Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Metodikk for studier av horisontal genoverføring i Published: March 10, 2017 doi: 10.3791/55087
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 5, 6,7, 6,7, 1
1Division of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 2Department of Basic Biomedical Science, Universidad Europea de Madrid, 3Human Biology Program, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 4Laboratory of Nosocomial Infections, Department of Bacteriology, Centro Nacional de MicrobiologÍa, Instituto de Salud Carlos III, 5Division of Microbiology, Department of Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense, 6Biology of Gram-Positive Pathogens, Department of Microbiology, Institut Pasteur, Paris, France, 7ERL3526, CNRS, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver her tre forskjellige protokoller for in vitro-undersøkelse av konjugasjon, transduksjon, og naturlig transformasjon i Staphylococcus aureus.

Abstract

Et viktig trekk ved de store opportunistisk human patogen Staphylococcus aureus er den ekstraordinære evne til raskt utvikler resistens mot antibiotika. Genomiske studier viser at S. aureus bærer mange virulens og resistens gener som ligger i mobile genetiske elementer, noe som tyder på at horisontal genoverføring (HGT) spiller en avgjørende rolle i S. aureus evolusjon. Men en fullstendig og detaljert beskrivelse av metoden som er benyttet for å studere HGT i S. aureus er fortsatt mangelfull, særlig når det gjelder naturlig transformasjon, som nylig har blitt rapportert i denne bakterien. Dette arbeid beskriver tre protokoller som er nyttige for in vitro-undersøkelse av HGT i S. aureus: konjugasjon, fag-transduksjon, og naturlig transformasjon. Til dette formål, den cfr genet (kloramfenikol / florfenikol motstand), som gir de fenikoler, linkosamider, oksazolidinoner, pleuromutilinforbindelser, og Streptogramin A (PhLOPSA) -resistance fenotype, ble anvendt. Forstå mekanismene gjennom hvilke S. aureus overfører genetisk materiale til andre stammer er avgjørende for å forstå den raske oppkjøp av motstand og bidrar til å avklare måter formidling rapportert i overvåkingsprogrammer eller til videre forutsi spredning modus i fremtiden.

Introduction

Staphylococcus aureus er en kommensal, grampositiv bakterie som lever i naturlig hud og nesehulen hos mennesker og dyr. Denne bakteriearter er den ledende årsak til sykehusinfeksjoner i sykehus og helsevesenet. Videre har evnen til å utvikle resistens mot forskjellige antimikrobielle forbindelser laget forvaltningen av infeksjoner forårsaket av denne bakterien til en global bekymring.

To hovedveier er involvert i spredningen av motstands fenotyper er kjent: klonal spredning av resistente genotyper og formidling av genetiske determinanter blant bakterie bassenget. I tilfelle av S. aureus, forskjellige antibiotiske resistensgener (så vel som virulens-determinanter) har blitt funnet å være assosiert med mobile genetiske elementer (MGEs) 1. Tilstedeværelsen av disse elementene i genomet av S. aureus viser at anskaffelse og overføring av genisk materiale innenfor den bakterielle populasjonen kan spille en viktig rolle for S. aureus tilpasning og evolusjon.

Genetisk materiale kan utveksles gjennom tre kjente mekanismer for HGT i Gram-positive bakterier: transformasjon, konjugasjon og fag transduksjon. Transformasjon innebærer opptak av fritt DNA. Å tilegne seg fremmed DNA, bakterieceller trenger for å utvikle en spesiell fysiologisk fase: den kompetanse scenen. Når dette trinn er nådd, kompetente celler er i stand til å transportere DNA inn i cytoplasma, anskaffe nye genetiske determinanter. I tilfelle av S. aureus, har eksistensen av naturlig transformasjon er nylig blitt demonstrert 2. I tråd med dette har vår gruppe belyse relevansen av uttrykk for sukk faktor (en kryptisk sekundær transkripsjon sigma faktor) i kompetanseutviklingstrinn og om hvordan dets konstituerende uttrykk gjengir S. aureus i stand til reaching kompetansen stadium, noe som gir mulighet for erverv av resistente fenotyper av naturlig transformasjon to.

Bøyning er en prosess som involverer overføring av DNA fra en levende celle (donor) til en annen (mottaker). Begge celler må være i direkte kontakt med, slik at DNA som skal byttes samtidig er beskyttet av spesielle strukturer, så som rør eller porer. Overføringen av DNA ved hjelp av denne fremgangsmåte krever at konjugativt maskineri. I S. aureus, er prototypen konjugativt plasmid PGO1, som havner på konjugerbare operon Traa tre.

