, 역류 방지 부드럽게 원위 경동맥 리프트.
- 빠르게 주입 프로세스를 완료 원위 매듭을 조인다.
- 주입을 완료 한 후, 합자을 강화하고, 해부 현미경 하에서 미세 가위로 과잉 실크 봉합사 트림. 상처 부위를 덮도록 분리 근육 위로 이동한다. 두 스테이플 피부를 닫습니다.
4. 수술 복구
- 가열 패드로 조작 된 동물 이동복구. 동물이 의식을 회복하는 데 60 분 - 그것은 30 걸릴 수 있습니다. 한편, 수술 후 통증 등의 피하 주사를 통해 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다. 참고 : 진통은 해당 지역의 IACUC 프로토콜을 승인에 따라 제공되어야한다.
- 동물 각성과 정상적인 동작을 재개하면, 자신의 주택 위치에 마우스를 반환합니다. 며칠 후 수술 젤 음식 마우스를 제공합니다. 수술 기록을 유지하고 실내에 보관합니다.
생체 이미징 5. 비 침습적
- 루시퍼 라제 리포터 작 제물로 표지 세포, 생체 내 이미징 시스템 (14)에 사용하여 암세포 주입 효율을 측정한다.
주 : 이미징 연구 동물에게 과도한 스트레스를 방지하기 위해 주입 당일에 수행되지 않는다.
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Representative Results
분사의 품질이 평가 될 수있는 두 지점이있다. 첫 번째 가능성은 주입 중에 혈관 색을 변경하는 운전자의 관찰이다. 불량한 주사 누설 손쉽게 해부 현미경으로 관찰 할 수있다. 정상 및 보안 마우스 본체의 위치 (그림 1A)과지지면 공의 경동맥 (그림 1B)는 경동맥에 원활하고 성공적인 주입을위한 중요한 요소입니다. 주입 품질을 평가하기위한 두번째 포인트는 비 침습성 영상화 수술이다. 이를 위해, 암 세포는 일반적으로 주입 전에 루시페라아제 리포터 생체 표지된다. 일반적으로 24 시간 후 분사를 수행 생체 내 이미징의 동물에 스트레스를 최소화합니다. 강한 두개 암세포 부하 마우스 헤드 성공적인 주입 결과는 양성의 유일한 영역이다ignals (그림 2A).
루시퍼 라제 표지 된 암세포를 추적하는 생체 내 이미징 장치에 사용하여, 우리는 일 후 분사 내에 신호 강도의 초기 감소를 관찰; 아직 CNS에서 생장 할 수있는 암 세포는 결국 나누어 뇌전이 (도 2B)의 개발로 생체 내 이미징 시스템 신호 증가 생성하도록 관리한다. Intracarotid 주입은 일반적으로 실험 뇌 전이를 생성하는이 방법을 사용하는 주요 장점은 비교적 낮은 가변성과 생체 촬상 시스템 신호 일관 생산한다. 성장하는 종양 병변이 뇌 조직을 대체로서, 빠른 진행 뇌 전이와 동물을위한 건강의 질은 인간의 뇌 전이 환자의 임상 양상을 미러링, 빠른 속도로 악화 할 수 있습니다. 뇌 전이의 중요한 존재를 나타내는 전형적인 증상 행동의 손실을 포함무게, 웅크 자세, 끊임없는 선회. 실험 종료 시점에서, 동물의 뇌는 생화학 적 검사 또는 조직 학적 검사를 위해 추출 될 수있다. melanotic 전이 병소 (도 3a)을 제외하고는 조직 학적 평가 (도 3b)에 앞서 뇌 조직 주변에서 종양 병변을 구별하는 것이 곤란하다. 이러한 경우에서, 전이성 세포 (도 3c)을 분리하는 형편 형광 리포터 (예 : GFP) 종양 세포에 라벨을 의뢰한다. 대안 적으로, 전체 뇌 자기 비드 복합 항체에 의해 분리 된 단일 세포 및 종양 세포에 해리 할 수있다.