Fag-transduksjon innebærer overføring av DNA fra celle til celle gjennom bakteriofag infeksjon og innebærer pakking av bakterielt DNA, i stedet for DNA fra virus og inn i fagen kapsid. Mesteparten av S. aureus isolater er lysogenized av bakteriofager 1. Ved stress forhold, kan prophages bli kuttet ut fra det bakterielle genome og skift til lytisk syklus.

Dette er de tre velkjente mekanismer for DNA-overføring i S. aureus. Det er noen flere overføringsmekanismer, for eksempel "pseudo-transformasjon" 2 og fag-lignende systemer i overføring av patogenitet øyer 4. Nylig, en gruppe rapporterte at "nanorør" er involvert i overføring av mobilnettet materiale (inkludert plasmid DNA) mellom nabocellene 5, 6, men en oppfølgingsstudie har ikke dukket opp fra andre grupper så langt.

Dette arbeidet gir nødvendig metode for å studere HGT i S. aureus ved å ta opp de tre viktigste overføringsveier: konjugeringsformål, transduksjon, og naturlig transformasjon. Resultatene oppnådd med disse metoder resultatene ble brukt for å studere overføring av CFR-genet (kloramfenikol / florfenikol motstand) blantS. aureus stammer 7. Disse tre teknikkene er allsidige verktøy for etterforskningen av MGE overføring i S. aureus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Stammene og materialer som brukes i dette arbeidet er listet i tabell 1 og tabell for material, henholdsvis. I overføringsforsøk, ble N315 og COL cfr -positive derivater benyttes som donorer av cfr genet (N315-45 og COL-45). Disse stammer ble tidligere oppnådd ved konjugasjon, idet man anvender som giver en klinisk cfr -positivt Staphylococcus epidermidis stamme (ST2), etter standard konjugasjon-protokollen (se nedenfor). Denne belastningen næret den cfr genet på en pSCFS7 lignende plasmid 7.

1. Bøyning Bruke Filter-parring Method

MERK: En S. aureus-stamme N315 bærer cfr genet (N315-45) 7 (Cm R) ble anvendt som donor. COL 8 eller 9 Mu50 stammer (Tet R, Cm S) ble anvendt som mottakere. Dobbelt-resistente kolonier (Tet R, Cm R) i stand til å vokse i nærvær av 32 mg / l kloramfenikol pluss 8 mg / l tetracyklin ble betraktet som putative transkonjuganter og ble analysert for å bestemme tilstedeværelsen av cfr ved koloni-PCR og for å bestemme mottaker følsomhet profil.

  1. Utføre konjugering etter en tidligere beskrevet protokoll 10 med noen modifikasjoner:
    1. Forbered 5 ml over natten kultur av giver og mottaker i tryptisk soyavekstmedium (TSB) medium (med og uten 32 mg / l kloramfenikol, henholdsvis), med risting ved 37 ° C.
    2. Juster den optiske tetthet (OD 600) av over natt kulturene til en (OD 600 = 1,0) ved å bruke frisk TSB-medium. Bland 0,5 ml av donor kultur (N315-45) med 0,5 ml av kulturen mottaker (COL eller Mu50). Tilsett 1 ml PBS til blandingen.
    3. Overfør blandingen av bakterier på en 0,45 um filtermembran using et vakuumpumpesystem.
    4. Sett filtermembraner på en saueblodagarplate. Inkuber ved 37 ° C i 1 dag.
      NB: I dette trinnet er anriket medium nødvendig for å tillate vekst av dobbelt-resistente celler.
    5. Ta ut filtermembranen fra platen og suspendere i 10 ml fosfat-bufret saltvann (PBS). Vortex vel å samle alle bakterier festet på membranen.
    6. Foreta en seriell 10 gangers fortynning av bakteriesuspensjonen ved hjelp av frisk TSB. Plate 100 pl av de fortynnede prøver 0-10 -4 på TSB-agar (TSA) plater supplementert med 32 mg / l kloramfenikol og 8 mg / l tetracyklin for valg av transkonjuganter. Plate 100 ul av den fortynnede suspensjonen (10 -5 -10 -6) på TSA-plater med 8 mg / l tetracyklin alene for å telle det totale antall mottakere. Inkuber platene ved 37 ° C i 18-24 timer.
    7. Analyser dobbel-resistente kolonier (antatte transkonjuganter) for tilstedeværelse av cfr genet ved koloni PCR 7 og deres mottakelighet profiler (antibiogram).
    8. Bestem antibiogram ved å måle de minimale inhiberende konsentrasjon (MIC) av egnede antibiotika i henhold til standardmetoden mikrofortynningsplater eller disk diffusjon metode 11. Mottakelighet profil av transkonjuganter må være identisk for mottakeren, med unntak av kloramfenicol (og andre forbindelser som er berørt av jf-genet). Denne bestemmelse er nødvendig for å utelukke tetracyklin resistens utviklet av donorstammen.

2. Fag Transduksjon

MERK: bakteriofag MR83a som tilhører familien Siphoviridae (laboratorie lager) ble brukt i eksperimentene transduksjon. N315-45 ble anvendt som cfr donor for fag-infeksjon. N315, COL, eller Mu50 stammer ble anvendt som mottakere. Oppkjøpet av cfr ble bestemt av ability til mottakeren belastning til å vokse i nærvær av 32 mg / l kloramfenikol. Kolonier som vokser under denne betingelse ble analysert for å bestemme tilstedeværelsen av cfr (ved koloni-PCR) og til å bestemme mottagelighetsprofil for å utelukke potensiell forurensning.

  1. Fag forsterkning på donor
    1. Fremstille en over natten kultur av N315-45 i 5 ml næringsmedium supplert med 3,6 mM Ca 2 + (NBCaCl 2) ved 37 ° C med risting (180 rpm).
      MERK: Kalsium er nødvendig for fag-infeksjon. Se Materialer Table. Nutrient buljong fra andre selskaper kan ha problemer, for eksempel kalsium nedbør.
    2. Forbered subkulturer ved fortynning av kulturen natten over 1: 1000 i et sluttvolum på 10 ml NBCaCl 2 i 50 ml glassflasker eller glassampuller. Dyrke bakteriene i 1 time ved 37 ° C med risting (180 rpm).
    3. Forbered en serie av utvannet fag MR83a i NBCaCl 2 medium (10 -2, -3 10, 10 -4, 10 -5, 10 og 6). Tilsett 20 pl av den fortynnede fagen inn i bakteriekultur. Også fremstille en kontrollkulturen uten fag-infeksjon, som tjener som positiv kontroll for bakteriell cellevekst og kan brukes til å bestemme den fag-titeret den neste dag.
    4. Vokser kulturene ved 37 ° C med forsiktig risting (100 rpm) over natten.
      MERK: Cellene vil vokse til en viss grad når den infiserende fag ikke er i overskudd; da, vil de gå inn i lyseringsfasen på grunn av fagen forsterkning gjennom den lytiske syklus. Kulturen uten fag vil vise full vekst, mens kulturer med fag vil vise forskjellige priser av åpenhet.
    5. Velge en eller to tømt kulturampuller med den høyeste fortynning av den tilsatte fagen.
    6. Overfør kulturene i 15 ml sentrifugerør. Tilsett 250 ul kloroform og blandes grundig ved å snu rørene.
    7. Sentrifuger rørene ved 5000
    8. Overfør supernatanten til nye rør og lagre dem ved 4 ° C inntil bruk.
      MERK: fagen er stabil i minst et par måneder, men lagring av fag-preparat for lenge reduserer titer og transduksjon effektivitet.
  2. Måling av fag titer (fag plakkassay)
    1. Forbered næringsbuljong agar (1,5% agar) medium; holde den varm i et vannbad ved 55 ° C. Legg Autoclaved 0,5 M CaCl 2 oppløsning til mediet til en sluttkonsentrasjon på 3,6 mM. Hell det i den 90 mm petriskåler (NBCaCl 2 plater).
    2. Forbered en overnatting kultur av N315 i 5 ml NBCaCl 2 ved 37 ° C med risting; dette kan være substituert med kontrollkulturen beskrevet ovenfor (trinn 2.1.3).
    3. Tilsett 10 mL av natten kultur til 200 ul NBCaCl 2 og jevnt fordelt det på NBCaCl 2 plate. Stoppe spredning når overflaten avplaten er dekket med væske. La platen tørke.
    4. Lag en serie 1:10 fortynning (fra 10 -5 -10 -10) av tidligere utarbeidet fag (trinn 2.1.8) bruker NBCaCl to medium.
    5. Spot 3 mL av hver fag-fortynning på platen dekket med bakterier.
    6. Platen inkuberes over natten ved 30 ° C.
    7. Telle plaque tall og beregne fag-titeret ved hjelp av følgende ligning: Plaque forming enhet (pfu) / ml = Antall plakker x fortynningsfaktor / flekket volum (3 x 10 -3 ml)
  3. fag-transduksjon
    MERK: fag-pool fremstilt i det foregående trinn (2.1.8) blir brukt til å teste transduksjon av genet inn i jf S. aureus stammer. I dette eksperimentet, stammer N315, COL, eller Mu50, blir brukt som mottakere.
    1. Forbered natten kultur av N315, COL, eller Mu50 i 5 ml NBCaCl 2 ved 37 ° C med risting (180 rpm).
    2. Fortynnet tFag han i NBCaCl 2 til 10 ~ 9 pfu / ml.
    3. I et 50 mL hetteglass, bland 500 mL av natten kultur, 500 ul friskt NBCaCl 2, og 1 ml fag-(~ 10 9 PFU / ml); den forventede multiplisitet av infeksjon (MOI) må ikke overskride 1. Inkuber blandingen ved 37 ° C med forsiktig risting (100 rpm) i 30 min.
      MERK: Termisk behandling av mottakercellene like før tilsetningen av fag (52 ° C i 2 min for å inaktivere de endogene restriksjonsenzymer) kan øke effektiviteten 12.
    4. Tilsett 50 ul av 20% Na 3 -Citrate. Fortsett forsiktig risting i 30 min ved 37 ° C.
      MERK: Na 3 -Citrate fungerer som en moderat chelator av kalsium.
    5. Forbered smeltet hjerne-hjerte infusjon (BHI) agar (1,5% agar) medium og oppbevar den i et vannbad ved 55 ° C.
    6. Overfør bakterien-fag blandingen til en 100 ml flaske, tilsett 50 ml varm BHI agar supplert med 32 mg / L chloramphenicol, og bland godt. Hell blandingen i 90 mm petriskåler.
      MERK: Denne metoden gjør det mulig å påvise et lite antall voksende kolonier (putative transduktanter).
    7. Inkuber platen ved 37 ° C i 24-48 timer.
    8. Videre teste de genererte kolonier (Transduktantene) for motstand ved å overføre kolonier på nye BHI agar plater supplert med 32 mg / l kloramfenikol. Bekrefte tilstedeværelse av cfr gen ved koloni-PCR 7.