그림 1 : 경동맥 동맥 주입을위한 준비. A) 마취 된 마우스 유리판에 놓고 RU로 확보bber 밴드. 이 사이트와 절개의 길이는 목에 검은 선으로 표시됩니다. 모든 준비 수술 단계를 완료 한 후 B), 노출 경동맥은 암 세포 주입을위한 준비, 확고한면 공에 지원 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 뇌 전이의 파생물에 대한 비 침습적 모니터링. A) 수정 된 MDA-MB-231 유방암 세포는 루시퍼 라제 리포터 유전자 생체 표지 하였다. 생체 내 이미징 장치의 이미징 (스케일 바 = 50mm)을 반복하여 24 시간 후 경동맥 동맥 주입부터 뇌의 전이 현상은 비 침습적 모니터링 하였다. 생체 내 이미징 시스템 IMA의 B) 정량데이터를 카하면 동물의 사망 분석까지 뇌 전이 지수 가지 뒤에 종양 부담 후 경동맥 동맥 주입의 초기 감소를 나타냅니다. 오차 막대는 총 발광 신호의 평균 (SEM)의 표준 오차를 반영한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 수확 뇌 전이 병변. A) K1735 흑색 종 세포는 크게 주위의 기질에서 뇌 전이 병변의 분리를 용이하게하지만 특정 흑색 종 모델에 한정되는 동계 C3H 마우스 뇌에서 melanotic 뇌 전이 병변을 생산하고 있습니다. B) 형질 전환 MMTV- 노이 / PTEN -null 마우스에서 유방 종양 세포 해리는 명백한 뇌 전이 AF를 생산경동맥 주입을 통해 터 주입. 종양 / 기질 마진 혈관 전이성 병변의 존재에도 불구하고 명백한 구별하기 어렵다. C) MDA-MB-231 유방암 세포를 수술 적 절제 또는 세포 소팅 통해 뇌 전이 병소의 추출을 용이하게하기 위해 생체에 녹색 형광 단백질 (GFP) 리포터로 미리 라벨링 하였다. 전이성 병변의 대부분 경동맥 주입이 일어나는 뇌의 동일 측에 집중되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
암 세포의 성공적인 경동맥 동맥 주입을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 수술 준비 마우스의 1) 깊은 마취; 2)면 지원의 상단에 경동맥의 정상 위치; 성공적인 주사 후 경동맥의 3) 단단히 결찰.
30 분 ~ 깊은 마취는 해부 현미경으로 꾸준한 수술 성능을 위해 일반적으로 필요하다. 우리는 마우스 마취 상업적으로 즉시 사용 케타민 / 자일 라진 칵테일을 사용합니다. 마취 사용 볼륨 조정에 유연성을 제공하는 생리 식염수에 2 : 1 또는 1 : 과용 가능성을 피하기 위해 케타민 / 자일 라진 칵테일 1로 희석 될 수있다. 대안 적으로, 비 - 제어 된 약물 tribromoethanol은 마취제로서 사용될 수있다; 그러나, 우리는 저하하는 tribromoethanol의 성향이 물질이 적은 안정적인 케타민 / 자일 라진 칵테일보다 효과적인 마취로 만드는 것으로 나타났습니다.
에이꾸준히 넣고 충분히 가압 경동맥 크게 암세포의 주입을 용이하게한다; 따라서, 우리는 매우 신중하게 오히려 최적 조건에서 분사를 진행하기보다 현미경으로 동맥의 위치를 준비하는 시간을 보내는 것이 좋습니다.
더 암세포 경동맥 사출 측의 혈관 내에 접수한다. 양쪽 반구 빈사 동물에서 전이성 병변의 상당량을 부담 나타나도록 가끔 전이성 세포의 상당한 부분은 뇌의 반대쪽으로 이주 할 수있다.
전이성 병변은 실질 또는 CNS의 leptomeninges, 또는 두 위치에 하나 나타날 수 있습니다. 이러한 생물학적 표현형 (15)의 기초가 독특한 종양 미세 환경의 상호 작용이있을 나타납니다. 새로운 세포주 실험 뇌 전이를 생성하는 그의 능력에 대해 시험 할 경우에 따라서는이다 necess이러한 표현형에 특별한주의를 지불 당하고.
내부 및 외부 경동맥은 각각 뇌 실질과 leptomeninges에 혈액을 공급한다. 따라서, 실질 또는 leptomeninges로 종양 세포의 증착은이 프로토콜의 약간의 변형에 의해 달성 될 수있다. 단 leptomeninges로 세포를 허용하기 위해 경동맥은 종양 세포의 주입 전에 봉합사로 결찰 할 수 있고, 이에 따라 외부 경동맥으로 세포를 보내는 단계; 한편, 주사 전에 외부 경동맥의 결찰 만 경동맥 뇌 실질 세포 내로 진입을 허용한다.
전체적으로 intracarotid 주입 방법은 꼬리 정맥이나 심장 내 주사에 비해 높은 재현성 및 하부 변동 데이터를 생성; 또한 뇌내 직접 분사 방식에 비해 주사 유도 CNS 염증을 방지한다. 따라서,이 방식은 현재 가장 인동물의 제한된 수를 사용하여 통계적으로 유의 한 결론을 생성하기 위해 목표 뇌전 정량적 연구 가치. 동시에, 모든 실험 모델은 한계가있다. 조혈 종양 세포에 도입하는 다른 방법과 유사하게, 주입 intracarotid는 순환으로 암세포의 확산 후의 전이 캐스케이드 이후 단계 되풀이되었습니다. 따라서 공부에 대한 적절한 모델이 아닌, 예를 들면, 혈류로 기본 암세포의 확산을 결정하는 생물학적 요인.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | to make skin incisions |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | to bluntly dissect mucles |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | to separate and prepare the carotid artery for injection |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | to cut sutures |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | for wound cloure |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | for cell injection |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
References
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