3. Natural Transformation

MERK: Den naturlige transformasjonstest i S. aureus ble utført etter metoden beskrevet i vår tidligere studie 2. Den N315 derivat, N2-2.1 2, 7, ble benyttet som mottaker. I denne stammen ble sukk locus duplisert slik at konstitutivt uttrykte sukk to. for Fondetfeilte prosedyrene for å isolere sukk-uttrykke kompetanse varianter, kan du se en tidligere beskrivelse to. Dersom resistensmarkør som skal overføres, er ikke kloramfenikol, kan pRIT-sukk (Cm R) brukes til å uttrykke sukk, som tidligere beskrevet 2. Renset plasmid-DNA eller hel ekstrakt fra cfr -acquired S. aureus COL-45 7 blir anvendt som donor-DNA for transformasjon.

  1. Utarbeidelse av donor DNA
    1. Dyrke COL-45 over natten med risting ved 37 ° C i en 300 ml kolbe inneholdende 50 ml TSB supplert med 32 mg / l kloramfenikol. Kultur E. coli HST04 bærer pHY300 plasmid (Tet R) for å ekstrahere plasmid til kontrollforsøk.
      MERK: HST04 (dam - / DCM -) mangler DNA metylase gener 13. Andre vanlige stammer med DNA methylases kan også være brukd for å fremstille DNA-donor, fordi den DNA-metylering tilstand ikke påvirker transformasjonseffektiviteten. Alternativt kan plasmid pT181 renset fra S. aureus-stamme COL også bli brukt som en positiv kontroll for transformasjonstest 2.
    2. Samle cellene ved sentrifugering (8000 x g i 10 min ved 4 ° C).
    3. Ekstraher plasmidene ved hjelp av en plasmid-DNA-ekstraksjon kit eller en konvensjonell DNA-rensemetoden for å rense hele DNA.
    4. Kvantifisere rensede DNA ved spektrometer og holde den ved 4 ° C inntil bruk.
      MERK: Bruk en fersk DNA forberedelse til transformasjonstest, vanligvis mindre enn en uke gammel. Old DNA-preparater redusere effektiviteten av transformasjon.
  2. transformasjonstest
    1. Kultur mottakercellen (N2-2.1) over natten i 5 ml TSB ved 37 ° C med risting.
    2. Overfør 0,5 ml over natten kultur i et 1,5 ml rør. fellingstate cellene ved sentrifugering (10 000 xg i 1 minutt ved 4 ° C).
    3. Suspendere cellene med 10 ml av CS2 medium i et 50 ml rør.
      MERK: CS2 medium er en komplett syntetisk medium som induserer kompetanse for naturlig transformasjon i S. aureus 2 (se medium sammensetningen i Material tabell). Andre standard laboratoriemedier, for eksempel TSB eller BHI, er ikke egnet for transformasjon 2, 13.
    4. Dyrke bakteriene ved 37 ° C med risting (180 rpm) inntil slutten av eksponensiell fase (ca. 8 timer).
    5. Høste cellene ved sentrifugering (5000 xg i 5 min ved 4 ° C).
    6. Resuspender cellene i 10 ml friskt medium CS2.
    7. Tilsett 10 ug av renset plasmid, eller genom-DNA (trinn 3.1.4) til cellesuspensjonen. Rist ved 37 ° C og 180 rpm i 2,5 timer.
      MERK: Kortere inkubasjonstider med DNA (<2,5 t) gi lavere transformasjon frekvenser.
    8. Samle celler ved sentrifugering (5000 xg i 5 min ved 4 ° C).
    9. Resuspender cellene i 10 ml av BHI-medium. Bland cellesuspensjonen med 90 ml smeltet BHI-agar (55 ° C) supplement med 32 mg / l kloramfenikol (eller 5 mg / l tetracyklin i kontrollforsøk). Hell blandingen i 90 mm petriskåler. Raskt kjølig og la agar stivner.
    10. Platene inkuberes ved 37 ° C i 2 dager.
    11. Replikere generert kolonier (transformanter) ved å overføre koloniene (med tannpirkere) til nye BHI agarplater som inneholder de aktuelle antibiotika for å bekrefte deres motstand egenskaper. Bekreft ervervet resistens genet (jfr eller tetM) av koloni PCR 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultatene representert her har tidligere blitt publisert (tilpasset fra referanse 7 med forlagets tillatelse). Vi har studert mulige overføringsveiene for de cfr-genet, noe som fører til lavt nivå linezolid motstand og ekspresjon av PhLOPSA-motstand fenotype 14, 15 i S. aureus-stammer, ved å undersøke tre mekanismer av HGT.

Figur 1 viser resultatene oppnådd i konjugativt analyser. Konjugeringen protokollen er nyttig for inter-arter transmisjon (A), så vel som intra-arter transmisjon (B), noe som gir tilsvarende resultater ved anvendelse av samme konjugativt vektor i forskjellige konjugativt donorer. Effektiviteten av konjugering beregnes som Nº av transkonjuganter (kolonidannende enheter, eller CFU / ml) / Nº av mottakerens celler (CFU / ml). De oppnådde frekvenser varierte fra 1 x 10 -6 til 1 x 10 -5, med tilsvarende verdier ved hjelp av S. epidermidis eller S. aureus som donor.

Resultatene er oppsummert i tabell 2. cfr -acquired S. aureus var i stand til å overføre ytterligere cfr-genet med andre S. aureus-stammer ved konjugasjon så vel som av fag-transduksjon. Men resultatene tyder på mangel av naturlig transformasjon for cfr overføring, selv om det ble oppdaget for en annen motstand markør (tetM gen på pHY300 plasmid).

Figur 1
Figur 1: Representasjon av mottaker og transconjugant CFU oppnådd i konjugerbare analyser. De klare linjene representerer de totale mottaker stammer isolert etter18-24 timer av kultur i selektive medier for mottaker stammer. De fylte søylene representerer de totale dobbel-resistente stammer oppnådd etter 18-24 timer med kultur i selektive medier for transconjugant stammer. (A) Inter-arter konjugativt assay. Staphylococcus epidermidis (SE45) ble anvendt som ref donor, og Staphylococcus aureus-stamme N315 ble benyttet som mottaker. Den N315-45 transconjugant belastning næret CFR gen i en pSCFS7 lignende plasmid. Denne stamme ble anvendt som kilde for cfr i MRSA-til-MRSA overføring analyser. (B) MRSA-til-MRSA konjugerbare eksperimenter. Den tidligere oppnådde N315-45 ble anvendt som donor, og COL eller Mu50 stammer ble anvendt som mottakere. De gjennomsnittlige verdier for to uavhengige forsøk er vist med standardavvik (SD). Klikk her for å se et størreversjon av denne figuren.

Strain navn Beskrivelse Reference source
bakteriestammer
SE45 Kliniske isolatated S. epidermidis 7
N315 pre-MRSA, KMR, ErmR 9
COL MRSA, bærer tetracyklinresistens-genet på plasmid pT181 8
Mu50 MRSA, VISA 9
N315-45 derivat av N315, bærer cfr genet på en pSCFS7 lignende plasmid hentet fra S. epidermidis ved konjugering 7
COL-45 derivative av COL, bærer cfr genet på en pSCFS7 lignende plasmid hentet fra S. epidermidis ved konjugering 7
RN4220-45 derivat av RN4220, bærer cfr genet på en pSCFS7 lignende plasmid hentet fra S. epidermidis ved konjugering 7
N2-2.1 Sukk aktive cellen avledet fra N315, slik at cellen naturlig kompetanse for transformasjon 7
E. coli HST04 skader / dcm- pHY300 E. coli HST04 skader / dcm- (Takara) bærer tetracyklin resistens pHY300 plasmid 11
bakteriofager
MR83a Siphoviridae familie Laboratory lager
MR83-45 fag MR83a pakking en pSCFS7 lignende plasmid som bærer cfr gen etter infisereion inn N315-45 Denne studien

Tabell 1: Oversikt over stammene som brukes i dette arbeidet.

HTG donor Mottaker Frekvens
Bøyning N315-45 COL 1,00 x 10 -6
N315-45 MU50 1,29 x 10 -5
transduksjon N315-45 COL 1,00 x 10 -11
N315-45 MU50 3,68 x 10 -10
N315-45 N315 6,88 x 10 -10
Transformation Plasmider (COL-45) N2-2.1 ULD
Hele DNA (COL-45) N2-2.1 ULD
pHY300 (kontroll) N2-2.1 6,52 x 10 -10

Tabell 2: HTG frekvenser av cfr gen overføring erholdt i MRSA-til-MRSA eksperimenter. Konjugativt overføring ble evaluert ved bruk av N315 cfr -positivt derivat (N315-45) som donor. Frekvensen av transmisjonen i disse forsøk er uttrykt som Nº av transkonjuganter / mottakercellene. Transduksjon ble evaluert ved bruk av transduse fag MR83a, forsterket fra N315-45 belastning. Transduksjon frekvens ble beregnet som Nº av Transduktantene / pfu. transformatorsjonsanalyser ble utført ved anvendelse av renset DNA (plasmid eller hel cellulært DNA) som donorer. Transformasjonen frekvens ble beregnet som antall transformanter / mottakercellene. ULD: Under grensen deteksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette arbeidet beskriver de tre viktigste metodene for å studere HGT av genetiske determinanter i S. aureus. Selv transduksjon og konjugasjon har blitt studert i flere tiår, ble eksistensen av naturlig transformasjon bare nylig anerkjent to. Dermed er S. aureus utstyrt med alle de tre store moduser av HGT, og teste dem alle er nødvendig for å avklare mulige spredningsveier av genetiske determinanter. Målet med dette arbeidet er å lage komplette protokoller og å gi praktisk informasjon om de metoder som brukes i en tidligere publisert arbeid 7. Selv om konjugering og overføringsprotokoller er tilgjengelig, er dette den første papirbane hvor en detaljert transformasjonsprotokollen er beskrevet.

Konjugering ved å bruke filterparingsfremgangsmåten er en enkel teknikk og kan anvendes i studiet av konjugativt overføring i forskjellige bakteriearter= "xref"> 7, 10. Ved å bruke standardiserte inokula, teller mottaker etter 18-24 timers nå en verdi på 10 ~ 9 CFU / ml. Transconjugant teller er variabel, og verdiene viser sterk påkjenning-til-stamme avhengighet, men typisk et transconjugant område fra februar 10-mai 10 ble oppnådd når konjugering resultatene var positive. Ved hjelp av protokollen gitt her, deteksjonsgrensen oppnådde var <10 transkonjuganter / ml. Denne grensen kan optimaliseres ved å konsentrere filteret suspensjon.

Den naturlige transformasjon protokollen beskrevet her ble etablert i S. aureus N315-avledede stammer. Bruken av CS2 medium er kritisk for transformasjon, ettersom transformasjonen ikke påvises i andre standard laboratoriemedier, for eksempel TSB og BHI-13.

Bruken av langsiktige lagret plasmider (f.eks pT181 og pHY300) som donor resulterte i ca en 10- til 50-gangers redusert frekvens (data ikke vist), noe som tyder på at DNA-kvalitet kan påvirke transformasjon frekvens. Det er kjent at bretter plasmider er ikke egnet for naturlig transformasjon i B. subtilis 16.

DNA oppnådd fra både S. aureus og E. coli kan anvendes som donor i naturlige transformasjon analyser, hvilket antyder at en begrensning barriere ikke hemmer den naturlige transformasjon. Vi observerte også den samme transformasjonen frekvens mellom DNA fremstilt fra E. coli HST04 (dam - / DCM -) mangler den DNA-metylase gener og fra JM109, støtter ideen om at metyleringen status ikke påvirker transformasjonsfrekvensen.

Det skal bemerkes at transformasjonen frekvens detekteres ved hjelp av denne protokollen var lav (~ 10 -9 -10 -10), og de transform stammene er begrenset til N315 derivaterclass = "xref"> 2. Det er sannsynlig at transformasjonseffektiviteten i S. aureus-stamme kan være spesifikk, som er også blitt rapportert i andre bakterier som kan omvandles 15, 16, 17. Videre studier er i gang for å bedre transformasjon effektivitet; dette vil bli beskrevet andre steder.

Fag-transduksjon synes å være den mest utbredte HGT mekanisme i S. aureus, fordi de fleste S. aureus isolater er lysogenized av bakteriofager 18. Infeksjonen evne til transduserende fag, avhenger av verten følsomhet og må kontrolleres ved plakk-analyse. En annen begrensning av fag transduksjon er størrelsen av DNA. Liten DNA kan effektivt overføres, men DNA-fragmenter større enn 45 kb kan ikke pakkes i stafylokokk-fagen hodet 19. Imidlertid har en ny gigantisk stafylokokk fag nylig been isolert fra omgivelsene, og itcould tenkes kunne overføre større DNA-fragmenter 20.

Plakkanalysemetoden som er beskrevet i dette arbeidet er enklere enn den konvensjonelle protokollen, hvor topp-agar anvendes. Imidlertid krever den foreliggende fremgangsmåte at bakteriecellene er jevnt fordelt for å detektere ørsmå plaques som genereres på overflaten. For å oppnå den helt enda spredning, anbefaler vi å spre nok volum av bakteriesuspensjonen på agaroverflaten, stopper når væsken jevnt dekker agaroverflaten. Deretter tørkes platene i luftstrømmen i en ren benk. Hvis det er nødvendig for å unngå den lysogenization av den transduserende fag, er en lav infeksjonsmultiplisitet anbefalt (MOI bør ikke overstige 1). Lysogenized celler kan være preget av deres redusert følsomhet overfor fag i plakk analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)  Becton Dickinson  211825
Brain Heart Infusion (BHI) Becton Dickinson  211059
Nutrient Broth No. 2 Oxoid CM0067
Sheep blood agar Eiken Chemical Co.,Ltd. E-MR96 Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. 
Agar powder Wako Pure Chemical Industries 010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) Wako Pure Chemical Industries 191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter Merck Milipore HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit QIAGEN 12243

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
  2. Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
  3. Caryl, J. A., O'Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
  4. Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
  5. Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
  6. Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
  7. Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
  8. Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
  9. Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
  10. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
  11. Clinical Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , CLSI. Wayne, PA, USA. (2006).
  12. Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
  13. Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
  14. Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
  15. Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
  16. Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
  17. Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
  18. McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
  19. Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
  20. Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).

Tags

Immunologi , Horisontal genoverføring konjugasjon transduksjon transformasjon antibiotikaresistens.
Metodikk for studier av horisontal genoverføring i<em&gt; Staphylococcus aureus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cafini, F., Thi Le Thuy, N.,… More

Cafini, F., Thi Le Thuy, N., Román, F., Prieto, J., Dubrac, S., Msadek, T., Morikawa, K. Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55087, doi:10.3791/55087 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter